Tem-se como premissa o fato de que todos os vírus utilizam diversos componentes da maquinaria celular em associação às proteínas virais por eles codificadas. No caso de alguns vírus de RNA de fita de polaridade positiva, ocorre um sequestro de componentes proteicos envolvidos no processo de tradução celular, que é quase inteiramente direcionada para a síntese proteica viral. Logo, a célula hospedeira é diretamente prejudicada, uma vez que os RNAm virais passam a ser traduzidos em detrimento dos RNAm celulares, ocasionando a inibição da síntese de proteínas celulares (mecanismo denominado host cell translation shut-off).
Nos alfavírus, por exemplo, a inibição da síntese das proteínas celulares pode ser bloqueada em apenas 2 h após o início da infecção. Apesar de vários mecanismos já terem sido propostos para explicar esse fenômeno, ainda não há um consenso sobre qual deles contribui de fato para a inibição da síntese proteica celular durante a infecção pelos alfavírus. Um dos mecanismos propostos está relacionado com a identificação da interação da proteína viral não estrutural NSP2 com a principal fosfoproteína ribossomal RpS6. Essa proteína é um componente da subunidade ribossomal 40S e seu alto grau de fosforilação está relacionado com o aumento da taxa de tradução celular global. Foi demonstrado que a proteína viral NSP2 pode interagir com uma proteína hipofosforilada ou, ao interagir com RpS6, diminui seus níveis de fosforilação. A real função de RpS6 no aumento global da taxa de síntese proteica celular ainda é controversa, porém parece que a interação de NSP2 e RpS6 levaria à tradução preferencial dos RNAm virais em detrimento dos RNAm celulares. Um segundo mecanismo interessante que explicaria a inibição da síntese proteica pelos alfavírus diz respeito à fosforilação do fator celular eIF2α durante a infecção das células-alvo. O fator eIF2α participa do processo de início de montagem da subunidade ribossomal 40S nos RNAm. A fosforilação desse fator restringe a atividade de um segundo fator de iniciação da tradução, o GTP-eIF2tRNAiMet. Nesse caso, a tradução dos RNAm virais estaria garantida pela presença de um elemento sinalizador potencializador da tradução, presente nesses RNAm, que aumentaria a afinidade dos fatores de iniciação da tradução pelos RNAm virais, diminuindo o requerimento pelo GTP-eIF2tRNAiMet. Foi demonstrado ainda que a indução de proteínas de estresse pela infecção viral é importante para a inibição da síntese proteica celular.
O poliovírus foi muito bem estudado nas últimas décadas e, por esse motivo, será usado para ilustrar esse tipo de estratégia. O mecanismo de direcionamento de determinados elementos celulares envolvidos na tradução, especificamente para o vírus, somente é possível devido ao fato de os RNAm dos poliovírus compartilharem diversas estruturas com os RNAm celulares, que são reconhecidas pela maquinaria celular, concomitante à existência de uma estrutura diferenciada que torna os RNAm virais resistentes a esse processo inibitório.
Portanto, estruturalmente, os RNAm de poliovírus, tais como os RNAm celulares, possuem extremidades que contêm uma sequência de nucleotídeos não traduzida, denominada UTR, sendo o 3′
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UTR poliadenilado e, assim, envolvido na manutenção da integridade do RNAm, prolongando sua meia-vida no citoplasma. No entanto, diferentemente dos RNAm celulares que recebem a adição de um cap na extremidade 5′ UTR, os RNAm de poliovírus não são capeados. Em contrapartida, essa região 5′ UTR viral contém diversas estruturas secundárias em formato de grampo, conhecidas como IRES, que são reconhecidas por um complexo proteico celular responsável por recrutar a subunidade 40S ribossomal.
O processo de iniciação da síntese proteica celular ocorre por meio do reconhecimento do cap na extremidade 5′ via complexo proteico de iniciação, denominado eIF4F (eukaryotic initiation
factor 4F), e posterior recrutamento da subunidade 40S que desliza pelo RNAm até encontrar um
AUG. O complexo eIF4F consiste em três polipeptídeos: eIF4E, eIF4A e eIF4G. O eIF4E é uma subunidade ligadora de cap; eIF4A é uma helicase dependente de RNA que, junto a eIF4B, desfaz a estrutura secundária presente na extremidade 5′ dos RNAm; enquanto eIF4G funciona como uma ponte em razão de sua interação com eIF4E, pela extremidade aminoterminal, e eIF4A, pela extremidade carboxiterminal. A eIF3 é outra subunidade que se liga diretamente à extremidade carboxiterminal de eIF4G e é responsável pelo recrutamento da subunidade menor do ribossoma 40S (Figura 4.9A).
Distintamente, ocorre a iniciação da síntese proteica dos poliovírus. Todo o processo se inicia com uma proteína viral denominada protease 2A, que é liberada autocataliticamente da poliproteína inicial. Essa protease cliva eIF4G próximo à sua extremidade aminoterminal, separando os sítios de ligação à eIF4E do restante carboxiterminal da proteína (Figura 4.9B). Esse último fragmento (2/3 restantes da proteína) mantém os sítios de ligação a eIF3 e eIF4A.
A clivagem proteolítica de eIF4G não possibilita a montagem do complexo de iniciação nos RNAm celulares, causando a inibição da síntese proteica celular. Entretanto, o fragmento de eIF4G correspondente à extremidade carboxiterminal é utilizado pelos RNAm do poliovírus, uma vez que não há necessidade da extremidade aminoterminal responsável pelo reconhecimento do cap. Portanto, a iniciação da tradução em poliovírus ocorre independentemente da presença de um cap, mas dependente da presença do IRES, visto que o complexo formado com eIF4G carboxiterminal, eIF4A e eIF3 tem mais afinidade por IRES que o complexo eIF4F (Figura 4.9B).
Em 1988, os IRES foram observados pela primeira vez nos próprios poliovírus; são estruturas secundárias estáveis, presentes no 5′ UTR de vários picornavírus, alguns flavivírus (como HCV) e alguns retrovírus (HTLV e SIV), que podem ou não conter o códon de iniciação, sendo esta uma das características consideradas para a classificação das três classes de IRES:
Tipo I: são traduzidos de maneira escassa em RRL (lisado de reticulócito de coelho). Necessitam de um escaneamento 5′-3′ do ribossoma até o códon de iniciação. Exemplos: enterovírus e rinovírus
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e aphtovírus
Tipo III: não é traduzido em RRL. Seu IRES também abrange o códon de iniciação. Exemplo: vírus da hepatite A.
Embora inicialmente tenham sido descritos em vírus, também foi observada a presença de IRES em RNAm celulares e funcionam preferencialmente quando a tradução cap dependente é inibida, como em casos em que a célula passa por situações de estresse, apoptose, mitose e diferenciação. Portanto, aparecem em poucos RNAm celulares, tais como aqueles que expressam fatores de crescimento, proteínas ligadoras de RNA, fatores de transcrição, inibidor de apoptose e o RNAm do próprio eIF4G.
Todos os IRES necessitam de determinados ITAF (IRES trans-activator factors), que são fatores de transativação de IRES e agem em conjunto ou individualmente e não estão presentes em todas as células. Esses ITAF reconhecem estruturas secundárias-padrão e são responsáveis pela funcionalidade do IRES.
Após a descoberta dessas peculiaridades do 5′ UTR, pôde-se, enfim, cogitar uma possibilidade plausível que explicasse a atenuação do poliovírus vacinal produzido por Sabin e colaboradores, em 1954. Sabe-se que esses vírus atenuados são replicados facilmente no sistema digestório e induzem imunidade contra a infecção. Em uma posterior análise da sequência do vírus vacinal, observou-se que a atenuação ocorria devido a mutações pontuais, especialmente na região 5′ UTR dentro da sequência do IRES, como também em genes do capsídeo. Foi observado que a atenuação está diretamente associada à baixa neurovirulência e já foi descrito que a mutação pontual na sequência do IRES dos 5′ UTR causa um defeito na tradução proteica viral nas células do cérebro e da medula espinhal. A replicação reduzida nesses sítios poderia explicar a neurovirulência atenuada dos poliovírus vacinais.
Uma teoria que tenta explicar esse baixo nível de replicação no sistema nervoso baseia-se nos conceitos vistos anteriormente: uma mutação pontual na sequência do IRES causaria uma mudança na sua estrutura secundária, o que impediria o reconhecimento dessa estrutura pelas ITAF específicas desse tipo celular, enquanto nas células do sistema digestório, essa mudança estrutural não afetaria o reconhecimento do IRES por outra gama de ITAF.
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Figura 4.9 A. Montagem do complexo de iniciação da tradução em RNAm celulares. No esquema proposto, está representada a montagem dos fatores de início de tradução e da subunidade ribossomal 40S a partir do reconhecimento da estrutura cap na extremidade 5′ dos RNAm celulares. B. Consequências da clivagem do eIF4G pela protease 2A. Durante a infecção por poliovírus, a protease viral 2A cliva o fator de iniciação da tradução do eIF4G. Esse evento inibe a montagem da subunidade ribossomal 40S nos RNAm celulares, uma vez que o reconhecimento do cap já está inibido. A tradução não será inibida a partir do RNAm viral, uma vez que a porção carboxiterminal do fator eIF4G clivado reconhecerá a estrutura IRES, presente no RNAm viral e haverá a montagem da subunidade ribossomal 40S para o início da tradução.
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