ENSAIOS DE INVASÃO 3D EM MIOMAS

Para os ensaios de invasão, foram utilizados tecidos de leiomioma uterino, que é composto majoritariamente por células de músculo liso e colágeno. O tecido obtido através de cirurgia de rotina após o consenso das doadoras era cortado em fatias de 3mm de altura e depois eram confeccionados discos de 8mm de diâmetro usando um bisturi circular. Os discos eram então estocados a -70ºC em meio de cultura DMEM/F12, contendo 10% de dimetilsufórido (DMSO) até ser utilizado no ensaio de invasão (NURMENNNIEMI et al., 2009).

Para os ensaios, os miomas foram transferidos para tubos falcon (5 miomas por tubo) contendo meio de cultura DMEM/F12 suplementado (o mesmo meio utilizado nas culturas de linhagens de câncer) e colocados em agitação horizontal a 4ºC por três dias. Então, eram transferidos para placas de 24 poços com insertos de membrana Transwell com poros de 8µm. A câmara inferior de cada poço era abastecida com 0,5mL de meio de cultura DMEM/F12 suplementado.

Os miomas eram tratados com um total 50µg de EVs oriundas de M1 Mf, M2 Mf e THP-1, seus respectivos sobrenadantes e meio de cultura Opti-Mem (controle negativo). Para cada tipo de tratamento eram utilizados três discos, totalizando 21 discos de miomas por cada linhagem celular de câncer estudada (SCC-25, SAS e HSC-3).

Primeiramente, ao topo dos miomas era adicionado 50µL de solução contendo 20µg de EVs ou sobrenadante (o mesmo volume que foi utilizado da solução de estoque do respectivo tipo de EV) diluídos em Opti-Mem ou apenas Opti-Mem (controle negativo) e então a placa era colocada em incubadora por quatro horas.

Depois do período de incubação, era adicionado ao topo dos miomas 50µL de solução contendo 700.000 células (SCC-25, SAS ou HSC-3) em Opti-Mem mais 50µL contendo 30µg de EVs ou sobrenadante (o mesmo volume que foi utilizado da solução de estoque do respectivo tipo de EV) diluídos em Opti-Mem ou apenas Opti-Mem (controle negativo) e então a placa era colocada em incubadora, overnight, permitindo que as células pudessem aderir-se aos discos de miomas.

No dia seguinte, os miomas eram retirados dos insertos Transwell e transferidos para placas de 12 poços sobre pequenas grades metálicas revestidas por uma fina membrana de nylon. Ao fundo de cada poço contendo discos de miomas era adicionado 1mL de meio de cultura DMEM/F12 suplementado, que era trocado nos dias quatro, sete e dez do experimento.

No 14º dia, os miomas eram colocados em formol (4%) e encaminhados para emblocamento em parafina e subsequentes cortes para a preparação de lâminas coradas em Hematoxilina e Eosina, e pela a técnica da imunoistoquímica usando os marcadores pan- citoqueratina (AE1/AE3) e Ki-67.

Na tentativa de observar se havia diferenças entre a comunicação célula-célula e através de vesículas, foi realizado um novo ensaio para comparar os níveis de invasão das células HSC-3 tratadas com as vesículas oriundas dos três diferentes tipos de Mfs e os níveis de invasão das células em cocultura.

A realização do ensaio foi feito seguindo o protocolo descrito acima, porém para os discos de miomas das coculturas, ao invés do tratamento com EVs, foram adicionados 100µL de solução contendo 400.000 células HSC-3 e 400.000 células Mfs (M1, M2 e THP-1) em meio Opti-Mem.

As lâminas coradas com pan-citoqueratina (AE1/AE3) foram fotografadas em microscópio óptico no aumento de 100x (dois a quatro campos consecutivos a depender da área de revestimento epitelial formado, sendo desprezadas as áreas de bordas) e foi medida a máxima profundidade de invasão (MPI), bem como área de invasão (AI), utilizando o programa ImageJ®.

As lâminas imunocoradas com Ki-67 (um marcador que se apresenta expresso em células que estão nas fases G1, S e G2 do ciclo celular e durante a mitose, mas não em repouso, indicando esse ser um bom marcador para células em proliferação) foram fotografadas no aumento de 200x (quatro a seis campos consecutivos, desprezando-se áreas de bordas) e então realizada uma análise descritiva dos padrões de marcação das células malignas.

4.8 ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO NO IncuCyte®

Para a realização dos ensaios de proliferação e migração, foi utilizado o IncuCyte® Zoom System (Essen BioScience), uma incubadora de células com um microscópio acoplado, com diferentes lentes objetivas (4, 10 e 20x), que captura imagens e envia para um disco

rígido externo conectado à rede, que reúne e processa os dados das imagens. Com esse dispositivo, era possível acompanhar, em tempo real, o andamento de ensaios funcionais que aconteciam dentro da incubadora, onde eram capturadas imagens em um intervalo de tempo pré determinado (2 ou 3h), que eram enviadas para um software próprio (IncuCyte® ZOOM Software - Essen BioScience), onde podiam ser analisadas.

Tanto os ensaios de proliferação quanto os de migração foram realizados em seis replicatas para cada grupo de tratamento. Foram utilizadas EVs oriundas de M1 Mfs, M2 Mfs e THP-1 nas concentrações de um, cinco, dez e vinte microgramas por mililitro, bem como os respectivos sobrenadantes e um grupo controle tratado apenas com meio de cultura Opti- Mem. As seis replicatas dos dezesseis grupos eram distribuídas em uma placa de 96 poços para cada linhagem celular de câncer estudada (SCC-25, SAS e HSC-3), totalizando seis placas, três para ensaios de proliferação e três para ensaios de migração (Figura 1).

Figura 1 - Esquema de distribuição dos diferentes grupos de tratamento nas placas de 96 poços utilizadas nos ensaios de proliferação e migração no IncuCyte®.

Para os ensaios de proliferação, foram preparadas soluções contendo 2.000 células (SCC-25, SAS e HSC-3), o volume necessário da solução de estoque de EVs diluídas em PBS de acordo com a concentração desejada (1, 5, 10 e 20µg/mL) e Opti-Mem, totalizando 100µL para cada replicata de cada grupo de tratamento. Para o sobrenadante, foi utilizado o mesmo volume da solução de estoque de 20µg/mL de cada tipo de EVs e, como controle negativo, eram utilizadas apenas as células diluídas em Opti-Mem, totalizando 100µL de solução. As placas eram então colocadas no IncuCyte® para análise. Cada poço contendo uma replicata

era fotografado a cada duas ou três horas e gerados gráficos da relação entre a porcentagem de confluência e o tempo.

Para a análise dos efeitos das EVs na proliferação de cada linhagem celular de CCELO, foram comparadas as diferentes concentrações (1, 5, 10, 20µg/mL) de cada grupo (M1 Mf, M2 Mf e THP-1) com o respectivo sobrenadante e o controle negativo (Opti-Mem, apenas). Além disso, foram comparados, em cada concentração, os efeitos dos diferentes grupos.

Para os ensaios de migração, eram colocados 50µL de Myogel®, uma matriz gelatinosa que mimetiza o tecido humano (SALO et al., 2015), em cada um dos 96 poços e a placa colocada em incubadora por 24h. No dia seguinte, 30.000 células das linhagens de câncer (uma linhagem celular para cada placa) eram plaqueadas em cada poço e colocadas em incubadora por mais 24h. No terceiro dia, era feita uma ferida nos poços utilizando o WoundMaker® (um dispositivo capaz de fazer feridas iguais nos 96 poços ao mesmo tempo), cada poço lavado duas vezes com 100µL de PBS, para remover possíveis debris celulares resultantes da confecção das feridas, e então colocado o tratamento com vesículas oriundas de THP-1 e dos Mfs nas concentrações pré definidas, além dos sobrenadantes e controle negativo. As placas eram então colocadas no IncuCyte® e o processo de migração observado via software (Figura 2).

Para a análise dos efeitos das EVs na capacidade migratória de cada linhagem celular de câncer (HSC-3, SCC-25 e SAS), foram comparadas as diferentes concentrações (1, 5, 10, 20µg/mL) de cada grupo (M1 Mf, M2 Mf e THP-1) com o respectivo sobrenadante e o controle negativo (Opti-Mem, apenas). A análise foi feita pela densidade relativa da ferida, que consiste na medida da densidade espacial das células na área de ferida relativa à densidade celular espacial fora da área da ferida, a cada ponto de tempo. Além disso, foram comparados em cada concentração os efeitos dos diferentes grupos (Figura 3).

Figura 2 - Poço F6 do ensaio de proliferação com células SCC-25 – 5µg/mL M2 Mf fotografado a cada 18 horas mostrando os níveis de proliferação celular através do tempo.

Figura 3 - Poço B6 do ensaio de migração com células SCC-25 – 5µg/mL M1 Mf fotografado a cada três horas mostrando os níveis de migração celular através do tempo.