VESÍCULAS EXTRACELULARES

O interesse clínico e científico nas EVs tem aumentado rapidamente desde que evidências demonstraram que elas podem constituir um novo paradigma de sinalização celular (XU et al., 2016). Tratam-se de vesículas de tamanho nanomérico secretadas pela maioria dos tipos celulares, senão todos, e podem carregar consigo proteínas, RNA, DNA e lipídeos que podem ser transportados ou trocados entre células como uma forma de comunicação celular, podendo ser parácrina ou a nível sistêmico (PRINCIPE et al., 2013; BENITO-MARTIN et al., 2015; VADER et al., 2016; XU et al., 2016).

As EVs estão relacionadas com a manutenção de condições normais e patológicas, incluindo o câncer (XU et al., 2016). Células de mamíferos podem liberar tipos distintos de EVs, incluindo microvesículas, exossomos e corpos apoptóticos. Essa classificação é feita baseada na sua origem intracelular (VADER et al., 2016).

As microvesículas, também chamadas de ectossomos, são heterogêneas em tamanho e podem variar de 50nm a 1µm e são formadas pelo brotamento direto da membrana plasmática para o meio extracelular. Esse processo captura componentes citosólicos no lúmen neoformado e receptores de membrana na membrana circunjacente (PRINCIPE et al., 2013; VADER et al., 2016).

Quando as células são submetidas ao processo de apoptose, uma população heterogênea de vesículas, que varia de 50nm a 5µm, é liberada e são chamadas de corpos apoptóticos (VADER et al., 2016).

Nos anos 1980, dois grupos de pesquisadores, estudando a maturação de reticulócitos (eritrócitos imaturos), descreveram uma forma mais complexa de excreção de EVs no meio intercelular. Eles demonstraram que pequenas vesículas são formadas por brotamento dentro de um endossomo intracelular conduzindo a formação de um corpo multivesicular (MVB),

que pode então se fundir à membrana plasmática e ser liberado para o meio extracelular (HARDING; HEUSER; STAH, 1983; PAN et al., 1985).

Em 1987, o termo exossomo foi então proposto para essas EVs de origem endossomal (JOHNSTONE et al., 1987). Em investigações posteriores, a identificação de mRNA e miRNA nos exossomos despertou um forte interesse nessas vesículas (VALADI et al., 2007). Considerando que fragmentos de mRNA também foram observados em microvesículas derivadas da membrana plasmática, atualmente acredita-se que as células utilizam EVs como uma forma de comunicação extracelular e troca de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos com outras células (RAPOSO; STOORVOGE, 2013).

Estudos iniciais proteômicos indicaram que os exossomos possuem um conjunto de proteínas derivadas de endossomos, da membrana plasmática e do citosol, porém muito poucas derivadas de outras organelas citoplasmáticas. Essa informação confirma que os exossomos são, na verdade, um compartimento subcelular específico, uma vez que não apresentam um conjunto aleatório de proteínas, caracterizando resíduos celulares, como era pensado até então (KOWAL; TKACH; THÉRY, 2014).

Os exossomos foram pensados inicialmente para designar as EVs que variavam, em tamanho, entre 40 a 100nm, que eram liberadas por uma variedade de células em cultura, e eram definidos como “vesículas membranares exfoliadas que podem desempenhar uma função fisiológica”. No entanto, esse termo foi posteriormente adotado para designar vesículas menores (30-100nm), de origem endossomal, que eram liberadas em consequência da fusão de MVBs com a membrana plasmática e expressam marcadores, como o CD63, CD81 e CD69 (JOHNSTONE et al., 1987; COLOMBO; RAPOSO; THERY, 2014).

O termo “exossomo” é o mais comumente usado para designar qualquer tipo de EV e tem se tornado um termo popular entre os grupos que estudam vesículas. A maioria das publicações especifica que os exossomos são formados em compartimentos multivesiculares endossomais e são secretados quando esses compartimentos se fundem à membrana. No entanto, o material isolado das culturas de células geralmente possui uma mistura de EVs de diferentes tipos (LÖTVALL et al., 2014).

Até o momento, ainda não há uma lista de marcadores específicos para distinguir, em uma amostra, cada tipo de EV. Por exemplo, distinguir as EVs produzidas pelo brotamento da membrana plasmática das vesículas produzidas por compartimentos endossomais (PRINCIPE et al., 2013; LÖTVALL et al., 2014).

A falta de uma distinção completa entre exossomos e microvesículas tem levado à sobreposições nas estratégias de isolamento, levando alguns estudos a considerarem as

microvesículas como um composto contendo ambos os tipos de vesículas. No entanto, juntos, exossomos e microvesículas têm sido demonstrados como promissores alvos de estudos sobre a descoberta de biomarcadores em câncer, particularmente devido ao seu potencial impacto na fisiologia tumoral e na patogênese e progressão de diferentes tipos de cânceres (PRINCIPE et al., 2013).

Lötvall et al. (2014) listaram em seu estudo os requerimentos mínimos que comprovam a presença de EVs nas amostras a serem utilizadas nas pesquisas:

 O primeiro critério é que sejam isoladas a partir de fluidos extracelulares, ou seja, a partir de meio de cultura condicionado ou fluidos corporais. A ruptura mecânica de células e tecidos pode resultar no isolamento de vesículas que são originadas de compartimentos intracelulares, o que obviamente reduz a pureza da amostra de EVs. Dessa maneira, o uso do termo EV pode não ser apropriado para amostras isoladas nessas condições.

 Apesar de análises proteômicas terem demonstrado diversas proteínas comumente encontradas em amostras de exossomos, essas proteínas não são específicas. Na verdade, os exossomos são enriquecidos com determinadas proteínas que podem estar presentes em uma variedade de EVs. No entanto, a proporção relativa de diferentes proteínas parece variar em diferentes tipos de vesículas. Dessa maneira, é interessante que seja reportado a presença de algumas proteínas, no mínimo três (CD9, CD63, CD81 e TSG101, por exemplo), para cada preparo de EVs. As proteínas utilizadas na caracterização devem ser proteínas que espera-se estar presente no tipo de EV de interesse.

 Como regra geral, pelo menos duas tecnologias devem ser utilizadas para caracterizar as EVs, tais como, Western Blots, citometria de fluxo, análise da proteômica usando técnicas de espectometria de massa, microscopia eletrônica de transmissão e/ou força atômica, análise de rastreamento de nanopatículas, entre outras.

 Deve-se fazer uso de um controle negativo sistemático que pode ser composto por EVs obtidas a partir do meio de cultura que não foi condicionado pelas células de interesse ou o líquido remanescente do isolamento das EVs (sobrenadante).

Atualmente, não há consenso sobre um padrão ouro para para os métodos de isolar e/ou purificar EVs, não podendo ser afirmado que há um método ótimo para ser uniformemente utilizado. No entanto, o método de extração e isolamento das vesículas deve ser descrito nos estudos, permitindo assim a interpretação e reprodução do método por outros pesquisadores (LÖTVALL et al., 2014).

Os tumores podem fazer uso de exossomos derivados de Mfs (tanto M1 Mfs quanto M2 Mfs) para reforçar o escape de células da vigilância imunológica e, nesse sentido, os derivados de Mfs regulam a expressão da integrina-β1 em células endoteliais in vitro, eventualmente promovendo a sua migração (LEE et al., 2014). Suas contribuições no extravasamento do conteúdo intravascular e invasão tumoral são plausíveis, no entanto esse mecanismo ainda não está muito bem estabelecido (BENITO-MARTIN et al., 2015). De acordo com um estudo realizado por Ismail et al. (2013), os exossomos secretados por Mfs podem regular o potencial invasivo em casos de câncer de mama através da distribuição de miRNAs oncogênicos.

Em cânceres, a estimulação contínua do tumor primário geralmente potencializa a vigilância imunológica mediada por Mfs. Uma potencial consequência da excreção em massa dos exossomos pelos Mfs, em cenários patológicos, poderia ser a formação de um microambiente inflamatório que, em última análise, resultaria em um aumento da capacidade de metástase tumoral (BENITO-MARTIN et al., 2015).

A identificação de biomarcadores das EVs pode ser útil no diagnóstico precoce e para determinar o prognóstico dos tumores. Assim sendo, a liberação, tanto pelas células tumorais quanto pelas outras células presentes no TME, pode ser um novo alvo de terapia, podendo representar um veículo de entrega seletiva de drogas quimioterápicas, pequenas moléculas terapêuticas ou agentes para terapia gênica contra as células tumorais (ZHU et al., 2012).

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