Triagem e seleção de microssatélites

Para o teste de paternidade, entre os seis locos testados, o loco EMBRA32 não amplificou com sucesso, sobrando ao total informação de cinco locos. Comparando os alelos dos cinco locos amplificados entre a progênie e os parentais, somente um indivíduo (A6491) foi declarado não derivado deste cruzamento. A amostra foi retirada e substituída por outra devidamente checada quanto à paternidade.

Após a análise dos dados da triagem dos 179 locos verificou-se que 17 locos apresentaram alelos homozigotos diferentes, portanto todos os descendentes possuem genótipos heterozigotos iguais. Sete locos apresentaram o mesmo genótipo heterozigoto nos parentais constituindo marcadores segregando 1:2:1 com fase desconhecida na descendência. Cinco locos apresentaram alelo nulo em um parental e o alelo amplificado neste mesmo parental é comum com um dos alelos presente no outro parental, impossibilitando assim a identificação da origem do alelo.

A análise ficou de difícil interpretação em 11 locos que possuíam mais do que dois alelos segregando, evidenciando uma provável duplicação ou amplificação inespecífica pela PCR. Em quatro locos os genitores possuem genótipos homozigotos com o mesmo alelo entre eles. Esses locos são provenientes de EST (EMBRA943, EMBRA1139, EMBRA1829 e EMBRA1081). Apenas um loco, EMBRA332, apresentou alelos com tamanho elevado, acima da faixa de detecção e análise possível com o padrão de segmentos de tamanho conhecido, impossibilitando a estimativa do tamanho correto em pares de base. E por fim, para nove locos a amplificação falhou. A representação esquemática dos locos com segregação não informativa para este cruzamento encontra-se na Figura 02.

Entre os 179 locos utilizados na triagem, 44 locos são provenientes de regiões

não traduzidas de ESTs (Expressed Sequence Tags). Apesar deesses locos

possuírem um menor grau de polimorfismo e um menor número de alelos, tornando mais difícil a ocorrência de segregações informativas, mais de 50% dos locos de ESTs (29 locos) utilizados na triagem foram informativos para a família em estudo e utilizados para a construção do mapa.

No total de 179 locos testados, cerca de 30% foram descartados por terem falhado ou apresentado segregação não informativa para o cruzamento conforme descrito acima. Os demais locos (~70%) foram genotipados com sucesso na população e mapeados.

Figura 02 ± Representação gráfica em porcentagem do total de locos testados na população de

mapeamento do cruzamento DG x UGL.

3.4.3 Triagem e seleção de genes candidatos

Como exposto na seção de Material e Métodos, o primeiro cruzamento

utilizado foi entre E. urophylla x E. grandis (IP) para mapeamento dos genes. DNA

dos dois genitores e seis filhos foi submetido à amplificação com os iniciadores

relativos a cada amplicon e os segmentos amplificados posteriormente

seqüenciados. O alinhamento das seqüências permitiu a identificação de SNPs segregando na família e só assim então a reação de amplificação e seqüenciamento foi aplicada em mais indivíduos da progênie. Da mesma forma, em seguida à construção do mapa de microssatélites mais genes e ESTs foram mapeados no cruzamento DG x UGL.

Para os genes conhecidos e participantes de rotas metabólicas já identificadas, de um total de 22 fragmentos gênicos testados, onze genes foram geneticamente mapeados em pelo menos um dos mapas. Apenas um gene (HOX) não apresentou fragmento amplificado para nenhuma das combinações testadas em nenhuma temperatura de anelamento utilizada. Dois genes foram seqüenciados (PECLY e ZincFinger), apresentaram SNPs segregando, porém o programa de

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mapeamento não conseguiu agrupá-los com nenhum grupo de ligação formado. Outros dois genes apresentaram SNPs em configurações nas quais os genitores possuem genótipos heterozigotos iguais, não permitindo o mapeamento em parentais separados. Por fim, para seis genes foi obtido um amplicon

satisfatoriamente, porém o seqüenciamento dos amplicons não apresentou

qualidade satisfatória para a análise possivelmente devido à presença de indels. A Figura 03 demonstra uma representação gráfica da triagem dos genes.

Figura 03 ± Triagem de genes candidatos nas famílias de mapeamento (IP e DGxUGL).

Trinta ESTs diferencialmente expressos entre E. grandis e E. globulus foram

selecionados. Os primers desenhados permitindo as várias combinações foram

então analisados e somente cinco ESTs ainda não foram testadas neste trabalho (9540, 6332, 1763, 12542 e 9458).

Entre as ESTs testadas, seis ESTs foram mapeadas com sucesso, cinco não amplificaram em nenhuma combinação de iniciadores e temperatura testada e uma somente amplificou, porém não apresentou seqüência com qualidade suficiente para análise. Seis ESTs foram re-seqüenciadas em toda progênie, mas não foi possível mapeá-los. Apenas duas ESTs apresentaram polimorfismos que geraram segregação não informativa. Finalmente, três ESTs apresentaram fragmentos amplificados com tamanho pequeno não permitindo qualidade suficiente no seqüenciamento. A Figura 04 resume estatisticamente a triagem das ESTs.

Em outra situação, o EST 981 foi seqüenciado no cruzamento IP (G38 x U15), porém a progênie apresentou haplótipos não compatíveis com os haplótipos dos

'#("- ,#$"- ,#$"- %*#&"- ("- ./0!1234565708 ./0!21391:12 ;9<5=0:9>!702!29>20! ?9<@=530 A9BCD<751!E9!F15G1! B8145E1E9 H1391E0>

genitores (Figura 05). O fragmento foi re-seqüenciado nos genitores e mais alguns indivíduos da progênie e da mesma forma o haplótipo presente hora era de origem parental, hora não. A segregação dos haplótipos na progênie foi 1:1, ou seja, metade da população apresenta haplótipos parentais e metade haplótipos não originados do cruzamento.

Figura 04 ± Resumo da sucesso de mapeamento de ESTs nas famílias de mapeamento (IP e DG

x UGL). &#&"- _)#*"- )#*"- $"- $)#)"- $)#*"- %"- %"- A9?:9?1I/0!9>=:1<J1 ;9<@=530>!5?815>!9<=:9! ?9<5=0:9> A9BCD<751!E9!F15G1!B8145E1E9 K:1?29<=0!78:=0 ./0!123456571:12 ./0!60:12!=9>=1E0> H1391E0> ./0!21391:12

Figura 05 ± Alinhamento da seqüência gerada para o EST 981, evidenciando um dos SNPs que

apresentam alelos improváveis na progênie.