Influência do volume e da concentração de TPGS sobre tamanho de

Após a otimização do tempo e da amplitude de sonicação, um novo planejamento 22 com ponto central foi realizado e no qual foram avaliados mais 2 fatores: o volume da fase aquosa (x1) e a concentração de TPGS (x2). Estes fatores

foram investigados já que alguns trabalhos relatam que em concentrações mais elevadas de TPGS (> 0,01% m/V) é possível a obtenção de partículas com menores tamanhos e com baixos valores de PDI [54,100,126]. Em relação ao volume, devido ao fato da carboplatina ser hidrofílica, um aumento no volume da fase aquosa pode levar a uma maior difusão do fármaco para esta fase, diminuindo a eficiência de encapsulação e o carregamento [33]. Os resultados obtidos estão na Tabela 13.

Tabela 13. Pontos experimentais e as respostas observadas (tamanho, PDI e potencial Zeta) em função dos fatores (volume e concentração de TPGS)

Amostra Volume (mL) TPGS (% m/V) Tamanho (nm) PDI Potencial Zeta (mV) 1 4,0 0,1 213,3 0,319 -41,9 2 205,7 0,310 -34,4 3 4,0 0,5 193,8 0,266 -30,2 4 315,7 0,428 -38,0 5 12 0,1 122,9 0,156 -44,3 6 119,8 0,138 -37,7 7 12 0,5 121,9 0,113 -42,5 8 118,0 0,098 -33,0 9 8,0 0,3 159,2 0,175 -38,6 10 141,4 0,143 -35,6 11 149,4 0,229 -41,2

De forma a ilustrar o perfil obtido pelo equipamento, o gráfico de distribuição do tamanho de partículas (Figura A4), correspondente a 1 medida, para a amostra 7 da Tabela 13 é mostrado no Anexo.

4.5.1 Determinação dos fatores significativos

A partir dos resultados da Tabela 13 foi possível observar que houve diminuição significativa tanto do tamanho de partículas quanto do PDI com o aumento do volume da fase aquosa, nos 2 níveis da concentração de TPGS: na concentração = 0,1% m/V, o tamanho e o PDI reduziram de 213,3/205,7 nm e 0,319/0,310 (amostras 1/2) para 122,9/119,8 nm e 0,156/0,138 (amostras 5/6); na concentração = 0,5% m/V, o tamanho e o PDI reduziram de 193,8/315,7 nm e 0,266/0,428 (amostras 3/4) para 121,9/118,0 nm e 0,113/0,098 (amostras 7/8). A concentração de TPGS não provocou alterações significativas nas 3 respostas, sendo que o potencial Zeta apresentou valores similares em todos os níveis estudados e, portanto, não foi dependente dos fatores. Esta análise mostra a significância somente do volume da fase aquosa para tamanho de partículas e PDI, enquanto a concentração de TPGS não deve ser um fator significativo.

Considerando o ajuste de um modelo linear, a Tabela 14 contém os valores dos coeficientes de regressão, desvio-padrão e t de Student para as 2 variáveis dependentes. Os resultados mostraram que somente o volume da fase aquosa foi estatisticamente significativo, e por isso é o único coeficiente que deve ser incluído nos modelos uma vez que os valores dos efeitos padronizados foram maiores (em módulo) que o valor tabelado: t(6) = 2,447. As Figuras 29 e 30 mostram os gráficos de Pareto para o tamanho de partículas e o PDI, respectivamente.

Tabela 14. Valores dos coeficientes, desvios-padrão e t de Student para tamanho de partículas e PDI (fatores: volume e concentração de TPGS)

Resposta Fator Coeficiente Desvio-padrão t(6)

Tamanho b0 169,2 10,8 15,7 b1 -55,7 12,6 -4,42 b2 11,0 12,6 0,869 b12 -11,7 12,6 -0,925 PDI b0 0,216 0,016 13,4 b1 -0,102 0,019 -5,40 b2 -0,00225 0,019 -0,119 b12 -0,0185 0,019 -0,977

Figura 29. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o tamanho das partículas (fatores: volume e concentração de TPGS)

Figura 30. Gráfico de Pareto dos efeitos padronizados para o PDI (fatores: volume e concentração de TPGS)

A partir dos gráficos de Pareto foi possível observar que: (i) o volume da fase aquosa possui efeito negativo tanto sobre o tamanho de partículas quanto o PDI, o que significa que um aumento em seu valor causará diminuição nestas 2 respostas e (ii) o termo referente à concentração de TPGS (b2) e o de interação (b12)

não foram significativos, estando de acordo com a análise dos resultados da Tabela 13. Isto pode estar relacionado ao fato de que com o aumento no volume da fase aquosa, o tamanho das partículas e o PDI diminuem devido à difusão mais rápida da acetona para a fase aquosa, o que evita coalescência das gotículas já que o polímero precipita rapidamente. Com isso ocorre a formação de partículas com menor tamanho e com uma distribuição mais estreita [82].

4.5.2 Análise de variância

Os resultados da análise de variância encontram-se na Tabela 15, sendo que foram desconsiderados os coeficientes b2 e b12 de ambos os modelos. A partir

dos valores do teste F, foi possível observar que os modelos propostos não apresentaram falta de ajuste já que os valores de Fcalculado (0,935 para tamanho e

0,863 para PDI) foram menores que o valor tabelado (F3,6 = 4,76). As regressões

também são significativas já que os valores de Fcalculado (19,9 para tamanho e 30,5

para PDI) são maiores que o valor crítico (F1,9 = 5,12).

Uma correlação razoável entre os dados experimentais e os valores preditos pelos modelos foi obtida, conforme observado pelos valores de R2: 0,6894 para tamanho e 0,7724 para PDI. Contudo, estes valores não podem ser comparados com o valor máximo (1,0) por causa da contribuição associada ao erro puro. Como nenhum modelo é capaz de reproduzir a soma quadrática do erro puro, a porcentagem máxima de variação explicável pode ser calculada a partir da equação 22, sendo obtidos os valores de 0,7884 para o tamanho e 0,8410 para o PDI. Com isso, como os valores obtidos são próximos dos valores de R2 é possível afirmar que a variação em torno da média pode ser explicada pelos modelos ajustados [102].

Tabela 15. Resultados da análise de variância e valores do teste F para tamanho de partículas e PDI (fatores: volume e concentração de TPGS)

Resposta Variação SQ GL MQ Fcalculado

Tamanho Regressão 24853,4 1 24853,4 19,9 Resíduos 11198,8 9 1244,31 Falta de ajuste 3568,72 3 1189,57 Erro puro 7630,05 6 1271,68 0,935 Total 36052,1 10 --- PDI Regressão 0,08364 1 0,08364 30,5 Resíduos 0,02465 9 0,002739 Falta de ajuste 0,007429 3 0,002476 0,863 Erro puro 0,01722 6 0,002869 Total 0,10829 10 ---

Devido à significância estatística das regressões e à ausência de falta de ajuste, uma superfície de resposta pode ser descrita satisfatoriamente pelos modelos lineares propostos para o tamanho de partículas e o PDI, conforme observado nas Figuras 31 e 32, respectivamente.

4.5.3 Função de desejabilidade

Para a determinação das condições ótimas na preparação das nanopartículas de PLGA, os seguintes critérios foram utilizados neste caso: (a) minimizar o tamanho de partículas, com um valor máximo permitido igual a 200 nm, (b) minimizar o valor de PDI, sendo que este deve ser inferior a 0,250 e (c) minimizar o valor de potencial Zeta, que deve apresentar valores inferiores a -25 mV. A Tabela 16 contém os valores mínimo e máximo observados para cada resposta, assim como a desejabilidade individual atribuída a cada um destes valores entre parênteses.

Figura 31. Superfície de resposta para o tamanho de partículas em função do volume e da concentração de TPGS

Figura 32. Superfície de resposta para o PDI em função do volume e da concentração de TPGS

Tabela 16. Valores mínimo, médio, máximo e de desejabilidade para as respostas (fatores: volume e concentração de TPGS)

Valor Tamanho PDI Zeta

Mínimo 118,0 (1,0) 0,098 (1,0) -44,3 (1,0) Médio 216,9 (0,1) 0,263 (0,1) -37,25 (0,5) Máximo 315,7 (0,0) 0,428 (0,0) -30,2 (0,0)

A Figura 33 contém o gráfico das curvas de nível para a desejabilidade global. É possível observar que os valores de D são dependentes somente do volume, da mesma forma que o tamanho e PDI conforme mostrado em suas respectivas superfícies de resposta (Figura 31 e Figura 32). O valor máximo de D (0,847) foi alcançado no nível mais alto do volume da fase aquosa (12 mL) e da porcentagem de TPGS (0,5% m/V), sendo por isso escolhidos como as condições ótimas.

Figura 33. Curvas de nível para a desejabilidade global (D) em função do volume e da concentração de TPGS

Embora o coeficiente da concentração de TPGS não tenha sido significativo nas condições investigadas, Wang e colaboradores relataram que o tamanho de partículas diminuiu com o aumento da razão em massa de TPGS; além disso, uma maior quantidade de TPGS na formulação resultou em menor PDI e maior eficiência de encapsulação do paclitaxel [100]. Isto pode estar relacionado ao fato de que, em concentrações maiores, maior quantidade de TPGS se orienta na interface água/acetona e reduz a tensão interfacial entre as fases orgânica e aquosa, o que promove a formação de gotículas menores durante a etapa de emulsificação e evita sua coalescência durante a evaporação da acetona [127,128].

4.6 Investigação do método de purificação das nanopartículas

Após a preparação das nanopartículas, uma purificação efetiva é uma etapa necessária para controlar suas características já que a presença de impurezas pode provocar uma potencial intolerância biológica, assim como alterar as características físico-químicas da formulação. Estas impurezas incluem solventes orgânicos, surfactante livre, fármaco não-encapsulado e agregados de partículas [33].

Neste trabalho duas abordagens foram investigadas: ultracentrifugação e diálise. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 17, sendo que foram preparadas 2 amostras para cada método. A eficiência de encapsulação (EE), o carregamento (C) e o rendimento (R) foram calculados de acordo com as equações 8, 9 e 10, respectivamente, que estão descritas na seção 3.9.3.

Tabela 17. Resultados obtidos no estudo do método de purificação Amostra Tamanho (nm) PDI Zeta (mV) EE (%) C (%) R (%)

Centr. 1 113,1 0,099 -39,6 3,30 1,83 11,3

Centr. 2 114,8 0,113 -40,3 3,15 1,63 12,0

Dial. 1 121,3 0,119 -35,0 4,59 0,37 77,9

Dial. 2 121,0 0,116 -41,1 4,62 0,38 76,5

Conforme observado na Tabela 17, valores menores de tamanho das partículas foram obtidos quando a ultracentrifugação foi utilizada (113,1 e 114,8 nm). Este fato pode ser atribuído à segunda etapa de sonicação (no banho de ultrassom)

que foi necessária, pois o impacto da força de centrifugação provocou agregação e dificuldades na redispersão das nanopartículas [129]. Em relação ao PDI e potencial Zeta não foram observadas diferenças significativas entre as 2 metodologias investigadas.

Contudo, a eficiência de encapsulação e o rendimento foram dependentes do método, com valores menores para a ultracentrifugação (EE = 3,30 e 3,15%; R = 11,3 e 12,0%) em comparação com a diálise (EE = 4,59 e 4,62%; R = 77,9 e 76,5%). Este resultado está relacionado à segunda sonicação, que promoveu liberação da carboplatina encapsulada. Além disso, a própria força de centrifugação pode provocar a saída do fármaco encapsulado, especialmente no caso de fármacos hidrofílicos [51]. Uma perda significativa de nanopartículas no sobrenadante pode ocorrer nas etapas de lavagem, provocando baixo rendimento. É importante ressaltar que o carregamento foi maior para a centrifugação já que a quantidade de nanopartículas obtidas (mNPs na equação 9) foi menor em comparação com a diálise.

Diante dos resultados obtidos, o método da diálise foi escolhido para a purificação das partículas.

4.7 Ensaio de estabilidade em água deionizada

As suspensões coloidais normalmente não possuem tendência à separação de fases até alguns meses após a preparação, já que o processo de sedimentação é lento para partículas que apresentam tamanho na escala nanométrica [99].

Desta forma, com os resultados obtidos nos estudos de planejamento experimental, as condições ótimas para a preparação das nanopartículas (tempo de sonicação = 2,0-3,0 min, amplitude = 20%, volume da fase aquosa = 12 mL, concentração de TPGS = 0,5% m/V e diálise como método de purificação) foram selecionadas, e então sua estabilidade em água deionizada foi investigada por meio das medidas de tamanho, PDI e potencial Zeta em função do tempo, conforme mostrado na Figura 34. De acordo com os resultados observou-se que não ocorreram variações significativas nos valores de tamanho, PDI e potencial Zeta durante o período investigado (60 dias), o que é bom indicativo da estabilidade das nanopartículas de PLGA obtidas utilizando-se as condições ótimas determinadas a partir de planejamento experimental.

Para ilustrar o perfil obtido pelo equipamento, os gráficos de distribuição do tamanho de partículas (Figura A5) e potencial Zeta (Figura A6), correspondentes a 1 medida, para uma amostra do dia 19 (Figura 34) são mostrados no Anexo.

Figura 34. Avaliação do tamanho de partículas (A), PDI (B) e potencial Zeta (C) em função do tempo, em água deionizada (n = 2)

Em seguida, com o objetivo de aumentar a eficiência de encapsulação da carboplatina (em torno de 4,5% para a diálise), um experimento foi realizado para verificar se os tempos de evaporação da acetona e da diálise são fatores que influenciam esta resposta.

Em geral, um aumento da eficiência de encapsulação de fármacos hidrofílicos pode ser alcançado diminuindo-se o tempo de evaporação do solvente, com emprego de rota-evaporação, de forma a reduzir a difusão para a fase aquosa. A difusão para o meio aquoso também pode ser diminuída pelo aumento da lipofilicidade do princípio ativo (conjugação com ácidos graxos) ou da fase aquosa externa (com adição de surfactantes de cadeia carbônica longa), assim como alterando o pH da fase aquosa para um valor no qual o fármaco seja menos solúvel [43]. No caso de fármacos de Pt(II), um aumento em sua lipofilicidade pode ser obtido aumentando-se o caráter hidrofóbico dos ligantes coordenados. Contudo, é importante ressaltar que mudanças nos ligantes podem comprometer a atividade do fármaco inicial [130].

Com isso, neste estudo optou-se pela redução no tempo de evaporação da acetona, de 24 h para 1 h com o emprego de rota-evaporação e pela redução no

tempo de diálise, de 24 h para 2 h. Os resultados obtidos estão na Tabela 18, e para ilustrar o perfil obtido pelo equipamento, os gráficos de distribuição do tamanho de partículas (Figura A7) e potencial Zeta (Figura A8), correspondentes a 1 medida, para a amostra 4 da Tabela 18 são mostrados no Anexo.

Tabela 18. Resultados obtidos no estudo da redução do tempo de evaporação da acetona e da diálise

Amostra Tamanho (nm) PDI Zeta (mV) EE (%) C (%) R (%)

1 163,3 0,095 -33,5 43,1 2,62 93,1 2 162,4 0,100 -32,3 39,2 2,49 96,9 3 168,1 0,131 -33,8 41,8 2,88 88,3 4 163,6 0,093 -35,0 35,6 2,33 90,4 5 160,6 0,120 -41,3 40,1 2,55 90,6 6 157,9 0,108 -32,3 37,1 2,44 87,4

De acordo com os resultados da Tabela 18, os valores de tamanho de partículas foram maiores com a redução nos tempos de evaporação e diálise: de 120 nm para 165 nm, aproximadamente. Este fato está relacionado com ausência de agitação magnética durante a rota-evaporação: quanto maior a velocidade de agitação, maior é a tensão de cisalhamento gerada, levando à diminuição do tamanho das gotículas e, consequentemente, reduzindo o tamanho das partículas [33,131]. Já os valores de PDI e potencial Zeta não sofreram alterações significativas.

Além disso, eficiência de encapsulação, carregamento e rendimento também apresentaram valores maiores com a redução nos tempos de evaporação e diálise. Estes resultados já eram esperados pois com a redução tanto do tempo de evaporação da acetona quanto da diálise, menor quantidade de carboplatina e dos componentes das partículas (PLGA e TPGS) difunde para a fase aquosa.

4.8 Influência do tempo de agitação e da concentração de folato de quitosana