3.9.1 Produção de Espécies Reativas de Oxigênio
3.9.1.1 Ânion Superóxido
O superóxido é determinado pela oxidação da adrenalina em tampão contendo SMP, succinato (inibidor da cadeia de transferência de elétrons) e catalase. Um controle negativo é determinado com a presença de SOD (PODEROSO et al., 1996).
Para esta análise, uma alíquota do quadríceps foi retirada e homogeneizada em tampão isolamento (MSTE). A amostra foi centrifugada e retirada uma parte do sobrenadante. Logo após, ressuspendeu-se o pellet que foi homogeneizado logo depois em MSTE. Centrifugou-se por 10 minutos e o sobrenadante foi novamente retirado. Os dois sobrenadantes foram misturados e centrifugados. O pellet dessa solução foi retirado e centrifugado duas vezes. A amostra foi congelada 3 vezes em – 70°C por cinco minutos. Foi adicionado 5 µl de solução de SMP (partículas sub-mitocondriais) e
tampão lavagem à amostra. Centrifugou-se por mais 10 minutos e o pellet foi ressuspendido. Esta última fase foi realizada 2 vezes antes de dosar.
3.9.2 Marcadores de Danos Oxidativos
3.9.2.1 Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)
Este método foi utilizado para a avaliação do estado de oxidação dos ácidos graxos em sistemas biológicos. O dano em lipídeos da membrana é determinado pela formação de subprodutos da lipoperoxidação (malondialdeído-MDA), que são substâncias reativas ao aquecimento do ácido tiobarbitúrico (TBA), formadas durante a peroxidação em sistemas de membranas e microssomos. O MDA reage com o TBA gerando um produto róseo lido em espectrofotômetro (DRAPER e HADLEE, 1990).
Esta análise foi realizada conforme descrito por Draper e Hadlee (1990). As amostras foram homogeinizadas em tampão TBA, lisadas em TCA 5% e centrifugadas por 10 min. O sobrenadante foi fervido por 30 min em TBA 67%. Após o resfriamento em temperatura ambiente, as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico foram quantificadas a 532 nm.
3.9.2.2 Carbonilação de proteínas
Este método foi utilizado para dosar a oxidação de proteínas. Baseia-se no princípio de que vários RL atacam resíduos de proteínas como aminoácidos (principalmente histidina, arginina, lisina e prolina) resultando em produtos com o grupo carbonil, o qual pode ser medido pela reação com dinitrofenihidrazina (LEVINE et al., 1990).
Nesta análise, após homogenização das amostras de quadríceps em tampão carbonil (120 mM KCL, 30mM KH2PO4), as mesmas foram centrifugadas a 7000g por
15min a 4°C e lisadas em TCA 20%. As amostras lisadas foram novamente centrifugadas a 14000 g por 5 minutos. O pellet foi ressuspenso em 100 L de 0,2 M de NaOH e as amostras foram incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com 2 M de
45
HCl (1:3) adicionado de 10 mM de DNPT. Após o período de incubação, adicionou-se 100 L de TCA 20% e as amostras foram centrifugadas a 14000g por três minutos. O pellet foi lavado com 500 L de etanol-etilacetato. As amostras foram incubadas por mais 30 minutos a 60°C, centrifugadas novamente a 14000g por 3 minutos. O conteúdo de formação de carbonil foi determinado espectrofotometricamente em 370nm, usando um coeficiente 22.0000 molar-1.
3.9.2.3 Sulfidrilas
O ácido ditionitrobenzóico (DTNB) é reduzido por tióis gerando um derivado amarelo (TNB) e lido espectrofotometricamente a 412 nm. Este método determina os tióis totais da amostra, sendo um parâmetro de medida de dano oxidativo às proteínas (AKSENOV e MARKESBERY, 2001).
As amostras do quadríceps foram homogeneizadas em 1 ml de tampão PBS (7.4 pH) com 1 mM de EDTA. Logo após, foi adicionado a amostra DTNB e incubada por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Por fim, as amostras foram lidas espectrofotometricamente.
3.9.3 Atividade de enzimas antioxidantes
3.9.3.1 Superóxido dismutase (SOD)
O produto resultante da reação catalisada pela SOD é o H2O2 que deve ser
retirado do meio o mais rápido possível. Uma unidade de enzima é definida pela quantidade transformada em 1µmol de substrato por minuto. A atividade enzimática foi determinada pela inibição da auto-oxidação da adrenalina medida espectrofotometricamente (480nm), segundo Bannister e Calabrese (1987).
O tecido do quadríceps foi homogenizado em 1 ml de tampão glicina (10,2 pH). Foram utilizados 10µl, 20µl e 30µl de amostra para fazer a leitura. Foi pipetado 10µl de catalase e 970 µl de tampão glicina (32◦) e em seguida foi dado o branco. A adrenalina (17µl) foi acrescentada à solução que foi lida durante 180 segundos. Após a primeira
leitura, adicionou-se 10 µl de catalase e 970 µl de tampão glicina à quantidade de amostra (10, 20 ou 30 µl) e logo depois zerou-se o espectro. Foi adicionado 17 µl de adrenalina e leu-se novamente em 180 segundos.
3.9.3.2 Catalase (CAT)
Esta análise mediu a atividade da enzima produzida pelas células e organelas da fração retirada do quadríceps em resposta a quantidade de peróxido de hidrogênio determinada pela queda na absorbância (240nm), conforme previamente descrito por Aebi (1984).
O procedimento iniciou com a homogeinização das amostras em tampão fosfato. Foram centrifugadas em 3000g por 10 minutos. Foram pipetadas 50µl de amostra e 1ml de tampão fosfato em cubeta de quartzo. Logo depois foi zerado o espectro. Foi utilizado o tampão fosfato com peróxido de hidrogênio para fazer a leitura. Foi adicionado 1ml de peróxido de hidrogênio à 50µl de cada amostra e feita a leitura nos tempos de 0 segundos, 30 segundo e 60 segundos.
3.9.4 Determinação da Proteína
A quantidade de proteínas de todos os ensaios foram mensurados usando a técnica de LOWRY et al. (1951). O princípio do método baseia-se em uma mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, reagente Folin-Ciocalteau, que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II) e produz um composto com absorção máxima em 750 nm.
O tecido foi homogeneizado em tampão correspondente de cada experimento. Foi pipetada a curva utilizando a relação de 0,5mg de albumina (BSA) para 1ml de H2O.
Foi colocado 10 µl da amostra homogeneizada em 190 H2O e depois pipetado 1 ml de
reagente C em todos os pontos e misturado no Vortex. Foram esperados 10 minutos para se acrescentar 100 µl de folin em todos os tubos e esperou-se mais 30 minutos. Para se fazer a leitura em espectofotômetro a 700nm em cubeta de plástico.
47