Preparação de nanopartículas de PLGA contendo carboplatina e sua funcionalização com folato de quitosana

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

DANIEL DE MORAES PROFIRIO

PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PLGA CONTENDO CARBOPLATINA E SUA FUNCIONALIZAÇÃO COM FOLATO DE QUITOSANA

CAMPINAS 2018

PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE PLGA CONTENDO CARBOPLATINA E SUA FUNCIONALIZAÇÃO COM FOLATO DE QUITOSANA

ORIENTADOR: PROF. DR. FRANCISCO BENEDITO TEIXEIRA PESSINE

O ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO DANIEL DE MORAES PROFIRIO, E ORIENTADO PELO PROF. DR. FRANCISCO BENEDITO TEIXEIRA PESSINE.

CAMPINAS 2018

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutor em Ciências.

A meus pais, Mônica e Paulo, e avós, Marlene e José Luiz (in memoriam).

Um agradecimento especial aos meus pais, Paulo e Mônica, que sempre acreditaram em mim, no meu potencial e deram todo o suporte e apoio necessário para que eu nunca desistisse nos momentos difíceis. Agradeço também a meu irmão, Fernando, que torce por mim e me incentiva.

Agradeço profundamente a todos os parentes pelos encontros familiares sempre muito animados e divertidos. É impossível citar todos, pois são igualmente importantes. Todos vocês têm o meu respeito e minha admiração, em especial meus queridos avós, Marlene e José Luiz (in memoriam).

Aos meus amigos do laboratório e do Instituto de Química, pelas agradáveis conversas, discussões e todos os momentos de descontração que passamos juntos durante meu Doutorado: Letícia, Daniela, Francieli, Mônica, Gabriela, Luciana, ao casal Irlene e Thiaguinho, Helen, Milene, Marcos Alberto, Raphael Enoque, Bruno Morandi e ao casal Ana Thereza e Thiago Duarte.

Ao meu orientador, Prof. Francisco Pessine, que acreditou no meu trabalho e me aceitou em seu grupo de pesquisa. Agradeço pela sensibilidade e disposição de sempre me ajudar e de ter me passado um pouco da sua experiência nesta área de carregamento de fármacos.

Agradeço a todos os funcionários e técnicos de laboratório do Instituto de Química da UNICAMP pela disposição e eficiência, assim como aos professores que fizeram parte de toda minha vida acadêmica.

O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Brasil (CNPq) – Código de Financiamento 140462/2014-7.

Carboplatina é um fármaco análogo da cisplatina, não-específico, que modifica a estrutura do DNA e inibe sua replicação, causando morte celular. Apesar do potencial efeito antineoplásico, a carboplatina provoca efeitos adversos como mielossupressão, trombocitopenia e a baixa captação celular pelas células de câncer contribui para sua baixa eficiência terapêutica. Este trabalho teve como objetivo a encapsulação da carboplatina utilizando nanopartículas de PLGA como sistema carreador, e TPGS como surfactante. Nanopartículas de PLGA recobertas com folato de quitosana (QTS-FOL) também foram preparadas, sendo utilizado planejamento experimental para a otimização de ambos os sistemas de nanopartículas. Para as partículas não-modificadas, os resultados mostraram que o diâmetro médio e o PDI são dependentes do tempo, amplitude de sonicação e volume da fase aquosa, enquanto o potencial Zeta é constante. A formulação otimizada foi estável por um período de 60 dias quando armazenada a 10ºC em água deionizada, e a diálise apresentou melhores resultados como método de purificação. Para as partículas funcionalizadas, o diâmetro médio, PDI e potencial Zeta foram dependentes do tempo de agitação e da concentração da solução de folato de quitosana. As melhores condições para liofilização das partículas, sem mudanças nos valores de diâmetro médio e PDI, foram obtidas com 96 h e 30% m/V de trealose. Ambas as formulações apresentaram boa estabilidade em tampão PBS pH 7,4. A partir da técnica de fluorescência, o ensaio com o corante SYBR Green I sugeriu que a carboplatina pode ter mantido sua capacidade de se ligar ao DNA após a encapsulação. Difusão e intumescimento são fenômenos envolvidos no processo de liberação da carboplatina a partir das nanopartículas de PLGA.

Carboplatin is a cisplatin analogue and non-specific drug that modifies DNA structure and inhibits its replication, causing cell death. Despite the potential antineoplasic effect, carboplatin causes adverse effects as myelosuppression, thrombocytopenia and its lower cellular uptake by cancer cells contributes to its low therapeutic efficacy. The goal of this work was encapsulation of carboplatin using PLGA nanoparticles as carrier system, and TPGS as surfactant. Folic acid-conjugated chitosan-coated (FA-CS) PLGA nanoparticles were also prepared, using experimental design for optimization of both unmodified and surface modified nanoparticles. For PLGA nanoparticles, the results showed that mean particle size and PDI are dependents of time, amplitude of sonication and volume of aqueous solution, while Zeta potential is constant. The optimized formulation was stable over a period of 60 days when stored at 10ºC in deionized water, and dialysis showed better results as purification method. For surface modified nanoparticles, mean particle size, PDI and Zeta potential were dependent of stirring time and concentration of FA-CS solution. The best conditions for lyophilization of the particles, with no changes in mean particle size and PDI values, were obtained with 96 h and 30% w/V of trehalose. Both formulations showed good stability in PBS pH 7.4. By using fluorescence, the assay with SYBR Green I dye suggested that carboplatin could have maintained its capacity to bind DNA after encapsulation. Diffusion and swelling are involved phenomena in the release process of carboplatin from PLGA nanoparticles.

Figura 1. Fórmula estrutural dos fármacos de Pt(II) de uso clínico mundial: cisplatina, carboplatina e oxaliplatina ... 21 Figura 2. Etapas do mecanismo de ação para a cisplatina: (i) captação celular, (ii) substituição dos cloretos por água, (iii) ligação com o DNA, (iv) morte celular. Adaptado de Johnstone [14]... 21 Figura 3. Compostos de platina que chegaram à fase de testes clínicos: (a) picoplatina, (b) BBR3464, (c) tetraplatina, (d) iproplatina, (e) satraplatina ... 22 Figura 4. Perfis da concentração plasmática de fármaco em função do tempo. Adaptado de Campos [19] ... 23 Figura 5. (A) Representação do mecanismo passivo, ou efeito EPR, e do mecanismo ativo. (B) Exemplos de nanocarreadores, ligantes de superfície e agentes terapêuticos para tratamento de câncer. Adaptado de Vieira [22] ... 24 Figura 6. Representação esquemática da estrutura de nanopartículas poliméricas: nanocápsula e nanoesfera. Adaptado de Kumari [29] ... 27 Figura 7. Fórmula estrutural do PLGA. Os índices x e y representam os monômeros do ácido lático e do ácido glicólico, respectivamente ... 28 Figura 8. Fórmula estrutural do TPGS ... 29 Figura 9. Biodistribuição de nanopartículas no corpo em função do diâmetro médio. Adaptado de Blanco [63] ... 32 Figura 10. Fórmula estrutural do ácido fólico mostrando seus componentes: anel pterina, PABA e ácido glutâmico. Adaptado de McCarron [71] ... 34 Figura 11. Esquema do processo de endocitose de carreadores funcionalizados com folato. (A) Internalização, (B) formação do endossomo, (C) acidificação, (D) liberação do carreador, (E) fusão com a membrana. Adaptado de Luiz [62] ... 35 Figura 12. Fórmula estrutural da quitosana ... 36 Figura 13. Representação esquemática das etapas envolvidas em um planejamento de experimentos ... 38 Figura 14. Representação esquemática da preparação das nanopartículas de PLGA pelo método da nanoprecipitação ... 49 Figura 15. Esquema utilizado para os experimentos do perfil de liberação da carboplatina encapsulada ... 55

Figura 17. Representação esquemática da reação entre ácido fólico e quitosana ... 62 Figura 18. Estrutura molecular do ácido fólico com as atribuições dos carbonos ... 62 Figura 19. Espectros de RMN de 13C no estado sólido da quitosana (preto), do ácido fólico (vermelho) e do folato de quitosana (azul) ... 63 Figura 20. Espectros de absorção no UV-Vis do ácido fólico (em solução de Na2CO3

0,001 mol L-1), da quitosana e do folato de quitosana (ambos em solução de ácido acético 1% V/V) ... 64 Figura 21. Representação esquemática da reação entre carboplatina e orto-fenilenodiamina em DMF... 65 Figura 22. Espectros no UV-Vis das soluções de carboplatina, o-phen, carboplatina + o-phen (1), NPs + o-phen, NPs/carbo + o-phen (2), QTS-FOL + o-phen e NPs/QTS-FOL/carboplatina + o-phen (3) em DMF ... 66 Figura 23. Representação das nanopartículas obtidas neste projeto, constituídas por PLGA, carboplatina e TPGS. Adaptado de Vijayakumar [121] ... 68 Figura 24. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o tamanho das partículas (fatores: tempo e amplitude) ... 70 Figura 25. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o PDI (fatores: tempo e amplitude)... 71 Figura 26. Superfície de resposta para o tamanho de partículas em função do tempo e da amplitude ... 72 Figura 27. Superfície de resposta para o PDI em função do tempo e amplitude ... 73 Figura 28. Curvas de nível para a desejabilidade global (D) em função do tempo e da amplitude ... 74 Figura 29. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o tamanho das partículas (fatores: volume e concentração de TPGS) ... 77 Figura 30. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o PDI (fatores: volume e concentração de TPGS) ... 77 Figura 31. Superfície de resposta para o tamanho de partículas em função do volume e da concentração de TPGS ... 80 Figura 32. Superfície de resposta para o PDI em função do volume e da concentração de TPGS ... 80

Figura 34. Avaliação do tamanho de partículas (A), PDI (B) e potencial Zeta (C) em função do tempo, em água deionizada (n = 2) ... 85 Figura 35. Representação das nanopartículas após a funcionalização com folato de quitosana. Adaptado de Ma [134] ... 87 Figura 36. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o tamanho das partículas (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL) ... 89 Figura 37. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o PDI (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL) ... 90 Figura 38. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o potencial Zeta (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL) ... 90 Figura 39. Superfície de resposta para o potencial Zeta em função do tempo de agitação e da concentração de QTS-FOL ... 92 Figura 40. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o tamanho das partículas (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL, modelo quadrático) ... 95 Figura 41. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o PDI (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL, modelo quadrático) ... 95 Figura 42. Superfície de resposta para o tamanho de partículas em função do tempo de agitação e da concentração de QTS-FOL ... 97 Figura 43. Superfície de resposta para o PDI em função do tempo de agitação e da concentração de QTS-FOL ... 97 Figura 44. Curvas de nível para a desejabilidade global (D) em função do tempo de agitação e da concentração de QTS-FOL ... 99 Figura 45. Representação esquemática do processo de liofilização de nanopartículas na presença de um crioprotetor. Adaptado de Cheow [145] ... 100 Figura 46. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o tamanho das partículas (fatores: tempo de liofilização e concentração de trealose) ... 103 Figura 47. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o PDI (fatores: tempo de liofilização e concentração de trealose) ... 104 Figura 48. Superfície de resposta para o tamanho de partículas em função do tempo de liofilização e da concentração de trealose ... 106 Figura 49. Superfície de resposta para o PDI em função do tempo de liofilização e da concentração de trealose ... 106

concentrações. Adaptado de Szilagyi [155] ... 109 Figura 51. Avaliação do tamanho (A), PDI (B) e potencial Zeta (C) das nanopartículas (NPs e NPs/QTS-FOL) em função do tempo, em tampão fosfato salino com pH 7,4 (n = 2) ... 111 Figura 52. Estrutura do aduto formado entre o fragmento [Pt(NH3)2]2+ e 2 guaninas

adjacentes do DNA. Adaptado de Todd [159] ... 112 Figura 53. Esquema da reação entre carboplatina e água, formando a espécie cis-[Pt(NH3)2(H2O)2]2+, que se liga ao DNA. Adaptado de Dabrowiak [10] ... 113

Figura 54. Reações para a carboplatina em tampão carbonato 0,0238 mol L-1 com pH 8,4. Adaptado de Dabrowiak [10] ... 114 Figura 55. Esquema do modelo proposto para a intercalação do SYBR Green (SG) entre os pares de base do DNA. Adaptado de Dragan [165] ... 115 Figura 56. Intensidades de emissão a 520 nm do SYBR Green, em função do volume adicionado, após incubação do DNA com diferentes quantidades de carboplatina encapsulada (n = 2) ... 116 Figura 57. Perfil de liberação da carboplatina a partir das nanopartículas de PLGA durante 8 h, em tampão fosfato salino pH 7,4 (n = 2) ... 117

Tabela 1. Exemplos de sistemas carreadores aprovados para uso clínico ... 25 Tabela 2. Carreadores de fármacos de platina na etapa de testes clínicos ... 26 Tabela 3. Mecanismos de liberação de fármacos em função da geometria da matriz e do valor do expoente n ... 44 Tabela 4. Fatores e níveis utilizados no estudo de otimização do tempo (x1) e da

amplitude de sonicação (x2) ... 49

Tabela 5. Fatores e níveis utilizados no estudo de otimização do volume (x1) e da

concentração de TPGS (x2) ... 50

Tabela 6. Fatores e níveis utilizados no estudo de otimização do tempo de agitação (x1) e da concentração de folato de quitosana (x2) ... 51

Tabela 7. Fatores e níveis utilizados no estudo de otimização do tempo de liofilização (x1) e da concentração de trealose (x2) ... 51

Tabela 8. Deslocamento químico () dos átomos de carbono do ácido fólico ... 64 Tabela 9. Pontos experimentais e as respostas observadas (tamanho, PDI e potencial Zeta) em função dos fatores (tempo e amplitude) ... 68 Tabela 10. Valores dos coeficientes, desvios-padrão e t de Student para tamanho de partículas e PDI (fatores: tempo e amplitude) ... 70 Tabela 11. Resultados da análise de variância e valores do teste F para tamanho de partículas e PDI (fatores: tempo e amplitude) ... 72 Tabela 12. Valores mínimo, médio, máximo e de desejabilidade para as respostas (fatores: tempo e amplitude)... 74 Tabela 13. Pontos experimentais e as respostas observadas (tamanho, PDI e potencial Zeta) em função dos fatores (volume e concentração de TPGS) ... 75 Tabela 14. Valores dos coeficientes, desvios-padrão e t de Student para tamanho de partículas e PDI (fatores: volume e concentração de TPGS) ... 76 Tabela 15. Resultados da análise de variância e valores do teste F para tamanho de partículas e PDI (fatores: volume e concentração de TPGS) ... 79 Tabela 16. Valores mínimo, médio, máximo e de desejabilidade para as respostas (fatores: volume e concentração de TPGS) ... 81 Tabela 17. Resultados obtidos no estudo do método de purificação ... 82 Tabela 18. Resultados obtidos no estudo da redução do tempo de evaporação da acetona e da diálise ... 86

Tabela 20. Valores dos coeficientes, desvios-padrão e t de Student para tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL) ... 89 Tabela 21. Resultados da análise de variância e valores do teste F para tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL) ... 91 Tabela 22. Pontos experimentais e as respostas observadas em função dos fatores (tempo e concentração de QTS-FOL) para o planejamento aumentado ... 93 Tabela 23. Valores dos coeficientes, desvios-padrão e t de Student para tamanho de partículas e PDI (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL) ... 94 Tabela 24. Resultados da análise de variância e valores do teste F para tamanho de partículas e PDI (fatores: tempo e concentração de QTS-FOL, modelo quadrático) 96 Tabela 25. Valores mínimo, médio, máximo e de desejabilidade para as respostas (fatores: tempo de agitação e concentração de QTS-FOL) ... 98 Tabela 26. Pontos experimentais e as respostas observadas em função dos fatores (tempo de liofilização e concentração de trealose) ... 101 Tabela 27. Valores dos coeficientes, desvios-padrão e t de Student para tamanho de partículas e PDI (fatores: tempo de liofilização e concentração de trealose) ... 103 Tabela 28. Resultados da análise de variância e valores do teste F para tamanho de partículas e PDI (fatores: tempo de liofilização e concentração de trealose) ... 105 Tabela 29. Novos pontos experimentais e as respostas observadas em função do tempo de liofilização e da concentração de trealose ... 107 Tabela 30. Valores de tamanho, PDI e potencial Zeta das partículas funcionalizadas com QTS-FOL antes e após a liofilização ... 108 Tabela 31. Ajuste dos modelos matemáticos da liberação de carboplatina a partir de nanopartículas de PLGA ... 118

: Deslocamento químico Φ: Diâmetro médio

ζ: Potencial Zeta C: Carregamento

CBDCA: Ligante ciclobutano-dicarboxilato

CP/MAS: “Cross polarization magic angle spinning” CT-DNA: “Calf thymus deoxyribonucleic acid” DACH: 1,2-diaminocicloexano

DMF: N,N-dimetilformamida

EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato EE: Eficiência de encapsulação

EMA: “European Medicine Agency” FDA: “Food and Drug Administration” GL: Graus de liberdade

HPMA: Hidroxi-propil-metacrilamida

ICP-OES: Espectrometria de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado MQ: Média quadrática

NPs: Nanopartículas

o-phen: orto-fenilenodiamina

PDI: Índice de polidispersidade (“polidispersity index”) PLGA: Ácido poli(lático-co-glicólico)

PVA: Álcool polivinílico

QTS-FOL: Folato de quitosana R: Rendimento

RMN: Ressonância magnética nuclear RPM: Rotações por minuto

SQ: Soma quadrática

1. INTRODUÇÃO ... 19

1.1 Informações sobre o câncer ... 19

1.2 Fármacos de Pt(II) para o tratamento de câncer ... 20

1.3 Sistemas carreadores de fármacos ... 23

1.4 Nanopartículas poliméricas ... 26

1.5 Vias de administração de carreadores ... 31

1.6 Modificação das propriedades de superfície ... 32

1.6.1 Ácido fólico ... 33

1.6.2 Quitosana ... 36

1.7 Planejamento de experimentos ... 37

1.8 Modelagem matemática do perfil de liberação ... 39

1.8.1 Liberação por difusão ... 40

1.8.2 Cinética de ordem zero ... 41

1.8.3 Cinética de primeira ordem ... 42

1.8.4 Modelo de Higuchi ... 42 1.8.5 Modelo de Korsmeyer-Peppas ... 43 1.8.6 Modelo de Baker-Londsdale ... 44 2. OBJETIVOS ... 45 2.1 Geral ... 45 2.2 Específicos ... 45 3. PARTE EXPERIMENTAL ... 46 3.1 Reagentes e equipamentos ... 46

3.2 Purificação da quitosana e do CT-DNA ... 47

3.3 Síntese do folato de quitosana ... 47

3.4 Evidência da conjugação do ácido fólico à quitosana ... 48

3.5 Preparação das nanopartículas de PLGA... 48

3.6 Planejamento Experimental ... 49

3.6.1 Influência do tempo e da amplitude de sonicação sobre tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta ... 49

3.6.2 Influência do volume e da concentração de TPGS sobre tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta ... 50

3.6.4 Influência do tempo de liofilização e da concentração de trealose sobre

tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta... 51

3.7 Investigação do método de purificação das nanopartículas ... 51

3.8 Ensaio de estabilidade em água deionizada ... 52

3.9 Caracterização das nanopartículas ... 52

3.9.1 Evidência da encapsulação de carboplatina ... 52

3.9.2 Obtenção do diâmetro médio das partículas, índice de polidispersidade e potencial Zeta ... 53

3.9.3 Determinação do percentual de carregamento, rendimento e eficiência de encapsulação ... 53

3.10 Ensaio de estabilidade em tampão fosfato salino pH 7,4 ... 54

3.11 Espectroscopia de fluorescência ... 54

3.12 Perfil de liberação da carboplatina ... 55

3.13 Tratamento estatístico dos dados obtidos a partir de planejamento experimental ... 56

3.13.1 Determinação dos fatores significativos... 56

3.13.2 Análise da variância (ANOVA) ... 57

3.13.3 Função de desejabilidade ... 58

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 60

4.1 Caracterização da quitosana ... 60

4.2 Caracterização do folato de quitosana ... 61

4.2.1 Síntese do folato de quitosana... 61

4.2.2 Ressonância magnética nuclear de 13C ... 62

4.2.3 Espectroscopia de absorção no UV-Vis ... 63

4.3 Evidência da encapsulação de carboplatina ... 65

4.4 Influência do tempo e da amplitude de sonicação sobre tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta ... 67

4.4.1 Determinação dos fatores significativos ... 67

4.4.2 Análise de variância ... 71

4.4.3 Função de desejabilidade ... 73

4.5 Influência do volume e da concentração de TPGS sobre tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta ... 75

4.5.3 Função de desejabilidade ... 79

4.6 Investigação do método de purificação das nanopartículas ... 82

4.7 Ensaio de estabilidade em água deionizada ... 83

4.8 Influência do tempo de agitação e da concentração de folato de quitosana sobre tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta ... 86

4.8.1 Determinação dos fatores significativos – Modelo linear ... 88

4.8.2 Análise de variância – Modelo linear ... 91

4.8.3 Determinação dos fatores significativos – Modelo quadrático ... 93

4.8.4 Análise de variância – Modelo quadrático ... 96

4.8.5 Função de desejabilidade ... 98

4.9 Influência do tempo de liofilização e da concentração de trealose sobre tamanho de partículas, PDI e potencial Zeta ... 99

4.9.1 Determinação dos fatores significativos ... 102

4.9.2 Análise de variância ... 105

4.9.3 Ensaio com maiores valores de tempo de liofilização e concentração de trealose ... 107

4.10 Ensaio de estabilidade em tampão fosfato salino pH 7,4 ... 108

4.11 Espectroscopia de fluorescência ... 112

4.12 Perfil de liberação da carboplatina ... 116

5. CONCLUSÕES ... 120

6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 122

7. REFERÊNCIAS ... 123

1. INTRODUÇÃO

1.1 Informações sobre o câncer

O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade por ter se tornado um estigma de mortalidade e dor. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), o termo câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo [1].

Estima-se que, em 2008, 36 milhões dos óbitos no mundo (63%) ocorreram em consequência de doenças e agravos não-transmissíveis (DANT), com destaque para as doenças cardiovasculares (48% das DANT) e o câncer (21%). Este impacto afeta principalmente os países de baixo e médio desenvolvimento, especialmente por mortes prematuras. As transições demográficas e epidemiológicas globais evidenciam um impacto cada vez maior da carga de câncer nas próximas décadas [1,2].

A estimativa mundial mostra que, 2012, ocorreram 14,1 milhões de novos casos de câncer com um total de 8,2 milhões de óbitos. De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde (OMS), para ambos os casos espera-se uma tendência de aumento, atingindo cerca de 21,4 milhões de novos casos com 13,2 milhões de óbitos no ano de 2030. O aumento no número de mortes está associado ao aumento na expectativa de vida da população, sedentarismo e poluição devido à crescente urbanização [1,3].

Em relação ao Brasil, estima-se para o biênio 2018-2019 a ocorrência de 600 mil novos casos de câncer, para cada ano. Excetuando-se o câncer de pele não-melanoma (cerca de 170 mil casos novos), ocorrerão 420 mil casos novos de câncer. Estas estimativas refletem o perfil de um país que possui os cânceres de próstata, pulmão, mama feminina, cólon e reto entre os mais incidentes, reforçando a magnitude do problema do câncer no país [1].

Atualmente, o tratamento convencional do câncer engloba uma série de intervenções, sendo que a cirurgia, radioterapia, quimioterapia e imunoterapia são os principais métodos utilizados globalmente. Estes tratamentos têm como objetivo a cura da doença ou o prolongamento do tempo de vida juntamente com melhora na qualidade de vida do paciente [3,4].

Uma grande variedade de agentes quimioterápicos para o tratamento de câncer se encontra disponível para uso clínico nos dias de hoje. Contudo, considerando a terapia convencional estes fármacos atuam de maneira não-específica, afetando tanto células tumorais quanto células saudáveis e, com isso, levando ao surgimento de efeitos adversos [5]. Além disso, a eficiência terapêutica geralmente é baixa já que estes fármacos possuem um curto tempo de meia-vida in

vivo e baixa solubilidade em meios aquosos, como o sangue. Desta forma, um

tratamento efetivo demanda a administração de doses elevadas, o que leva a efeitos adversos e desenvolvimento de resistência [5,6]. Para superar estes problemas, diversas estratégias vêm sendo desenvolvidas para promover a liberação de fármacos de maneira mais eficiente e segura por meio de sistemas carreadores.

1.2 Fármacos de Pt(II) para o tratamento de câncer

Há mais de 50 anos Rosenberg e colaboradores, enquanto estudavam o efeito do campo elétrico em bactérias, fizeram a descoberta de que os produtos da eletrólise do eletrodo de platina conseguiam inibir o crescimento bacteriano. Destes produtos o mais potente foi a cisplatina, descrita primeiramente por Peyrone em 1845. Eles também descobriram que este composto consegue inibir o crescimento de células tumorais em modelos de sarcoma e leucemia em ratos [7,8]. Estes estudos foram seguidos por Higby e colaboradores que realizaram os testes clínicos da cisplatina e relataram resposta deste composto em tumores testiculares [9].

A cisplatina, ou cis-[PtCl2(NH3)2] (Figura 1), entrou para a fase I dos

ensaios clínicos em 1971 e em 1978 recebeu aprovação do FDA para o tratamento dos cânceres testicular e de ovário. Atualmente, a cisplatina ainda é utilizada no tratamento de diversos tipos de câncer, incluindo os de pulmão, ovário, testículo, mama, próstata, cabeça e pescoço, podendo ser usada sozinha ou em combinação com outros fármacos anticâncer. Contudo, o tratamento com cisplatina leva ao surgimento de efeitos adversos como nefro- e neurotoxicidade [10,11].

Com isso, de forma a reduzir a toxicidade da cisplatina, novos compostos à base de Pt(II) foram desenvolvidos, levando ao surgimento de um fármaco de segunda geração (a carboplatina, aprovada em 1989) e um de terceira geração (a oxaliplatina, aprovada em 2002) para uso clínico global [12]. Na Figura 1 é possível observar a semelhança estrutural destes fármacos com a cisplatina: na carboplatina,

os ligantes cloreto foram substituídos pelo ligante bidentado ciclobutano-dicarboxilato; na oxaliplatina, ambos os ligantes (NH3 e cloreto) foram substituídos

por ligantes bidentados: o 1,2-diamino-cicloexano e o oxalato, respectivamente.

Figura 1. Fórmula estrutural dos fármacos de Pt(II) de uso clínico mundial: cisplatina, carboplatina e oxaliplatina

O mecanismo de ação destes compostos é semelhante: ao entrar na célula, ocorre substituição do ligante aniônico por moléculas de água enquanto os ligantes amina permanecem coordenados. Este produto é um potente eletrófilo que pode reagir com qualquer nucleófilo, incluindo os átomos de nitrogênio das bases nucleicas presentes no DNA. O aduto mais abundante Pt-DNA é do tipo intrafita, no qual a platina encontra-se coordenada ao nitrogênio N7 de 2 guaninas adjacentes, o que causa distorção conformacional do DNA e inibe sua replicação, levando à morte celular. A Figura 2 ilustra este mecanismo no caso da cisplatina [13,14].

Figura 2. Etapas do mecanismo de ação para a cisplatina: (i) captação celular, (ii) substituição dos cloretos por água, (iii) ligação com o DNA, (iv) morte celular.

Contudo, a toxicidade associada com a terapia destes compostos vem trazendo séria preocupação na clinica médica. Após décadas de pesquisas, a busca por novos compostos de platina menos tóxicos e por métodos de liberação, que reduziriam/eliminariam a toxicidade associada e aumentariam a eficácia terapêutica, ainda continua [15]. A maior parte dos pacientes tratados com fármacos de platina, com exceção dos pacientes com câncer testicular, apresenta somente uma resposta positiva parcial, com numerosas toxicidades sistêmicas, impossibilitando, assim, a administração de elevadas doses. Alguns dos efeitos tóxicos são comuns na maioria dos fármacos de platina, enquanto outros são únicos e específicos [8].

Um problema importante que também envolve os fármacos de platina é o desenvolvimento de resistência. Estudos tem associado o desenvolvimento da resistência a alterações no transporte do fármaco para o interior da célula, o sistema glutationa, mecanismos de reparo do DNA e inativação de genes apoptóticos [8,16]. Obstáculos adicionais incluem baixas biodisponibilidade e solubilidade em água, sendo necessárias infusões prolongadas do fármaco no paciente e limitando sua qualidade de vida. Num grande esforço para superar estas limitações, novos compostos de platina e de outros metais foram descobertos e testados como agentes antineoplásicos; contudo, a grande maioria ainda não foi aprovada para uso clínico [16,17]. A Figura 3 ilustra alguns destes compostos de platina que conseguiram chegar à etapa dos testes clínicos.

Figura 3. Compostos de platina que chegaram à fase de testes clínicos: (a) picoplatina, (b) BBR3464, (c) tetraplatina, (d) iproplatina, (e) satraplatina

Com isso surgiram estratégias para contornar estes problemas inerentes aos compostos de platina: o desenvolvimento de sistemas carreadores. A liberação de fármacos baseada em carreadores é uma área de pesquisa intensa já que estes sistemas permitem aumento da solubilidade e do tempo de meia-vida in vivo, diminuição de efeitos adversos, direcionamento específico para células tumorais, liberação sustentada do fármaco e minimização dos mecanismos de resistência [16,18].

1.3 Sistemas carreadores de fármacos

Entende-se por liberação o processo em que um princípio ativo presente em uma forma farmacêutica torna-se disponível para absorção pelo organismo. Com isso, um sistema ou dispositivo de liberação de fármaco corresponde a um termo que define a forma ou o mecanismo pelo qual o princípio ativo é disponibilizado no organismo, após sua administração [19].

Os sistemas de liberação de fármacos são divididos em tradicionais e modificados. Nos sistemas tradicionais, a concentração do fármaco atinge um pico logo após a administração e então declina. Os níveis são dependentes das doses administradas e cada fármaco possui uma faixa de ação terapêutica acima da qual ele é tóxico e abaixo da qual é ineficaz. Na liberação modificada, busca-se o desenvolvimento de um sistema que mantenha a concentração plasmática do fármaco dentro da faixa terapêutica, conforme mostrado na Figura 4 [19,20].

Figura 4. Perfis da concentração plasmática de fármaco em função do tempo. Adaptado de Campos [19]

Inicialmente, o desenvolvimento de sistemas para a liberação modificada de fármacos incidiu no desenvolvimento de microcápsulas com tamanhos compreendidos entre 5 a 2000 m, na década de 60. Posteriormente a microencapsulação serviu de modelo para o desenvolvimento de sistemas em escala nanométrica, com objetivo de transportar fármacos assim como direcioná-los para órgãos ou tecidos específicos, sendo esta uma vantagem em relação às formulações convencionais [21].

Uma vez que estes fármacos encontram-se encapsulados em sistemas nanoparticulados, estes podem chegar ao local de ação de forma passiva ou ativa (Figura 5A). A entrega passiva explora as características de crescimento do tumor: quando o tumor atinge um volume aproximado de 2 mm3 o suprimento de nutrientes e oxigênio fica comprometido, o que causa aumento da vascularização em um processo conhecido como angiogênese. Contudo, a vascularização é incompleta e resulta em vasos que permitem a permeabilidade de partículas com diâmetro de 100 a 2000 nm. Além disso, uma drenagem linfática ineficiente aumenta o tempo de retenção das partículas no tecido tumoral. A combinação desta maior permeabilidade e baixa drenagem linfática é descrita como efeito de permeabilidade e retenção aumentada: “Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect” [5,22].

Figura 5. (A) Representação do mecanismo passivo, ou efeito EPR, e do mecanismo ativo. (B) Exemplos de nanocarreadores, ligantes de superfície e agentes

terapêuticos para tratamento de câncer. Adaptado de Vieira [22] A

Além disso, de forma a melhorar o direcionamento do fármaco para o local de ação desejado, a superfície das nanopartículas pode ser alterada de modo a direcionar o carreador especificamente para células neoplásicas, com um mecanismo de ação baseado nas moléculas expressas na superfície celular do tumor (geralmente super-expressas em comparação com células normais), resultando em direcionamento ativo destas partículas (Figura 5A). Moléculas como anticorpos, peptídeos e aptâmeros de RNA, dentre outras, são utilizadas para este fim, conforme observado na Figura 5B [5,22,23].

Atualmente, há um grande número de sistemas carreadores que são utilizados para o tratamento de diversos tipos de câncer. Dentre eles destaca-se a formulação lipossomal de doxorrubicina, a Doxil®, que foi um dos primeiros medicamentos baseados em nanotecnologia aprovados pelo FDA. Outro exemplo de produto no mercado é o Abraxane®, no qual o fármaco paclitaxel encontra-se eficientemente associado à nanopartículas de albumina. Esta formulação foi aprovada pelo FDA, em 2005, para tratamento de câncer de mama e para câncer de pâncreas, em 2013. Outros exemplos destes sistemas carreadores que estão comercialmente disponíveis são mostrados na Tabela 1 [22,24].

Tabela 1. Exemplos de sistemas carreadores aprovados para uso clínico Nome

comercial Sistema Tipo de câncer

Aprovação clínica Doxil® Doxorrubicina lipossomal Ovário, mama metastático 1995 DaunoXome® Daunorrubicina lipossomal Sarcoma de Kaposi, ovário metastático 1996 Eligard® Acetato de

leuprorrelina e PLGA Próstata 2002

Abraxane® Paclitaxel ligado à

albumina Mama metastático 2005

Oncaspar® L-asparaginase

peguilada

Leucemia

Em relação aos fármacos de platina, uma grande variedade de carreadores, incluindo sistemas orgânicos (nanopartículas poliméricas, micelas poliméricas, conjugados poliméricos, dendrímeros, lipossomas) e inorgânicos (nanopartículas magnéticas de Fe3O4, nanopartículas de ouro, nanopartículas de

sílica mesoporosa) foi desenvolvida com o objetivo de melhorar suas eficiências terapêuticas. Alguns destes sistemas apresentaram resultados promissores, porém somente um baixo número de carreadores orgânicos conseguiu avançar para a fase dos testes clínicos, conforme observado na Tabela 2 [8,25,26].

Tabela 2. Carreadores de fármacos de platina na etapa de testes clínicos

Nome Sistema Tipo de câncer Teste

clínico

Lipoplatin® Cisplatina lipossomal Pulmão, mama

metastático, estômago Fase III

Aroplatin® Análogo da oxaliplatina lipossomal

Colorretal avançado,

mesotelioma pleural Fase II ProLindac® Conjugado (dach)Pt-HPMA* Ovário avançado Fase II

Nanoplatin® Cisplatina em micela polimérica

Pulmão, pâncreas

avançado Fase II

Lipoxal® Oxaliplatina lipossomal Colorretal avançado Fase I * dach = 1,2-diaminocicloexano, HPMA = hidroxi-propil-metacrilamida

Dentre os diversos de sistemas carreadores descritos na literatura (Figura 5B), as nanopartículas poliméricas são um sistema de liberação versátil e potencialmente capaz de atravessar barreiras fisiológicas. Além disso, por causa da disponibilidade de diferentes materiais poliméricos, é possível modular suas propriedades físico-químicas de forma a otimizar seu comportamento in vivo [27,28]. Com isso, para esta tese elas foram escolhidas como sistema carreador.

1.4 Nanopartículas poliméricas

Nanopartículas poliméricas são partículas coloidais que apresentam diâmetro médio na faixa de 10-1000 nm. Este termo pode se referir a 2 tipos de

estruturas: nanoesferas e nanocápsulas, que diferem entre si conforme sua composição e organização estrutural. As nanoesferas podem ser descritas como uma matriz polimérica onde o fármaco encontra-se disperso em seu interior ou adsorvido na superfície. Já as nanocápsulas atuam como um sistema reservatório, ou seja, são formadas por um invólucro polimérico que recobre um núcleo aquoso ou oleoso, sendo que o fármaco pode estar dissolvido neste núcleo ou adsorvido à parede polimérica. A Figura 6 ilustra estes 2 tipos de sistemas [29,30].

Figura 6. Representação esquemática da estrutura de nanopartículas poliméricas: nanocápsula e nanoesfera. Adaptado de Kumari [29]

Para o preparo de nanopartículas poliméricas podem ser utilizados polímeros não-biodegradáveis ou biodegradáveis. A biodegradação é um processo no qual a macromolécula é convertida em produtos mais simples, seja pela ação de enzimas ou hidrólise das cadeias poliméricas em meio aquoso. Neste ponto, os polímeros biodegradáveis são mais vantajosos já que são totalmente absorvidos pelo organismo, não necessitando de remoção posterior [19,30].

Uma grande variedade de polímeros biodegradáveis de origem natural ou sintética vem sendo estudada para o desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de fármacos. Dentre os polímeros naturais destacam-se alginato, quitosana, ácido hialurônico e gelatina [31,32]. Já para os polímeros sintéticos os mais comumente utilizados são os polianidridos, poli(orto-ésteres), poli(ciano-acrilatos), poli(aminoácidos) e poliésteres, como por exemplo poli(caprolactona), os ácidos poli(lático) (PLA), poli(glicólico) (PGA) e os copolímeros destes 2 últimos: o ácido poli(lático-co-glicólico), também conhecido como PLGA [30,33].

A principal característica estrutural do PLGA é a ligação éster presente entre os monômeros do ácido lático e glicólico, conforme ilustrado na Figura 7. Quimicamente são possíveis polímeros PLGA com diferentes proporções dos 2 monômeros. No corpo humano, o PLGA é hidrolisado em seus monômeros que são posteriormente metabolizados durante o ciclo de Krebs, apresentando efeitos tóxicos mínimos [34].

Figura 7. Fórmula estrutural do PLGA. Os índices x e y representam os monômeros do ácido lático e do ácido glicólico, respectivamente

Atualmente, o PLGA possui aprovação das agências reguladoras americana (FDA) e europeia (EMA) para aplicações biomédicas, o que diminui o tempo necessário para o uso clínico [35,36]. Este polímero tem despertado um grande interesse dos pesquisadores para a utilização em sistemas carreadores de fármacos por causa de suas propriedades favoráveis, tais como biocompatibilidade, segurança, não-imunogenicidade, não-toxicidade e possibilidade de liberação sustentada. Na literatura, o PLGA tem sido empregado para encapsular uma variedade de fármacos, tanto de natureza hidrofílica (cisplatina [37], epirubicina [38]) quanto hidrofóbica (paclitaxel [39], tetrahidrocanabinol [40], curcumina [41]).

De maneira geral, as técnicas de preparação de nanopartículas poliméricas são classificadas em 2 tipos: polimerização de monômeros e utilização de polímeros pré-formados. Considerando as limitações dos métodos de polimerização, como a formação de resíduos tóxicos de difícil purificação, as técnicas envolvendo polímeros pré-formados são as mais utilizadas no desenvolvimento de sistemas carreadores de fármacos, sendo que as mais comuns são emulsificação-evaporação do solvente, emulsificação-difusão do solvente e nanoprecipitação [42].

É prática comum descrita na literatura a utilização de solventes clorados, como diclorometano e clorofórmio, para solubilização do polímero. A escolha destes solventes está relacionada com sua baixa solubilidade em água, alta volatilidade e capacidade de dissolução de grande número de fármacos [43]. Porém, estes solventes possuem elevada toxicidade, são de difícil remoção das formulações, seu descarte inadequado pode provocar danos ambientais e há sérias restrições ao uso destes solventes em formulações de medicamentos. Desta forma, neste trabalho optou-se pela substituição destes solventes por acetona, que é uma alternativa mais segura para aplicações farmacêuticas [19,44].

Independentemente do método de preparo empregado, as nanopartículas são obtidas como suspensões coloidais aquosas. Durante o tempo de armazenamento e dependendo dos componentes do sistema podem ocorrer problemas de estabilidade, como agregação das partículas no meio. Com isso, os surfactantes são compostos amplamente utilizados em estudos de estabilização de emulsões e partículas [19,45].

Um dos surfactantes mais utilizados para encapsulação de metalo-fármacos é o álcool polivinílico, ou PVA [46]. Contudo, por não ser biodegradável a presença de quantidades residuais de PVA não é desejável para aplicações farmacêuticas devido a uma potencial toxicidade sistêmica. Assim, partículas produzidas com PVA devem ser lavadas diversas vezes, o que diminui a eficiência de encapsulação e o rendimento do processo [47,48]. Desta forma, neste trabalho foi utilizado o TPGS (D--tocoferil polietilenoglicol succinato) como surfactante alternativo ao PVA, sendo que sua estrutura é mostrada na Figura 8.

O TPGS é um derivado da vitamina E, solúvel tanto em meio aquoso quanto em solventes orgânicos por causa de sua estrutura anfifílica, que consiste de uma parte alquil lipofílica e uma cauda hidrofílica que estão unidas pelo grupo succinato, sendo, portanto, um surfactante de caráter não-iônico [49]. É empregado como emulsificante, solubilizador e supressor da resistência a fármacos de células cancerígenas, por meio da inibição da atividade da P-glicoproteína (P-gp), uma proteína presente na membrana celular que funciona como uma bomba de efluxo de diversos compostos xenobióticos (como fármacos). Desta forma, há um aumento da citotoxicidade e biodisponibilidade do fármaco [49,50].

O TPGS possui aprovação pelo FDA e pode ser utilizado como adjuvante seguro em produtos farmacêuticos. Além disso, apresenta boa estabilidade na faixa de pH 4,5-7,5 sendo que somente em meio muito ácido (pH abaixo de 1) ou básico (pH acima de 10) ocorre hidrólise da ligação éster entre a parte D--tocoferol e o succinato [49,51].

Diversos trabalhos vêm empregando TPGS como surfactante, obtendo-se bons resultados como, por exemplo, diminuição no tamanho de partículas, menor polidispersidade e maior eficiência de encapsulação do fármaco [52,53]. Além disso, pode haver um efeito sinérgico com o fármaco antineoplásico já que existem evidências de que o TPGS sozinho é capaz de induzir apoptose [54].

Para a encapsulação em nanopartículas poliméricas, é importante que o fármaco escolhido seja solúvel em um solvente orgânico (neste caso ele é dissolvido juntamente com o polímero na fase orgânica) ou em água, sendo que para este caso é utilizada a técnica da dupla emulsão (A1/O/A2): primeiramente, a solução aquosa

contendo o fármaco é dispersa na fase orgânica (que contém o polímero) e em seguida esta emulsão inicial (A1/O) é dispersa em uma segunda fase aquosa [55].

Em relação aos fármacos de platina(II), estes apresentam baixa solubilidade em solventes orgânicos. Já em água a solubilidade é maior, conforme destacado: cisplatina (2,5 mg mL-1) < oxaliplatina (5 mg mL-1) < carboplatina (18 mg mL-1) [10]. Com isso, quanto maior a solubilidade, maior a quantidade de fármaco que pode ser encapsulada. Na literatura, a maior parte dos trabalhos utiliza cisplatina como modelo nos estudos de encapsulação em sistemas carreadores [56– 58]. Diante do exposto, neste trabalho optou-se pela encapsulação da carboplatina em nanopartículas de PLGA.

1.5 Vias de administração de carreadores

O efeito de fármacos veiculados em diferentes formas farmacêuticas pode ser bastante variado. Com isso, durante o desenvolvimento de um sistema de liberação é importante considerar, entre outros fatores (patologia, órgão/tecido afetado, características do fármaco), a via de administração ao organismo que será utilizada para a aplicação destes carreadores [59]. Estas vias são escolhidas para que o fármaco seja capaz de atravessar as barreiras apresentadas pelo corpo, sendo que as mais comuns são a enteral (oral), a parenteral (subcutânea, intramuscular, intravenosa), através de membranas mucosas (por exemplo, a sublingual, ocular, pulmonar, nasal) e a transdérmica [20].

No caso de sistemas carreadores também é importante que a rota escolhida permita um acúmulo máximo do fármaco na região alvo [60]. Neste trabalho foi escolhida a via intravenosa para aplicação das nanopartículas de PLGA já que esta é a mesma via utilizada na clínica médica para a administração da carboplatina. Desta forma, existem algumas considerações que devem ser levadas em conta em relação ao tamanho de partículas, índice de polidispersão e potencial Zeta do sistema carreador que será desenvolvido.

Primeiramente, é aconselhável que o diâmetro médio das partículas se encontre na faixa de 50 nm a 1000 nm. Com isso, elas podem ser administradas por via intravenosa já que não apresentam risco de embolia, pois nesta faixa de tamanho as partículas não são capazes de obstruir os vasos e capilares sanguíneos [61,62].

O tamanho também exerce influência na biodistribuição e eliminação destas partículas do corpo, conforme ilustrado na Figura 9: (i) partículas com tamanho inferior a 10 nm são removidas pelos rins; (ii) partículas maiores que 200 nm são eliminadas pelo fígado e baço, sendo que a partir de 2000 nm ocorre acúmulo nos pulmões. Já partículas com tamanho entre 10 e 200 nm, além de apresentarem tempo de circulação ótimo no corpo, podem acumular passivamente no interior da massa tumoral e permanecer por mais tempo no sítio de ação graças ao efeito EPR [10,63].

Em relação ao índice de polidispersão, recomenda-se que para administração intravenosa as partículas devem apresentar uma estreita distribuição de tamanho: geralmente, partículas com valor de PDI inferior a 0,30 são

consideradas monodispersas e podem ser, portanto, aplicadas por esta via [64,65]. Já a magnitude do potencial Zeta, um parâmetro que reflete o potencial elétrico relacionado às cargas nas imediações da superfície das partículas, serve como indicativo da estabilidade de um sistema coloidal: um valor, em módulo, superior a 25 mV indica que as forças repulsivas superam as forças atrativas entre as partículas e, desta forma, o sistema mantém-se estável [61].

Figura 9. Biodistribuição de nanopartículas no corpo em função do diâmetro médio. Adaptado de Blanco [63]

1.6 Modificação das propriedades de superfície

Por meio da administração intravenosa, os sistemas carreadores coloidais são capazes de deixar a corrente sanguínea em órgãos que possuem capilares endoteliais porosos, como fígado, baço, medula óssea e em órgãos/tecidos afetados por processos patológicos (inflamação e tumores), que são acompanhados por maior permeabilidade dos vasos. A capacidade de circulação no sangue durante longos períodos de tempo é um requisito importante para os sistemas coloidais já que o Sistema Retículo Endotelial (RES, do inglês Reticulo Endothelial System), representado principalmente pelas células de Kupffer do fígado e macrófagos do baço, é o responsável por remover estes sistemas presentes no plasma [28,66].

As causas principais do efeito de opsonização, ou eliminação das nanopartículas pelo RES, são as características relativas à carga da superfície, hidrofobicidade e o tamanho das partículas. Para prolongar o tempo de circulação evitando o reconhecimento pelo RES, pode ser realizada modificação da superfície das partículas por meio de adsorção física ou conjugação de polímeros hidrofílicos como polietilenoglicol, poloxâmeros, polissacarídeos, poloxaminas, polisorbatos, TPGS, entre outros [4]. As cadeias destes polímeros formam uma camada hidrofílica de proteção na superfície das partículas: a presença desta cobertura hidrofílica promove estabilização estérea que repele as proteínas plasmáticas, impedindo o fenômeno de opsonização [4,67].

Além da modificação com polímeros hidrofílicos para aumentar o tempo de circulação das nanopartículas, mecanismos de direcionamento ativo destes carreadores também vem sendo avaliados com o objetivo de torná-los mais seletivos, promovendo entrega específica às células tumorais e acúmulo do fármaco no local de ação [68]. O acoplamento de ligantes com baixa e alta massa molar, como anticorpos, ácido fólico, proteínas, aptâmeros, carboidratos pode aumentar a exposição dos fármacos às células tumorais por causa da super-expressão de proteínas específicas relacionadas ao aumento do suporte nutricional e da proliferação celular [69,70].

1.6.1 Ácido fólico

O ácido fólico é um membro da família das vitaminas do complexo B (vitamina B9), que apresenta fórmula molecular C19H19N7O6 (441 g mol-1). Sua

estrutura molecular pode ser dividida em 3 componentes: o anel pterina está ligado por um grupo metileno no carbono 6 ao ácido para-aminobenzoico (PABA), que por sua vez se encontra ligado por uma ligação amida ao ácido glutâmico [71], conforme observado na Figura 10.

O ácido fólico é um componente essencial para a síntese de pirimidinas e purinas, moléculas que compõem o DNA. Quando comparado a outros ligantes direcionadores, o folato apresenta baixo custo, natureza não-imunogênica, pode ser facilmente conjugado a carreadores, é estável durante armazenagem e em condições fisiológicas e possui elevada especificidade aos receptores de folato presentes na membrana celular [23,62].

Figura 10. Fórmula estrutural do ácido fólico mostrando seus componentes: anel pterina, PABA e ácido glutâmico. Adaptado de McCarron [71]

O transporte de folato para o interior das células é mediado por 2 tipos de receptores: o transportador de folato reduzido (RFC) e o receptor de folato (FR). O RFC é seletivo em facilitar o transporte de apenas formas reduzidas do ácido fólico. Já os FR são glicoproteínas de membrana que promovem a entrada de folato para o interior das células por meio do processo de endocitose, o que favorece a captação celular dos carreadores conjugados com folato [72]. Após endocitose, à medida que o pH endossomal se aproxima de 5 o folato se dissocia do seu receptor e o carreador é liberado para o citoplasma. Por fim, os receptores livres são novamente reciclados para a superfície celular, conforme ilustrado na Figura 11 [62,71].

Dentre os FR existentes, o receptor de folato alfa (FR-α) é altamente expresso na superfície de diversas células de câncer epitelial, tais como mama, ovário, próstata, cólon e pulmão. Este fato está relacionado à maior demanda de folato pelas células malignas, que estão em constante processo de divisão celular. De acordo com alguns estudos estes receptores podem ser encontrados cerca de 100 a 300 vezes mais expressos em células tumorais com relação a células saudáveis [73,74].

Pesquisas recentes que utilizam a funcionalização de nanocarreadores com folato têm demonstrado que seu acoplamento proporciona aumento da captação celular e redução da citotoxicidade das formulações em células sadias. He e colaboradores desenvolveram nanopartículas de PLGA-PEG funcionalizadas com folato para liberação conjunta de cisplatina e paclitaxel visando o tratamento de

câncer de pulmão. A formulação funcionalizada com folato apresentou maior atividade antitumoral in vitro em relação aos fármacos livres e ao carreador não-funcionalizado, com valores de taxa de crescimento em torno de 60% (fármacos livres), 30% (partículas sem folato) e 10% (partículas funcionalizadas) para a linhagem celular M109 [75]. Chen e colaboradores demonstraram o potencial de nanopartículas de PLGA-PEG funcionalizadas com folato para tratamento de câncer: os resultados indicaram maior captação celular do fármaco (doxorrubicina) por células HeLa quando este se encontrava carregado nas partículas funcionalizadas [76].

Figura 11. Esquema do processo de endocitose de carreadores funcionalizados com folato. (A) Internalização, (B) formação do endossomo, (C) acidificação, (D) liberação

do carreador, (E) fusão com a membrana. Adaptado de Luiz [62]

Neste trabalho, a funcionalização das nanopartículas de PLGA com folato foi realizada a partir da obtenção de folato de quitosana (QTS-FOL), que foi sintetizado utilizando-se uma reação de acoplamento entre o ácido fólico e a quitosana, um polímero de origem natural.

1.6.2 Quitosana

A quitosana é um copolímero constituído por unidades N-acetil-D-glicosamina e D-N-acetil-D-glicosamina em proporções variáveis. Ela é obtida a partir da desacetilação alcalina da quitina, apresentando predominantemente unidades D-glicosamina. A quitina é o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza depois da celulose, sendo o principal componente do exoesqueleto de crustáceos e insetos [77]. A Figura 12 contém a estrutura da quitosana.

Figura 12. Fórmula estrutural da quitosana

Este biopolímero é caracterizado como uma base fraca, sendo insolúvel em água e solventes orgânicos, porém solúvel em soluções ácidas diluídas com pH inferior a 6,5 já que ocorre protonação dos grupos R–NH2 das unidades glicosamina

para formar a espécie carregada (R-NH3+). No entanto, em soluções neutras,

alcalinas ou que contenham poliânions a quitosana precipita [27].

Devido a suas características de mucoadesividade, biocompatibilidade, biodegradabilidade e baixa toxicidade, a quitosana tem sido estudada para diversos usos principalmente em aplicações farmacêuticas e biomédicas. Ela também vem sendo utilizada como sistema polimérico para liberação modificada de fármacos de diferentes classes terapêuticas, como antibióticos, anti-inflamatórios, proteínas e antitumorais [31,78].

Além disso, muitos trabalhos na literatura se baseiam na adsorção da quitosana à superfície de nanopartículas. As principais vantagens desta abordagem podem incluir: (i) diminuição do efeito “burst” na liberação do fármaco por causa da formação de uma camada protetora, (ii) aumento da estabilidade de proteínas e

macromoléculas, (iii) fácil funcionalização da superfície de partículas carregadas negativamente (como o PLGA) por meio de interações eletrostáticas, (iv) possibilidade de conjugação de ligantes direcionadores devido à presença dos grupos R–NH2 [79]. O ácido fólico pode ser covalentemente ligado à quitosana

através da reação entre os grupos carboxilato do ácido fólico e os grupos R–NH2

presentes na quitosana, ocorrendo formação de uma ligação amida [78,80].

Babu e colaboradores descreveram a preparação de nanopartículas de PLGA contendo paclitaxel, que foram modificadas com um conjugado formado por quitosana e um peptídeo direcionador (RGD) para tratamento de câncer de pulmão. Os resultados mostraram que as partículas funcionalizadas com o peptídeo apresentaram maior captação celular em comparação com as partículas não-modificadas, nas 4 linhagens celulares testadas. Os autores também verificaram a possibilidade da encapsulação de cisplatina, em substituição ao paclitaxel. Uma menor viabilidade celular foi obtida para as partículas funcionalizadas (30%) em relação às não-modificadas (50%), após 48 h, para a linhagem H1975. Contudo, na linhagem de células normais (MRC-9) não foi observada diferença significativa na viabilidade celular (cerca de 90%) entre os 2 tipos de partículas [81].

Dhas e colaboradores relataram a preparação de nanopartículas de PLGA funcionalizadas com folato de quitosana para liberação de bicalutamida em câncer de próstata. Os resultados mostraram liberação mais lenta do fármaco a partir das partículas recobertas com folato de quitosana, com 20% do fármaco sendo liberado em 70 h (em comparação com 50 h para as partículas sem recobrimento). Além disso, um maior efeito citotóxico foi observado para as partículas contendo folato, já que o valor de viabilidade celular encontrado (44%) foi menor em relação ao das partículas sem folato (56%) para uma concentração de 80 μg mL-1

[82].

1.7 Planejamento de experimentos

Em qualquer área de pesquisa é interessante conhecer quais são as variáveis (ou fatores) que afetam o sistema em estudo, assim como a extensão desta influência, com o objetivo de melhorar o processo de maneira geral. Basicamente, uma abordagem conhecida como Planejamento de Experimentos consiste em estabelecer e conduzir o menor número de experimentos necessários para extrair o máximo de informação dos dados coletados, de modo a avaliar ou

otimizar um produto ou processo. Para isto, todos os fatores possivelmente relevantes são alterados simultaneamente em um conjunto de experimentos pré-determinados e os resultados são utilizados para a construção de modelos matemáticos que descrevem o comportamento do sistema dentro do domínio experimental investigado [83,84], conforme esquematizado na Figura 13. Além disso, tratamentos estatísticos permitem descrever os modelos construídos e o quanto são confiáveis para representar o sistema em estudo, de acordo com a

Análise de Variância, também conhecida como ANOVA [85].

Figura 13. Representação esquemática das etapas envolvidas em um planejamento de experimentos

O planejamento de experimentos vem sendo adotado na área farmacêutica, principalmente para a preparação de sistemas carreadores de fármacos, já que com a realização de poucos experimentos é possível verificar os efeitos das inúmeras variáveis para otimizar os parâmetros de produção da formulação [86].

Sánchez-López e colaboradores investigaram a influência de 3 parâmetros (pH, concentração de fármaco e porcentagem de PVA) na preparação de nanopartículas de PLGA-PEG para encapsulação de dexibuprofeno por meio de um planejamento composto central, sendo que as respostas investigadas foram tamanho de partículas, PDI, potencial Zeta e eficiência de encapsulação. Os resultados mostraram que, com exceção do tamanho que se manteve constante, as demais respostas foram dependentes somente do pH da fase aquosa, enquanto que a concentração de fármaco e a porcentagem de PVA não foram significativos [87].

Khan e colaboradores avaliaram por meio de um planejamento Box-Behnken a influência de 4 fatores (concentração de PVA, massa de PLGA, concentração de quitosana e tempo de sonicação) sobre 4 variáveis dependentes (tamanho de partículas, PDI, carregamento e eficiência de encapsulação) durante o preparo de nanopartículas de PLGA recobertas com quitosana para encapsulação de forscolina, um fármaco antiglaucoma. Os resultados mostraram que todos os parâmetros, incluindo termos de interação e quadráticos, influenciaram todas as variáveis dependentes, demonstrando a importância do planejamento para a otimização das condições de preparação das partículas [88].

Com o objetivo de obter as condições mais apropriadas para a obtenção de nanopartículas de PLGA contendo carboplatina, além das melhores condições para a funcionalização destas partículas com folato de quitosana e para a liofilização das mesmas, neste trabalho foi utilizado planejamento experimental.

1.8 Modelagem matemática do perfil de liberação

A modelagem matemática do perfil de liberação de fármacos é uma etapa importante já que é possível predizer de que forma o fármaco será liberado a partir da estrutura que o contém. Além disso, estes modelos permitem elucidar o comportamento do material e fornecer mecanismos de previsão da cinética de liberação [89].

De maneira geral, o processo de difusão é o principal mecanismo responsável por mover o fármaco do interior da matriz carreadora para o meio de liberação. Contudo, este nem sempre é o único fenômeno envolvido na liberação de fármacos. Além da difusão e dissolução do fármaco, destacam-se o intumescimento, erosão e degradação da matriz carreadora [90].

No caso de sistemas nanocarreadores a liberação do fármaco pode ser afetada pelo tamanho de partículas, uma vez que partículas menores possuem maior área superficial e, com isso, a maior parte do fármaco estará mais próxima da superfície da partícula, ocorrendo uma liberação mais rápida. Outros fatores que podem influenciar são: porosidade dos carreadores, tipo de ligação química presente na matriz e sua velocidade de hidrólise, efeito do pH do meio na cinética de degradação e a presença de algum tipo de recobrimento nas partículas [47,91].

1.8.1 Liberação por difusão

Moléculas confinadas em uma matriz carreadora estão em equilíbrio térmico, possuem a mesma energia cinética e, aos poucos, difundem pela matriz até alcançarem o meio exterior.

A quantidade de moléculas que atravessa a fronteira de uma matriz durante certo tempo é dada pelo seu fluxo. A medida deste fluxo permite que, estatisticamente, seja previsto o número de moléculas que, em média, serão liberadas do carreador durante certo tempo. Este fluxo de moléculas pode ser representado pela relação entre o gradiente de concentração entre os 2 lados da membrana, de acordo com a 1ª Lei de Fick (equação 1) na qual Ji é o fluxo das

espécies i, Di é o coeficiente de difusão das espécies e

é o gradiente de concentração através da membrana [89].

Equação 1

O gradiente de concentração da molécula entre o lado externo e interno do carreador causa diferença de potencial químico, responsável pela difusão, fazendo com que as moléculas das regiões mais concentradas migrem para as menos concentradas, espontaneamente [31].

Os modelos que consideram que o carreador está em estado estacionário, ou seja, a concentração das espécies não se altera com o tempo, baseiam-se na 1ª Lei de Fick e, portanto, a liberação ocorre por difusão. Já os modelos que consideram que o carreador está no estado transiente, isto é, a concentração das espécies também varia com o tempo, baseiam-se na 2ª Lei de

Fick (equação 2) na qual o termo

é a variação da concentração da espécie i em função do tempo [92].

Considerando que as matrizes carreadoras podem ser diferentes devido à constituição, geometria, dimensão e a maneira como transportam o fármaco (reservatórios ou matriciais), estas também serão diferentes quanto aos mecanismos de liberação. Com isso, modelos diferentes são necessários para representá-los [89,92]. Em geral, para que um modelo seja adequado à representação do mecanismo de difusão pressupõe-se que a taxa de liberação do fármaco e o coeficiente de difusão são constantes, o meio de liberação se encontra em condições “sink” (que garante a dissolução completa do fármaco) e a matriz não intumesce, não sofre erosão e nem degradação com o tempo [31,90].

1.8.2 Cinética de ordem zero

Quando a concentração inicial do fármaco dentro do carreador é superior a sua solubilidade, em determinado momento o fármaco encontra-se em parte dissolvido e em parte sólido. Com isso, quando as moléculas do fármaco são liberadas do carreador por difusão, estas são repostas pela dissolução de mais moléculas do fármaco sólido, de modo que a concentração do fármaco no interior do carreador não diminui, mantendo o gradiente de concentração constante [92].

Este modelo apresenta um perfil de liberação linear conforme representado pela equação 3, na qual Mt é a quantidade de fármaco liberada no

tempo t, M0 é a quantidade inicial de fármaco na solução e k0 é a constante de

liberação de ordem zero.

De acordo com Peppas e Narasimhan, o modelo de ordem zero é apropriado somente na condição de estado estacionário e em condições “sink”, ou seja, o fármaco deve ser completamente liberado para o meio externo. Os sistemas que seguem este perfil liberam a mesma quantidade de fármaco por unidade de tempo e são considerados os sistemas ideais para a liberação prolongada de ativos [89,93].

1.8.3 Cinética de primeira ordem

No caso de um carreador no qual a concentração do fármaco está abaixo da sua solubilidade, as moléculas do fármaco liberadas não são repostas, fazendo com que sua concentração no interior do carreador diminua continuamente com o tempo. Se não houver intumescimento ou erosão do carreador e a condição “sink” for mantida, o fármaco é liberado com uma taxa de liberação que diminui com o tempo. O modelo matemático utilizado para descrever a cinética de primeira ordem é representado pela equação 4, onde Mt é a quantidade de fármaco liberada no tempo t, M0 é a quantidade inicial de fármaco na solução e k1 é a constante de liberação de

primeira ordem [89].

Contudo, é importante ressaltar que, na prática, há dificuldades que superam a previsão destes modelos tais como a possibilidade de erosão, degradação e intumescimento da matriz carreadora, que ocorram simultaneamente ou não. Com isso, são necessários outros modelos para descrever os processos de liberação em carreadores mais complexos [31,90].

1.8.4 Modelo de Higuchi

O pioneiro da modelagem matemática de liberação de fármacos foi o professor Takeru Higuchi. Em 1961, ele publicou sua famosa equação que serviu como base para a maior parte dos modelos que surgiram posteriormente. A equação que descreve seu modelo permite uma descrição simples para a liberação de fármacos solúveis e pouco solúveis em água, que estão uniformemente dispersos em uma matriz sólida ou semissólida [19,94].

Tendo em vista que este modelo considera que a concentração inicial do fármaco no carreador deve ser muito maior que sua solubilidade, ele é adequado para situações na qual o carreador esteja em estado estacionário ou pseudo-estacionário, de forma que a primeira Lei de Fick pode ser aplicada [89].