CAPÍTULO III: MAPEAMENTO DE QTLS PARA QUALIDADE DA MADEIRA EM UMA POPULAÇÃO SEGREGANTE ENVOLVENDO QUATRO ESPÉCIES DE
2.4.4 Estimativas de Desequilíbrio de Ligação
Houve uma clara diferenciação dos valores do coeficiente de correlação (r2) para cada espécie e região gênica avaliada (Figuras 05 e 06). As cores utilizadas
representam os valores de r2 estimados, sendo que blocos brancos, r2 = 0, tons de
FLQ]D U2 H EORFRV HP SUHWR U2
= 1,0. Para o gene CAD não foi possível observar a formação de nenhum bloco de SNPs em desequilíbrio de ligação para
nenhuma das espécies estudadas (Figura 05). Em E. dunnii, foi formado um bloco
com altos valores de r2, porém não muito extenso, entre os SNPs 08 e 27 que em pares de base compreende uma região de 483 pb, da região 5´ UTR até parte do
intron 2. Os clones apresentaram um bloco em DL ainda menor entre os SNPs 35 e
39, referente a 83 pb no final do intron 2 e parte do exon 3.
Para o gene 4CL, as espécies E. dunni, E. saligna e E. globulus apresentaram
regiões extensas com altos valores de r2. Para E. dunnii e E. globulus, essa região
não chega a ser consecutiva em termos de distância com valores de r2 = 1, porém
os valores de r2 encontrados estão próximos de 0,7 e 0,8. Em E. saligna, o maior
bloco foi formado entre os SNPs 14 e 38 e apresentou valores de r2 iguais ou muito
próximos de 1. Esse bloco em desequilíbrio de ligação englobou 593 pb e é relativo ao exon 1 e parte do intron 1 do gene 4CL. Os clones apresentaram também forte desequilíbrio de ligação entre os SNPs 36 e 53 (Figura 06). Contudo, o fragmento
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Figura 05. Representação Gráfica DL em Eucalyptus para o gene CAD. 1 - E. camaldulensis; 2 - E-globulus; 3 - E. saligna; 4 - E. grandis; 5 - E. urophylla;
6 - Clones;7 - E. dunnii.
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Figura 06. Representação Gráfica DL em Eucalyptus para o gene 4Cl. 1 - E. camaldulensis; 2 - E-globulus; 3 - E. saligna; 4 - E. grandis; 5 - E. urophylla; 6
- Clones;7 - E. dunnii.
Com o objetivo de reforçar os resultados anteriores foram gerados gráficos dos valores de r2 estimados para cada gene/ espécie em função da distância em pares de base. Para o gene CAD a tendência das curvas que ilustram a extensão do DL foi semelhante para todas as espécies estudadas (Figura 07).
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Figura 07 ± Gráficos representando a extensão do Desequilíbrio de ligação no gene CAD versus a
distância em pares de base. O desequilíbrio de ligação foi estimado a partir dos valores de r2. Os pontos vermelhos representam os valores de r2 para cada par de SNPs.
Foi observado tanto na espécie E. grandis bem como nos clones a falta de SNPs em uma região do gene CAD. De maneira geral, o valor de r2 entre os primeiros SNPs é por volta de 1, mas cai rapidamente após cerca de 400 pares de base. Por meio de equações de regressão linear foi estimada uma linha que demonstra a queda do desequilíbrio ao longo da distância. Foram confeccionados gráficos adicionais para a espécie E. saligna e os clones com os valores de r2 FRQVLGHUDGRVVLJQLILFDWLYRVSHORSURJUDPD /2' )LJXUD (PJHUDOSRGH se observar uma alteração dos resultados de extensão do DL quando apenas os valores elevados e significativos de r2 são usados, tanto numa espécie com maior
número de SNPs (E. saligna) como numa amostra com menor número de
polimorfismos (clones). , ,6' ,6% ,6& ,6" ,6- ,6+ ,60 ,6) ,6* '
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Figura 08 - Gráficos representando a extensão do Desequilíbrio de ligação no gene CAD versus a
distância em pares de base. Desequilíbrio de ligação calculado baseado em valores de r2. Os pontos vermelhos representam os valores de r2 para cada par de SNPs significatLYRV /2'
Para o gene 4Cl, em geral, foi observado que os valores de r2 estimados para
os pares de polimorfismos foram maiores (Figura 09). Porém, da mesma forma que
no gene CAD, a extensão de valores intermediários para r2 não foi além dos 400-500
pares de base. Entre as espécies puras, E. saligna apresentou maiores valores de r2
que se estenderam por até 600 pares de base. Nos clones foram encontrados os
maiores valores de r2, porém foi observada uma queda mais brusca do desequilíbrio
de ligação em relação à distância do que nas espécies puras. " "#$ "#% "#& "#' "#( "#) "#* "#+ "#, $ " %"" '"" )"" +"" $""" $%"" $'"" $)"" $+"" %""" %%"" %'"" %)"" %+"" &""" ? $ D/3:M623C!4=!0C?4/!F4!BC/4!H0BK
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Figura 09 - Gráficos representando a extensão do desequilíbrio de ligação no gene 4CL versus a
distância em pares de base. Desequilíbrio de ligação calculado baseado em valores de r2. Os pontos vermelhos representam os valores de r2 para cada par de SNPs.
2.5 DISCUSSÃO
A seleção destes dois genes da via lignificação (CAD e 4CL) (Anterola & Lewis, 2002) foi baseada nas funções cruciais que ambos desempenham na formação da lignina bem como em estudos que foram desenvolvidos em outras plantas que evidenciaram a importância dos mesmos e que os tornaram candidatos para estudos de associação (Li et al., 2003; Nakashima et al., 2008; Sewalt et al., 1997). " "#$ "#% "#& "#' "#( "#) "#* "#+ "#, $ " %"" '"" )"" +"" $""" $%"" $'"" $)"" $+"" %""" %%"" %'"" ? $ D3/:M623C!4=!0C?4/!F4!BC/4!H0BK !"#$%&'()/()*+), 9-+), !"#(+'')) " "#$ "#% "#& "#' "#( "#) "#* "#+ "#, $ " '"" +"" $%"" $)"" %""" %'"" %+"" ? $ D3/:M623C!4=!0C?4/!F4!BC/4!H0BK !"#$%&'(), *+), 9-+), !"#$0,4+0+* " "#$ "#% "#& "#' "#( "#) "#* "#+ "#, $ " &"" )"" ,"" $%"" $("" $+"" %$"" %'"" %*"" &""" ? $ D3/:M623C!4=!0C?4/!F4!BC/4!H0BK !"#$%&'())*+), 9-+), -0(%$&
As estimativas de diversidade nucleotídica encontradas neste estudo para as
espécies puras de Eucalyptus e os clones híbridos são relativamente altas e já foram
descritas na maior parte dos estudos com espécies arbóreas (Brown et al., 2004; Gonzalez-Martinez et al., 2006; Heuertz et al., 2006; Novaes et al., 2008). Valores
elevados encontrados para E. camaldulensis (0,0110 ± CAD), E. urophylla (0,008 ±
CAD) e E. saligna (0,007 ± CAD) também já eram esperados visto o que tem sido
encontrado para outros tipos de marcadores. Valores menores para as espécies E.
dunnii (0,001 ± CAD) e E. globulus (0,004 ± 4CL) também foram observados com outros tipos de marcadores moleculares ao longo deste trabalho.
Em trabalho recente, Novaes et al. (2008), encontraram alta diversidade
nucleotídica entre seqüências transcritas da espécie E. grandis. González±Martinez
et al. (2006) também encontraram valores semelhantes trabalhando com espécies
diferentes de Pinus em genes também pertencentes à via de lignificação (pal, sams
± 2 e ccoamt). Utilizando os mesmos genes candidatos deste trabalho, 4CL e CAD, Brown et al. (2004) encontrou, em pinho, valores médios idênticos aos encontrados
neste estudo, 0,005 e 0,006 respectivamente. Os valores de S encontrados
demonstram a grande variabilidade das espécies do gênero Eucalytpus e reforça a
teoria de recente domesticação do gênero.
Os valores obtidos de diversidade para os clones híbridos espontâneos não foram menores do que os encontrados para espécies puras. Os valores encontrados podem ser explicados, possivelmente, pela recente miscigenação dessas amostras e a grande variabilidade das espécies formadoras.
Em razão da alta diversidade nucleotídica dentro das espécies estudadas, poucos ou nenhum bloco haplotípico foi formado entre SNPs distantes fisicamente. Os maiores blocos haplotípicos formados envolveram em média 450 pares de base
nas espécies E. urophylla, E. camaldulensis, E. saligna e E. dunnii para o gene 4CL.
Quando são utilizadas outras metodologias para formação de haplótipos disponíveis no programa Haploview quase nenhum dos blocos identificados no gene 4CL se mantêm (dados não mostrados). Essa análise indica o grande número de recombinações existentes entre os polimorfismos analisados.
Apesar do pequeno número de blocos haplotípicos inferidos pela análise foi observado um grande número de Tag SNPs. A função principal de um Tag SNP é capturar a informação de SNPs altamente correlacionados a ele para diminuir esforços no momento da genotipagem desses polimorfismos para uso em estudos
de associação. Por exemplo, para o gene 4CL foi encontrado um SNP que captura a informação de outros 17 SNPs adjacentes, nos clones híbridos. Este Tag SNP reduz
em 94% o esforço de genotipagem para esta região gênica. Para Pinus taeda
valores médios de 30 a 40% de redução no volume de polimorfismos a serem genotipados foram encontrados (Gonzalez-Martinez et al., 2006) a partir da
avaliação de 18 regiões gênicas. Em Eucalyptus, o valor médio se aproxima muito
do encontrado para Pinus taeda.
Os valores de DL encontrados foram distintos entre as duas regiões gênicas. No gene CAD, foram encontrados baixos valores de r2 enquanto que no gene 4CL
foram encontrados valores maiores de r2 em algumas espécies puras e no conjunto
de clones. Mas ao longo dos genes o resultado é muito semelhante, isto é, o DL cai rapidamente se estendendo por no máximo 400 pares de base em média. Valores baixos de r2 e o rápido decréscimo do DL foi reportado em diferentes espécies arbóreas e mesmo em algumas plantas cultivadas (Brown et al., 2004; Ching et al., 2002; Gonzalez-Martinez et al., 2006; Heuertz et al., 2006; Ingvarsson, 2005). Os FORQHVXWLOL]DGRVQHVVHHVWXGRFRPRXPD³SRSXODomR´GLIHUHQFLDGDRULJLQDGDGHXP processo mesmo que recente de seleção e miscigenação, não apresentaram valores de DL muito diferentes dos encontrados em espécies puras. O gene 4CL nos clones
apresentou os maiores valores de r2 encontrados nesse estudo, porém a queda do
DL ao longo da distância foi ainda mais rápida que nas espécies puras.
Este estudo auxilia na identificação de quais abordagens devem ser observadas no momento de se realizar um estudo de associação no gênero
Eucalyptus. As estratégias de estudos de associação baseadas em genes
candidatos têm sido mais utilizadas em espécies florestais devido ao elevado número de SNPs e rápida queda do DL dentro e entre regiões gênicas. Essas FDUDFWHUtVWLFDVWRUQDPDHVWUDWpJLDGHHVWXGRGR³ZKROHJHQRPHVFDQ´SUDWLFDPHQWH inviável (Neale & Savolainen, 2004). Este estudo permitiu, apesar de ter sido realizado em uma escala reduzida, confirmar que o DL se estende por pequenas regiões gênicas e que a diversidade nucleotídica dessas regiões é elevada. Adicionalmente também permitiu demonstrar que essas características são específicas de regiões gênicas e de espécies diferentes dentro do gênero. A abordagem de estudos de associação baseados em Tag SNPs também foi demonstrada nesse estudo com a eficiência dependente da população utilizada e da região gênica alvo.
Estimativas de DL ao longo do genoma de espécies do gênero Eucalyptus são importantes e devem ser realizadas em maior escala à medida que novas metodologias de genotipagem são desenvolvidas, possibilitando assim, uma melhor estimativa a ser utilizada em estudos de associação.
2.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CAPÍTULO III: MAPEAMENTO DE QTLS PARA QUALIDADE DA MADEIRA EM UMA POPULAÇÃO SEGREGANTE ENVOLVENDO QUATRO ESPÉCIES DE EUCALYPTUS
3.1 RESUMO
As espécies do gênero Eucalyptus introduzidas no Brasil apresentam boa adaptação
às condições edafoclimáticas, tornando-as as principais espécies utilizadas para produção de energia, celulose, carvão, madeira, entre outros. As florestas plantadas necessitam suprir o volume de produção nacional e ainda para exportação. O melhoramento genético auxilia no aumento de produção com uma mesma área relativa plantada, aumentando a competitividade do produto nacional. A busca por regiões genômicas associadas a características quantitativas de interesse comercial
pode auxiliar e acelerar o processo de melhoramento. Dentro do gênero Eucalyptus
diversos trabalhos já identificaram regiões genômicas associadas a características tais como: resistência a doenças, habilidade de propagação vegetativa, características de desempenho e qualidade da madeira. No presente trabalho, foram genotipados 130 locos microssatélites e 16 genes, em uma família de 188 irmãos completos, descendentes do cruzamento de duas plantas híbridas: (E. dunni x E.
grandis) x (E. urophylla x E. globulus). A progênie segregante foi fenotipada aos três
anos de idade para características de desempenho (altura, DAP, volume e Pylodin) e características de qualidade da madeira (teor de lignina, relação siringil/guaicil, rendimento depurado e densidade básica). Foram construídos dois mapas genéticos baseados na segregação desses marcadores em cada parental separadamente. Os marcadores foram testados individualmente quanto à ligação com QTLs no programa QTL Cartographer. Marcadores significativamente ligados à QTLs foram identificados para todos os caracteres com níveis de significância variando entre 5%, 1% e 0,1%. Utilizando ainda o programa QTL Cartographer, foram avaliadas as metodologias de mapeamento por Intervalo Simples e Composto. Por Intervalo Simples foi identificado somente um QTL significativo para característica volume no genitor UGL no grupo de ligação 6. Este QTL também foi identificado por Intervalo Composto. No total, por Intervalo Composto, considerando os dois genitores foram
identificados 12 QTLs envolvendo todas as características, exceto densidade básica. O grupo de ligação com o maior número de QTLs foi o grupo 6. Grande parte dos QTLs encontrados por intervalo contém marcadores que estão associados ao fenótipo também pela análise de Marca Simples. O mapeamento de genes candidatos permitiu a identificação de genes participando do intervalo do QTL, como os genes SAMS e Alfa-tubulina. Em relação às metodologias de mapeamento utilizadas ficou evidente a importância do uso de co-fatores para correções dos erros tipo I e II. Os QTLs encontrados neste trabalho devem ser validados em outros
pedigrees e outros ambientes antes da sua utilização em larga escala no
3.2 INTRODUÇÃO
A incorporação de ferramentas e abordagens genômicas nos programas de melhoramento florestal está abrindo perspectivas para a compreensão das relações complexas entre variabilidade genética e diversidade fenotípica relevantes no processo produtivo. A identificação de variações no genoma associadas aos dados fenotípicos pode acelerar o processo de seleção direcional para os fenótipos de interesse comercial (Grattapaglia, 2007b).
Em Eucalyptus, já foram identificados QTLs para as mais diversas características, tais como: capacidade de enraizamento (Grattapaglia et al., 1995; Marques et al., 1999); área foliar e altura (Byrne et al., 1997a); tolerância à geada (Byrne et al., 1997b); qualidade da madeira e crescimento (Grattapaglia et al., 1996; Kirst et al., 2004; Missiaggia, 2005; Novaes, 2006; Thamarus et al., 2004; Verhaegen et al., 1997) e resistência a doenças (Junghans et al., 2003). Grande parte desses trabalhos foram realizados baseados em mapas genéticos construídos com marcadores dominantes o que dificulta também a integração de diferentes mapas de QTLs (Grattapaglia, 2007a).
As metodologias utilizadas para o mapeamento de QTLs, quando se possui o mapa de cada parental individualizado, podem envolver marca simples, intervalo simples e intervalo composto. A acurácia da detecção fica cada vez maior à medida que se aplicam as últimas metodologias principalmente usando-se co-fatores (Schuster & Cruz, 2004).
Apesar do sucesso dos experimentos em encontrar regiões do genoma responsáveis pela variação na característica sob estudo, o número de QTLs, suas posições precisas e particularmente a magnitude dos seus efeitos ainda são insuficientemente compreendidos. Isto se deve ao tamanho relativamente pequeno das progênies empregadas, a precisão limitada na avaliação do fenótipo, o número UHGX]LGR GH ³EDFNJURXQGV´ JHQpWLFRV WHVWDGRV LH Q~PHUR GH FUX]DPHQWRV H DV limitações inerentes aos tipos de marcadores e pedigrees utilizados. A avaliação da sintenia entre QTLs em diferentes cruzamentos e condições ambientais é importante para que as informações de mapeamento possam ser utilizadas na prática do melhoramento florestal (Grattapaglia, 2007a).
Esse capítulo teve por objetivo: (a) a construção de um mapa genético baseado em marcadores microssatélites para uma família segregantes envolvendo quatro espécies de Eucalyptus gerada pelo cruzamento de dois genitores híbridos DG (E. dunni x E. grandis) X UGL (E. urophylla x E. globulus); (b) o mapeamento de genes candidatos para qualidade da madeira via genotipagem de haplótipos de SNPs segregantes; (c) localização de QTLs para diferentes características silviculturais e de qualidade da madeira utilizando diferentes metodologias estatísticas e (d) uma análise comparativa dos QTLs mapeados com QTLs
3.3 MATERIAL E MÉTODOS