Estudo por Western blot

Foram utilizados 5 casos de cada tumor para esse estudo, excetuando-se os subtipos que apresentavam amostra com quantidade de casos inferior a 5, para estes, foram utilizados 3 casos. A técnica do Western blot foi realizada como descrito primordialmente por Towbin et al. (1979) com modificações. O extrato de proteína foi fracionado por eletroforese usando gel a 12% e transferido para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories, Califórnia, EUA). A transferência foi realizada pelo método de transferência úmida. O método completo para obtenção dos resultados estava de acordo com os protocolos descritos a seguir.

Antes de proceder a extração de proteínas foi utilizado o protocolo de desparafinização para seções de tecido a partir de uma amostra fixada em formol e embebidas em parafina da Qproteome FFPE Tissue Handbook ® (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany). As etapas para desparafinização que foram utilizadas no presente estudo consistiram em:

1. Foram cortadas em micrótomo 10 seções seriadas de 14μm de espessura do mesmo bloco;

2. As seções dos casos foram colocadas em tubos de coleta de 1,5 ml (tipo Eppendorf);

3. Foi pipetado 1ml de xileno em cada tubo. Utilizando vórtex vigorosamente por 10 segundos seguido de incubação durante 10 min;

4. O tubo foi centrifugado em uma microcentrífuga em velocidade máxima por 2 min. O sobrenadante foi removido para descarte cuidadosamente;

5. As etapas 3 e 4 foram repetidas duas vezes;

6. Foi pipetado 1ml de etanol a 100%, seguido de etanol 96% e etanol 70% nos tubos contendo o pellet. Em seguida, utilizou-se o vórtex vigorosamente por 10 segundos seguido de incubação durante 10 min para cada etanol;

7. O tubo foi centrifugado em uma microcentrífuga em velocidade máxima por 2 min após cada incubação com etanol. O sobrenadante foi removido para descarte cuidadosamente após cada fase sem desmanchar o pellet;

8. As etapas 6 e 7 foram repetidas duas vezes;

Observação: Para cada centrifugação das etapas descritas, o peso e volume dos tubos foram os mesmos e a centrifugação aconteceu em uma temperatura controlada de 20 a 25°C.

Para obtenção final e purificação do extrato total de proteínas de cada amostra, foi utilizado um tampão de extração e um protocolo modificado a partir da metodologia sugerida por Kawashima et al. (2014) para extração a partir de uma amostra tecidual fixada em formol e embebida em parafina. As etapas para extração final e purificação que foram utilizadas no presente estudo consistiram em:

1. Os pelletes provenientes da desparafinização foram triturados com gral e pistilo e massa celular resultante foi acondicionada em tubos de 1,5 ml; 2. Foi pipetado 400μl de tampão de extração (Tris-HCl, 2% de SDS, pH 8.0) em

cada tubo contendo o pellet triturado de cada caso;

3. Foi utilizado o vórtex vigorosamente por 60 segundos seguido de incubação em gelo por 5 min;

4. Os tubos foram incubados no Thermoblock (AccuBlock-Labnet) a 90°C por 90 min, sendo utilizado o vórtex por 20 segundos a cada 20 min;

5. Após a incubação da etapa 4, os tubos foram refrigerados a 4°C durante 2 min;

6. Os tubos foram centrifugados por 25 min a 14.000 x g a 4°C. O sobrenadante contendo as proteínas extraídas (Extrato final) foi transferido para um novo tubo de coleta de 1,5 ml.

Para otimização dos resultados após a extração final das proteínas foi realizada a precipitação e concentração de proteínas seguindo as etapas:

1. Foi adicionado ao tubo contendo a amostra, três volumes de acetona absoluta gelada;

2. As amostras foram incubadas a -20ºC por um período overnight;

3. No dia seguinte as amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 4ºC na velocidade máxima ou 14.000x g;

4. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi colocado em centrífuga a vácuo (speed vac) por 5 minutos a 30ºC;

5. O pellet foi ressuspendido em ureia para quantificação;

6. A quantificação das proteínas foi realizada pelo método automatizado do Qubit (Thermo Fisher Scientific, US) de acordo com as instruções do fabricante;

7. A amostra quantificada foi ressuspendida em Laemmli buffer (7M) pronta para eletroforese ou a amostra seguia para armazenamento no freezer a - 80ºC.

As etapas subsequentes são referentes à técnica do Western blot propriamente dita, sendo o protocolo estabelecido previamente otimizado.

1. Foi preparado gel de poliacrilamida a 12% conforme protocolo laboratorial pré-estabelecido.

2. Obteve-se uma alíquota em um volume de 1:1 de proteínas (geralmente 20μg) com o tampão de carregamento Laemilli 2x; para promover completa homogeneização as amostras foram aquecidas a 95ºC por 5 min; 3. O gel foi submerso no tampão de corrida 1x;

4. Foram aplicadas a mistura de proteínas no gel de eletroforese;

5. Foi adicionado 10µl de marcador de peso molecular (Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards #1610375 - Bio- Rad, Laboratories, Califórnia, USA);

6. O gel foi corrido a 80V (200mA) até que as proteínas alcançassem a interface entre o gel de empilhamento e o de resolução;

7. Ao atingirem o gel de resolução, a voltagem foi aumentada para 100V (200mA) por 120 min;

8. Antes da transferência, a membrana foi hidrofilizada com Metanol PA por 60 segundos seguido de tampão de transferência;

9. O gel foi removido do tampão de corrida e incubado em tampão de transferência 1x por 15 minutos.

10. Os papéis-filtro foram incubados em tampão de transferência 1x;

11. Um sanduiche foi montado para transferência com a membrana, gel e papel filtro respeitando a posição do cátodo e ânodo;

12. A cuba para transferência foi preenchida com tampão de transferência 1x até a marca mais superior;

14. A transferência foi promovida por 150 min a 90V e 200mA;

15. Para certificação de que houve proteínas transferidas para membrana, foi utilizada a coloração da membrana pelo método de Vermelho de Ponceau; 16. A membrana foi lavada brevemente com TBS 1x;

17. A solução de bloqueio foi incubada por 60 min sob agitação;

18. A diluição dos anticorpos primários (Anti-ALDH1, SOX2 e β-actina) foi realizada em leite desnatado numa diluição de 1:1000, 1:500 e 1:1000 respectivamente;

19. A incubação dos anticorpos primários aconteceu por 1 hora sob agitação e posteriormente a 4ºC overnight;

20. O anticorpo primário diluído foi removido para seu recipiente de diluição (podendo ser reutilizado até 4x); seguido por 4 lavagens durante 5min usando TBS-Tween 20, mudando os contêineres das membranas;

21. O padrão da diluição do anticorpo secundário (anti-rabbit) varia de acordo com o fabricante. No presente estudo, foi estabelecido um padrão de 1:1000;

22. O anticorpo secundário foi incubado por 180 min em temperatura ambiente sob agitação;

23. Foram realizadas 4 lavagens por 5 min usando TBS-Tween 20, mudando os contêineres das membranas;

24. Para etapa final, as membranas foram incubadas com a solução de revelação em proporção 1:1 (Clarity Western Ecl - Bio-Rad Laboratories, Califórnia, USA) durante 5 min sob agitação;

25. As membranas foram submetidas ao Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Califórnia, USA) para proceder a revelação em “Protein Blots”;

26. O marcador de peso molecular foi revelado posteriormente na função “Colorimetric”; então, deverá haver um “Merge” entre “Protein Blots” e “Colorimetric”.

Para análise da expressão das proteínas através do estudo por Western blot, os níveis de expressão para cada proteína de interesse foram normatizados usando β-actina como controle de carga. Os valores relativos de expressão foram obtidos para dois experimentos independentes. A visualização de bandas e a densitometria foram realizadas através de leitura no ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Califórnia, USA).