Geração dos dados genotípicos dos microssatélites, genes e ESTs

Após a triagem dos locos microssatélites, restaram 130 locos informativos para mapeamento os quais foram genotipados nos 188 descendentes. Destes, 103 locos microssatélites foram mapeados em ambos os genitores, sendo que 78 destes apresentaram quatro alelos segregando e os 25 restantes apresentaram três alelos segregando na população. Os nove locos que mapearam no genitor DG e os 18 locos que mapearam somente no UGL possuem entre dois e três alelos. A Figura 06 é uma representação esquemática em porcentagem dos locos informativos para este cruzamento.

Figura 06 ± Gráfico representando em porcentagem os locos microssatélites informativos para o

cruzamento DG x UGL.

A partir da triagem 70% dos locos foram informativos para o cruzamento DG x UGL, mesmo que somente em um dos parentais. Entre os parentais, o genitor UGL apresentou um mapa mais denso em microssatélites, mostrando assim um maior nível de heterozigosidade nos mesmos locos em comparação ao genitor DG.

Entre os 29 locos de microssatélites derivados de ESTs, a maioria (18 locos) teve segregação completamente informativa e estão presentes no mapa dos dois parentais. Nove locos são informativos apenas para o parental híbrido (UGL) e dois locos são informativos apenas para o outro parental híbrido (DG). A Tabela 04 demonstra quais são os locos de EST mapeados assim como a anotação feita utilizando a ferramenta BLAST X.

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Tabela 04 ± Locos de EST informativos para o cruzamento DG x UGL, motivo de repetição e

similaridade encontrada pela ferramenta BLAST com o banco de dados GenBank.

Nome loco Motivo de

repetição Similaridade BLAST X

EMBRA915 (CCCT)n DNA binding protein ± Elaeis oleifera

EMBRA941 (TC)n Skp1 ± Medicago sativa

EMBRA945 (AG)n P0482C06.20 ± Oryza sativa (japonica cultivar-group) EMBRA950 (CTCG)n Expressed protein ± Arabidopsis thaliana

EMBRA954 (CTGC)n

HB2 homeodomain protein ± Populus tremula x Populus

tremuloides

EMBRA979 (CT)n Cytochrome b561-related ± Arabidopsis thaliana

EMBRA1071 (ATC)n Glycine dehydrogenase ± decarboxylating

EMBRA1144 (AG)n B1088C09.17 ± Oryza sativa (japonica cultivar-group)

EMBRA1244 (AG)n LIM domain protein PLIM1 ± Nicotiana tabacum

EMBRA1398 (AG)n NOI protein, nitrate-induced - Arabidopsis thaliana

EMBRA1428 (CT)n Wound Induced Protein Kinase - Nicotiana tabacum

EMBRA1507 (AG)n Small blue copper protein Bcp1 ± Boea crassifolia

EMBRA1538 (GCT)n Hypothetical protein ± Oryza sativa

EMBRA1578 (AG)n Hypothetical RAE1-like protein

EMBRA1639 (CTC)n

PIN1-like auxin transport protein ± Populus tremula x

Populus tremuloides

EMBRA1643 (GA)n

Tuber-specific and sucrose-responsive element binding factor Solanum tuberosum

EMBRA1656 (TC)n Endomne protein 70, putative ± Arabidopsis thaliana

EMBRA1761 (AG)n Expressed protein ± Arabidopsis thaliana

EMBRA1770 (TC)n

RHO GDP-dissociation inhibitor 1 ± related ±

Arabidopsis thaliana

EMBRA1793 (TCCT)n No hit

EMBRA1851 (ACGG)n

50S ribosomal protein L27, chloroplast precursor (CL27) ± Arabidopsis thaliana

EMBRA1924 (TC)n Expressed protein ± Arabidopsis thaliana

EMBRA1928 (AG)n Heat Shock Factor Protein HSF24

EMBRA1966 (AG)n

Aldehyde dehydrogenase 1 precursor ± Lotus

corniculatus

EMBRA1977 (GCGA)n Ankyrin domain protein ± Nicotiana tabacum

EMBRA1990 (AG)n

Calcium-binding EF-hand family protein ± Arabidopsis

thaliana

EMBRA2000 (CT)n

Auxin-induced (indole-3-acetic acid induced) protein family ± Arabidopsis thaliana

EMBRA2014 (AGGA)n Unknown ± Arabidopsis thaliana

EMBRA2055 (CGC)n Expressed protein ± Arabidopsis thaliana

Para os segmentos gênicos originados a partir da biblioteca de EST, as reações de PCR passaram por modificações na temperatura de anelamento até que um fragmento sem amplificações inespecíficas fosse obtido. Entre as possibilidades de combinações de iniciadores testados, foi escolhida aquela que apresentou o maior segmento e com menos produtos inespecíficos. Os tamanhos dos segmentos gerados por PCR foram estimados por comparação com marcador molecular de tamanho conhecido em géis de agarose e, posteriormente, confirmados via seqüenciamento.

Os genes e ESTs foram mapeados observando SNPs heterozigotos nos genitores e a configuração de segregação destes mesmos SNPs na descendência o que permitiu inferir a fase de ligação dos mesmos. A codificação dos dados para entrada no Mapmaker foi feita da mesma forma que os microssatélites, porém ao invés da observação dos genótipos a um loco, para os genes foi observada a presença do gameta de cada genitor formado pelo haplótipo dos SNPs presentes naquele segmento. Para cada segmento gênico foram escolhidos no mínimo dois SNPs e no máximo três SNPs. A Tabela 05 resume todos os genes e ESTs

mapeados, tamanho em pares de base do amplicon gerado, as combinações de

iniciadores utilizadas bem como a temperatura de anelamento utilizada na PCR. A EST 2727 apresentou na amplificação a presença de mais de uma banda no gel de agarose (Figura 07). Outras temperaturas de anelamento foram testadas para verificar se não se tratava de uma banda inespecífica, porém esse padrão se manteve mesmo em temperaturas elevadas. O que explica esse padrão é se considerarmos que ambos os genitores são heterozigotos para a presença de uma

inserção/deleção (indel) no loco em questão.

Figura 07. Produto da amplificação do EST 2727 analisado por eletroforese em gel de agarose 3%

mostrando a segregação dos alelos de uma indel. Segunda e terceira canaletas são relativas ao genitor masculino G38 (E. grandis) e ao feminino U15 (E. urophylla), respectivamente, seguidos por 15 indivíduos F1 e um negativo. Primeira e última canaletas são marcadores DNA ladder 1 kb (Invitrogen®).

Tabela 05 ± Genes e ESTs mapeadas em dois cruzamentos (G38 x U15 ± DG x UGL) a partir

da segregação de haplótipos de SNPs genotipados por re-seqüenciamento da progênie segregante. Nome Gene/EST Primers utilizados Temperatura de anelamento Tamanho do

amplicon Haplótipos genitores

U15 G38

EST5971 5971Fex

5971Rint 58°C 315pb AC/AT AC/TC

EST15398 15398Fex

15398Rint 63°C 370pb AT/GC AT/AC

F5H F5H ± F

F5H ± R 57°C 185pb AC/AT AC/TC

CCR CCR ± F

CCR ± R 57°C 550pb AGT/AGC AGT/GTC

COMT _COMT COMT ± F _{± R} 57°C 362pb GC/GG GG/GA

EG1 EG1 ± F1

EG1 ± R1 58°C 350pb AG/AG AG/AG

C4H C4H ± F

C4H ± R 58°C 284pb AC/AT AT/GT

CelSynt CelSynt ± 1F

CelSynt ± 1R 57°C 250pb CA/CG CA/TA

DG UGL

TUA1 TUA ± F1

TUA ± R1 58°C 422pb TT/AT TA/TT

LAC LAC ± F1

LAC ± R1 52°C 301pb TT/TT CT/TA

Myb1 Myb ± F1

Myb ± R1 55°C 435 GG/GG GA/GA

PAL Pal ± F2

Pal ± R2 55°C 415 AA/AG AG/GG

SAMS Sams ± F1 Sams ± R1 55°C 214pb CT/TT TT/TG EST5601 5601Fint 5601Rext 57°C 327pb CT/CC CC/CG EST14161 14161Fext 14161Rext 57°C 372 GG/GT GA/GG EST7693 769Fint 7693Rext 58°C 530pb CC/GA CT/GG

Entretanto, devido à baixa resolução da agarose, mesmo quando foram utilizadas concentrações de 3,0 % (p/v) e maior tempo de corrida, não foi possível inferir com segurança os genótipos dos indivíduos de maneira a usá-los para o

mapeamento. Para resolver este problema, os amplicons dos dois genitores e da

progênie foram analisados em gel de poliacrilamida 6 % (p/v) de alta resolução (Figura 08). Com esta estratégia foi possível inferir que os genitores são

heterozigotos para o amplicon em questão e que três alelos segregam na

configuração analisada. O parental G38 apresenta os alelos A e B de 275pb e 235 pb, respectivamente, e o U15 os alelos C e B de 240pb e 235 pb, respectivamente;

evidenciando um indel de 40 e 5 pb para o primeiro e segundo genitor, respectivamente.

Devido à presença em heterozigose da indel não foi possível submeter ao

seqüenciamento o amplicon desta EST. Com a finalidade de mapear esta EST os

genótipos foram então registrados a partir dos géis de poliacrilamida para a progênie segregante. Assumindo que G38 tem um genótipo AB e U15 genótipo CB, a progênie apresentou a segregação de 1 AC: 1 AB: 1 CB: 1 BB e a EST 2727 foi então, incluída nas análises de mapeamento.

O gene EG1 apresentou vários SNPs idênticos entre os parentais, não permitindo estimar a fase de ligação. Portanto, foi escolhido apenas um SNP para mapear o gene. O gene EG1 foi posicionado somente no mapa integrado, pois os alelos dos pais eram iguais. Já o gene cesA1 também apresentou dois SNPs nas posições 184pb e 217pb. O haplótipo formado por esses dois SNPs deveria segregar na progênie na proporção 1:1:1:1, porém nos dados obtidos observamos somente a presença de três genótipos dos quatro que deveriam ser formados pelos gametas parentais. A probabilidade desse genótipo não ter sido amostrado na progênie devido à baixa amostragem populacional é mínima. Com base nisso, foram utilizados os SNPs para cesA1 separadamente para tentar mapear o gene e somente foi possível a localização do mesmo no mapa do G38 (paterno) utilizando o SNP 184. No mapa materno o gene não foi localizado provavelmente devido ao mesmo estar associado a outros marcadores que não segregam na mãe (U15).

Figura 08. Produto da amplificação de segmento do gene 2727 em gel de poliacrilamida 6%

mostrando a segregação de alelos para um padrão indel. Segunda e terceira canaletas são relativas ao genitor masculino G38 (E. grandis) e ao feminino U15 (E.

urophylla), respectivamente, seguidos por 15 indivíduos F1 e um controle negativo. A

e B são codificações para os alelos do parental 1 (P1 ± G38) e C e B para os alelos do parental 2 (P2 ± U15). Abaixo de cada indivíduo encontra-se seu genótipo com base nesta codificação. Primeira canaleta corresponde ao marcador DNA ladder 1kb plus

(Invitrogen®) e última ao marcador DNA ladder 10 pb.

3.4.5 Construção dos mapas genéticos pela estratégia de pseudo-cruzamento