4.1.4.1- Na preparação das soluções
Para preparação de todas as soluções foram usados balões volumétricos de classe A, com diferentes capacidades.
Para medições de volumes superiores a 1,00 mL usaram-se pipetas graduadas e volumétricas de vidro, classe A. Para volumes iguais ou inferiores utilizaram-se pipetas
automáticas de volume regulável, da marca Gilson, modelos P20, P100 e P1000 (Villiers le Bel,
France) e pipetas automáticas de volume fixo (25 µL e 50 µL), da marca Eppendorf, modelo Research.
houve necessidade de utilização de funis de vidro com várias dimensões facilitando a adição dos componentes das várias misturas aquosas efectuadas.
As pesagens dos padrões foram realizadas numa balança da marca Precisa, modelo 92SM-202 A, com sensibilidade de 0,01 mg. As restantes pesagens foram efectuadas numa balança da marca Mettler, modelo AE 200 com sensibilidade de 0,0001 g.
Para promover a dissolução de substâncias sólidas ou a mistura de soluções, usou-se um agitador vórtex modelo VF2 IKA®- Labortechnik, da Janke & Kunkel;
A medida do pH, quando da preparação das soluções de tampão, foi efectudada recorrendo a um potenciómetro da marca Hanna Instruments, modelo pH-Meter HI 8424, equipado com eléctrodo de vidro combinado da mesma marca, modelo HI 1331B.
4.1.4.2 - Na colheita, preparação e tratamento do cabelo
Na colheita e segmentação do cabelo, em fragmentos de 1 mm, foi usada uma tesoura de pontas finas. A segmentação do cabelo em porções de 1 cm efectuou-se com auxílio de um bisturi sobre uma régua de papel. As diversas porções de cabelo foram colocadas em tubos de ensaio graduados, com capacidade de 10 mL, com tampas de vidro, onde foram submetidas ao processo de descontaminação. Nesta etapa usou-se um agitador mecânico P Selecta com rotação de 360º e um concentrador de amostras da Techne, modelo Sample Concentrator Techne Dri-Block® DB.3D que permitiu a secagem do cabelo sob corrente de azoto, a uma temperatura de 40ºC.
As pesagens das amostras de cabelo foram efectuadas numa balança da marca Mettler, modelo AE 200 com sensibilidade de 0,1 mg, utilizando tubos de ensaio graduados, com capacidade de 10 mL, com tampas de vidro, previamente silanizados.
4.1.4.3 – Na libertação e extracção das drogas
Libertação
Para se efectuar a hidrólise alcalina, utilizou-se uma placa eléctrica termostatizada com agitador magnético da marca Heidolph, modelo MR 2002.
Extracção
A medida do pH das amostras, durante o processo extractivo, foi efectudada recorrendo a um potenciómetro da marca Hanna instruments, modelo pH-Meter HI 8424, equipado com eléctrodo de vidro combinado da mesma marca, modelo HI 1331 B.
Por extracção em fase sólida
Em função da metodologia aplicada utilizaram-se colunas Bond Elut Certify® da Varian
e Sep Pack C18 da Waters. As etapas de activação dos cartuchos, passagem da amostra pelo
cartucho, desorção dos analitos e eluição foram efectuadas num sistema de vácuo marca Vac Elut, modelo SPS 24.
Por extracção líquido-líquido
A agitação do tubo de extracção efectuou-se com agitador mecânico P Selecta com rotação de 360º; Na separação das fases (aquosa e orgânica) utilizou-se uma centrífuga modelo Labofuge 400 Function Line da Heraeus Instruments; Para remoção da fase orgânica foram empregues pipetas de Pasteur e pêra de sucção.
Por solvente orgânico
Utilizou-se um banho de ultrassons, termostatizado, da marca Bandelin, modelo Sonorex RK 100.
Independentemente do método extractivo aplicado, os extractos foram concentrados num concentrador de amostras da Techne, modelo Sample Concentrator Techne Dri-Block® DB.3D.
4.1.4.4 - Na derivatização das drogas
Para proceder à completa secagem dos extractos a derivatizar utilizou-se, posteriormente ao concentrador de amostras mencionado, um exsicador com sílica. No processo de derivatização propriamente dito foi empregue um banho termostatizado marca
4.1.4.5 - Instrumentação de análise das drogas e condições operacionais
Os compostos foram identificados e quantificados por GC/MS. Na execução deste trabalho usaram-se três aparelhos distintos de GC/MS todos da marca Hewlet-Packard (HP, Estados Unidos). Em virtude de existirem algumas diferenças no equipamento, em função dos compostos que se pretendiam identificar/quantificar, optou-se, para simplificação, denominá-los de sistema 1, sistema 2 e sistema 3. As características do equipamento foram as que a seguir se descrevem:
Sistema 1-
Sistema GC/MS: Cromatógrafo Gasoso HP 6890 series II (USA) equipado com coluna capilar HP Ultra 1 (com fase estacionária de dimetilsiloxano, 12 m de comprimento, 0,20 mm i.d. e 0,33 µm de espessura da fase estacionária - película de revestimento) acoplado a um Detector Selectivo de Massa HP 5973. A temperatura do injector foi de 220ºC, tendo sido usada injecção split com um ratio split 10:1. O fluxo do gás de arraste foi de 1,0 mL/min
(helium, alphagazTMHe 2). A temperatura do injector foi de 200ºC, tendo sido usada injecção
split com um ratio split 10:1. A temperatura do forno, onde se localiza a coluna, foi programada para uma temperatura inicial de 150ºC, mantida 1 min, atingindo 270ºC a 20ºC/min, mantendo-se durante 5 min. A temperatura da Interface MS foi de 280ºC. As temperaturas da fonte iónica e do quadrupolo foram 150ºC e 230ºC, respectivamente. O detector foi operado em modo EI a +70 eV, em modo full scan, para determinar o tempo de retenção de cada composto e seleccionar os iões m/z característicos. A calibração das massas foi feita diariamente de forma automatizada com recurso à perfluorotributilamina e a voltagem do multiplicador de electrões foi a voltagem do autotune (1100-1600 V).
Sistema 2 -
Sistema GC/MS: Cromatógrafo Gasoso HP 6890 series II (USA), com injector automático HP 7683 series (USA), equipado com coluna capilar HP Ultra 2 (fase estacionária de dimetilsiloxamo com 5% de grupos fenilo, 12 m Χ 0,20 mm i.d. X 0,33 µm de película de revestimento) acoplado a um Detector Selectivo de Massa HP 5973 (USA), operando por
split com um ratio split 10:1. O fluxo do gás de arraste através da coluna foi o mesmo do sistema anterior. A temperatura do forno onde se localiza a coluna foi programada, no caso de análise de DIAZ, NORDIAZ e FLU, para uma temperatura inicial de 150ºC, mantida 2 min, atingo mesmo indo de 230ºC, a 20ºC/min, e 270ºC a 10ºC/min, mantendo-se durante 1 min.
Na análise de ∆9-THC-COOH, a rampa de temperatura é equivalente, variando a apenas a
temperatura máxima atingida que foi de 260ºC. A temperatura da Interface MS foi de 280ºC. As temperaturas da fonte iónica e do quadrupolo foram 150ºC e 106ºC, respectivamente. O
gás reagente usado foi o metano com uma pressão aparente na fonte iónica de 1,8 X 10-4 Torr.
Sistema 3 -
Sistema GC/MS idêntico ao sistema 2 mas com detector, operando por ionização electrónica. A temperatura do injector foi de 220ºC, tendo sido usada injecção split com um ratio split 10:1. O fluxo do gás de arraste através da coluna foi o mesmo dos sistemas anteriores. A temperatura do forno onde de localiza a coluna foi programada para uma temperatura inicial de 150ºC, mantida 1 min, atingindo 270ºC, a 20ºC/min, mantendo-se durante 5 min. A temperatura da Interface MS foi de 280ºC. As temperaturas da fonte iónica e do quadrupolo foram 150ºC e 230ºC, respectivamente. O detector foi operado em modo EI a +70 eV, pelo modo full scan, apenas para determinar o tempo de retenção de cada composto e seleccionar os iões mais característicos. A calibração das massas foi feita diariamente de forma automatizada com recurso à perfluorotributilamina e a voltagem do multiplicador de electrões foi a do autotune (1100-1600 V).
Todos os restantes consumíveis, referentes aos sistemas de GC/MS, foram da marca HP/Agilent.