Enzima NOS

Em relação à enzima NOS, foi possível encontrar uma equação para compostos pterínicos de atividade já conhecida (equação 32), através de descritores de energia livre, que pudesse prever de forma adequada sua inibição. Foram propostas estruturas de amidinas neste trabalho (16-23) e suas atividades foram previstas. Algumas das propostas foram previstas como tão ativas quanto as anteriores; algumas já foram sintetizadas e testadas, demonstrando que são realmente ativas frente à L. amazonensis, tendo uma destas estruturas passado recentemente pelo processo de patenteamento.

Quando aplicada às amidinas, a equação 32 indica que estas substâncias seriam mais ativas na forma neutra, que, por possuirem energia de solvatação menos favorável, teriam um custo energético menor para serem removidas do solvente antes de atravessar as barreiras membranosas. Isso sugere que para o desenvolvimento de compostos ainda mais ativos frente a esta enzima, seu sítio de protonação poderia ser substituído por grupamentos que não pudessem ser protonados, como grupos metilênicos.

6.1.2. Enzima TR

O método de atracamento molecular se mostrou adequado para a previsão da interação dos compostos em estudo com a enzima em questão. Foi possível obter correlações significativas para as duas séries de compostos estudados (equação 33 para as fenotiazinas e equação 35 para os mesoiônicos), entre os dados experimentais e os descritores de interação obtidos pelo método de atracamento. As correlações revelam detalhes sobre características estruturais importantes para o processo de interação destes compostos.

Alternativamente, foi possível obter uma correlação significativa entre os dados experimentais da série dos mesoiônicos e descritores de energia livre. Em relação às fenotiazinas, a relação obtida pelo método de atracamento molecular apresentou uma correlação com os dados experimentais mais adequada que a equação obtida pelo método

Dentre os sítios estudados (TSST, NADPH e FAD), há uma maior probabilidade de interação das fenotiazinas ao sítio da TSST, por possuir melhor correlação com os dados experimentais. Para os mesoiônicos, os estudos de docking mostram interações mais favoráveis no sítio do FAD, além de ser possível obter uma boa correlação com os dados de atividade, caracterizando uma inibição alostérica. O sítio do NADPH não representou uma boa possibilidade de interação para nenhuma das estruturas em estudo, mas por possuir um atracamento ainda melhor que o sítio da TSST, reforça a inibição alostérica colocada, pois as possibilidades dos mesoiônicos se complexarem ao sítio da TSST (caracterizando uma inibição isostérica) são pequenas.

Aplicando-se o modelo de energia livre, observou-se as formas catiônicas dos mesoiônicos são previstas como mais ativas do que as formas neutras, indicando que uma maior atividade seria obtida na forma de sais (cloridratos, por exemplo). Além disso, há uma melhor correlação entre os dados de atividade calculados e experimentais. Deve ser relembrado, contudo, que a forma catiônica, por possuir carga total diferente de zero, pode também ter uma maior dificuldade de atravessar sistemas membranosos (e de ser dessolvatada), diminuindo a sua absorção. O pH do local onde se encontra a TR do parasito, portanto, deve ser determinante para a maior ou menor atividade desses compostos.

Em relação à interação das amidinas frente à TR, nota-se que as formas mais ativas seriam as formas neutras. Ainda assim, a interação das amidinas frente ao sítio do FAD é a mais satisfatória, e bastante fraca frente ao sítio da TSST ou NADPH. As modificações propostas para sua estrutura frente a NOS se aplicam de igual forma à TR, pois sua protonação se mostrou ruim para sua adequada interação. Com isto, existe a possibilidade das amidinas constituírem, frente a TR, pró-fármacos ou inibidores acompetitivos (existem outras amidinas que constituem pró-fármacos, conforme colocado anteriomente). Mas para confirmar tal colocação, são necessários estudos acerca de seu metabolismo.

Graças ao sequenciamento da TR de L. amazonensis, foi possível a obtenção neste estudo de estruturas tridimensionais para esta enzima por métodos teóricos, que representam ferramentas úteis para o contínuo desenvolvimento de novos inibidores desta enzima. Foi determinado, através do atracamento molecular na presença e ausência das moléculas de água cristalizadas, que várias moléculas ali presentes, principalmente aquelas que não se encontram em interação a algum resíduo, atrapalham o atracamento dos compostos em estudo. Este atracamento se faz muito melhor na ausência destas moléculas, que provavelmente serão deslocadas pelos compostos ao se atracarem aos sítios estudados.

A semelhança verificada entre as TRs de T. cruzi e L. amazonensis demonstram a possibilidade da criação de compostos ativos contra os 2 parasitos. Este fato se aplica a praticamente todos os compostos aqui testados, pois todos se mostraram igualmente ativos frente às enzimas dos 2 parasitos. Apenas as fenotiazinas se mostraram mais ativas frente ao T. cruzi, enquanto os mesoiônicos e amidinas se mostraram mais ativos frente à L. amazonensis. Ainda assim, a diferença de atividade perante estes parasitos é muito pequena, o que ressalta a possibilidade de serem todos ativos frente aos 2 parasitos.

6.2. Perspectivas

Por serem mais ativos contra formas promastigotas, os mesoiônicos devem agir melhor se aplicados aos vetores do parasito — por exemplo, nos locais onde esses insetos põe seus ovos, como nos solos e locais úmidos que contém matéria orgânica — e não como fármacos para os hospedeiros vertebrados, visto que nestes últimos a forma que se encontra disseminada é a amastigota.

Com os modelos de inibição criados neste trabalho, a atividade de outras substâncias pode ser calculada contra estas enzimas.

Conforme dito acima, modificações na estrutura dos mesoiônicos e amidinas podem ser então propostas, para a obtenção de estruturas ainda mais ativas.

Com a criação do modelo estrutural de L. amazonensis, outras substâncias podem ser agora analisadas frente a este parasito.

Esta estrutura pode ainda ser analisada com outros métodos em modelagem, como a dinâmica molecular, para uma otimização de sua estrutura, e consequentemente dos modelos neste trabalho aplicados.

Novos testes bioquímicos podem ser propostos para a confirmação de uma inibição alostérica, como a verificação da inibição pelo sítio do FAD aqui proposta.

Através da proposição desta inibição alostérica, outros sítios da enzima NOS (como o sítio do grupamento heme, NADPH, FAD etc) podem ser ainda verificados, para a proposição de uma inibição mais próxima à real.

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