ANÁLISE DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MARCADORES DE CÉLULAS TRONCO TUMORAIS (ALDH-1 e SOX-2) E AS CARACTERÍSTICAS CLINICOPATOLÓGICAS DE NEOPLASIAS DE
GLÂNDULAS SALIVARES
NATAL/RN 2019
ANÁLISE DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MARCADORES DE CÉLULAS TRONCO TUMORAIS (ALDH-1 e SOX-2) E AS
CARACTERÍSTICAS CLINICOPATOLÓGICAS DE NEOPLASIAS DE GLÂNDULAS SALIVARES
NATAL/RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Alberto Moreira Campos - -Departamento de Odontologia
Silva, Leorik Pereira da.
Análise da relação entre a expressão de marcadores de células tronco tumorais (ALDH-1 e SOX-2) e as características clinico patológicas de neoplasias de glândulas salivares / Leorik Pereira da Silva. - 2019.
162f.: il.
Profª. Drª. Lélia Batista de Souza.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral, Natal, 2019.
1. Glândulas salivares - Tese. 2. Neoplasias - Tese. 3. Células tronco - Tese. 4. Imuno-histoquímica- Tese. 5. Western blot - Tese. I. Souza, Lélia Batista de. II. Título.
RN/UF/BSO BLACK D65
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL – PPGPO
LEORIK PEREIRA DA SILVA
ANÁLISE DA RELAÇÃO ENTRE A EXPRESSÃO DE MARCADORES DE CÉLULAS TRONCO TUMORAIS (ALDH-1 e SOX-2) E AS
CARACTERÍSTICAS CLINICOPATOLÓGICAS DE NEOPLASIAS DE GLÂNDULAS SALIVARES
NATAL/RN 2019
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Patologia Oral.
Dedico este trabalho ao Deus maravilhoso que nunca me deixou sozinho. Esse Deus está acima de qualquer religião que seja torpe, medíocre ou insana.
“...Dono de toda ciência, sabedoria e poder, Antes que o haja houvesse; Ele já era Deus; Se revelou ao seus; Do crente ao ateu; Ninguém explica Deus...”
Clóvis Pinho
Com todo amor e gratidão, dedico este trabalho aos meus anjos e avós, Lourdes e Zé Pereira (In memoriam), bem como a toda minha amada família. Minha
família é meu tudo, sigo por eles e com eles, sempre!
Dedico este trabalho também a todos os pacientes acometidos pelo câncer e seus
familiares, que depositam em nós, profissionais de saúde, toda sua confiança.
Aproveito para pedir perdão pela nossa ciência, que apesar de tão evoluída, ainda não sana as dores de todos.
“Os rios não bebem sua própria água; as árvores não comem seus próprios frutos. O sol não brilha para si mesmo; e as flores não espalham sua fragrância para si. Viver para os outros é uma regra da natureza (…)
A vida é boa quando você está feliz; mas a vida é muito melhor quando os outros estão felizes por sua causa”.
outrora afirmei, eu não tive tudo que quis, mas eles me deram tudo que podiam e foi suficiente para que eu entendesse o que é amor incondicional. Da mesma forma, agradeço com muito amor a Maria Valentina, nossa princesa.
À minha amada avó Lourdes, meu anjo da guarda materializado, pilar da nossa família, a mulher mais forte que já conheci. Nós devemos tudo a ela e ao meu avô Pereira, cada um amando do seu jeito, mas protegendo e incentivando sempre. Às minhas Tias Vera e Tereza, que foram também minhas mães, a quem eu devoto muito amor e admiração.
Aos meus tios Kennedy e Kleber, e a minha tia Rilma por todos os ensinamentos e apoio. Tia Rilma foi uma das minhas primeiras professoras, rígida e dedicada me ensinou os primeiros passos no caminho do saber. Deixo aqui também um agradecimento e saudade imensa à minha amada Livramento (mentinha), uma alma incentivadora e amorosa a quem sempre vou atribuir o exemplo maior de doçura e amor ao próximo. A todos os meus primos, primas e amigos de infância, que contribuíram para uma infância feliz e raiz.
Eu precisaria de mais três ou quatro reencarnações para agradecer o apoio e carinho da Profa. Dra. Ana Paula Sobral. Muito obrigado por toda sua força, lucidez e amor à docência. Sou um fã incondicional e não canso de repetir que se eu for metade do que ela é, eu já serei muito realizado. Tenho muito orgulho de ter conquistado sua admiração e amizade, não só porque a admiro profissionalmente, mas porque a admiro e amo como o ser humano lindo que é. Grande Diva.
Ao meu amigo, George Nascimento, confidente, guia, inspirador, incentivador e chateador, às vezes (Mestre do meu barco, risos). Muito obrigado por tanto!!! Teria sido muito difícil chegar até aqui, talvez impossível se não fosse seu companheirismo e incentivo constantes nesses quase 10 anos de amizade. Eu não tenho muitos amigos, mas tenho amigos como você que valem por dezenas. Te
A minha amada orientadora Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, quanto orgulho dessa mulher brasileira, nordestina, cientista, professora e mãe dos que se permitem adotar. Eu não posso falar do orgulho só por minha parte, tenho certeza que o sentimento de carinho, admiração e orgulho é bem mais amplo e extensivo a muitos Patologistas Orais do Brasil e mundo afora. Muito obrigado por tudo Dra. Lélia, por todo incentivo e amor pela nossa Patologia e seus alunos. Falar de Patologia Oral como ciência forte, sólida e indestrutível, é falar seu nome. Obrigado por nunca ter desistido. Publicamente gostaria de me desculpar por qualquer coisa que eu tenha feito e não foi de seu agrado, nunca foi minha intenção. A senhora pode contar sempre com minha amizade e lealdade.amo, Geo.
Agradeço aos meus amigos inteligentes e companheiros. Sou sortudo por ter convivido e aprendido com eles, orgulho de ter cativado essas amizades; logo, eu que não cativo muitos. Amo vocês de verdade. Luiz Arthur, muito obrigado por toda sua verdade, forma bruta de amar e toda essa nossa ligação sobrenatural; um sabe o que o outro pensa, mesmo há 542km de distância. Marianna Serpa, minha dupla intelectual, que nunca se ofendeu com minhas grosserias; sua companhia é sempre de muita luz e amor. Jefferson,
há menos tempo). Thalita, a melhor amiga de rolês (principalmente gastronômicos), companheira e verdadeira, fez da minha passagem em Natal muito mais leve e feliz nos primeiros anos. Mara, minha amiga forte e cangaceira, que respeito e admiro muito pela sua verdade, sinceridade e companheirismo. Amanda, que às vezes é doçura, às vezes é agonia, mas sempre é Arte e Música; ela sempre me indicará uma música para cada momento da vida, é sua forma de amar. Hugo, por toda sua hospitalidade, apoio e companheirismo desde sempre. Angel e Eduardo, apesar da distância física, nossa ligação de carinho é inquebrável. Patrícia e Rodrigo, obrigado pela lucidez e convívio harmônico. A ordem de citação neste parágrafo não tem nada a ver com ordem de importância afetiva, eu estava chorando ao escrever e fluiu naturalmente. Contem comigo por toda vida.
Aos meus alguns amados, outros nem tanto, colegas de pós-graduação. Tenho um carinho enorme por muitos; nosso convívio foi muito enriquecedor e divertido nos últimos anos. Não citarei todos os nomes para não ser injusto e esquecer alguém. Entretanto, não poderia deixar de falar que tenho um carinho imenso pelos amados da turma de Carla. Em especial à Fernanda, menina brilhante e verdadeira que foi minha fiel companheira e amiga no último ano da saga. A Marcelo, Dáurea e Gustavo pela parceria na equipe dos filhos de Dra. Lélia.
Este trabalho de tese seria incompleto se nós não tivéssemos uma equipe. A ajuda fundamental da nossa querida Maria Luiza, dedicada, competente e inteligente; muito obrigado por tudo, por cada p<0.05, tu és uma inspiração. Também não poderia deixar de mencionar meu amigo, amadíssimo, calmíssimo (SQN), o maior cientista que já conheci, Aquiles Sarmento. Eu não teria nem o “W” do nome Western blot se não fosse seu brilhantismo e incansável desejo de saber e ensinar. Muito obrigado por tanto! Eu aprendi em um ano de laboratório com você o que levarei uma década para processar. Obrigado pela sua amizade e companhia dentro e fora dos laboratórios. Ao meu querido Breno Washington que foi indispensável para obtenção de dados clínicos para minha tese, muito obrigado pela sua lealdade, carinho e compromisso com nosso estudo.
Gostaria de deixar registrado o meu eterno agradecimento a todos os professores do ensino básico que passaram pela minha vida, em especial tia Helena, Maria José, Rosileide e Inês. Eu jamais esqueceria o nome delas, tampouco esqueceria toda dedicação aos meus primeiros anos de vida acadêmica. Mulheres guerreiras, todas professoras de escolas públicas. Me ensinaram muito mais do que números e letras, me ensinaram que é possível fazer a educação dar certo, ainda que os únicos recursos que elas tivessem fossem o amor, lápis e papel. É muito fácil ser bom tendo tudo, quero ver ser bom professor tendo o que elas tinham e mesmo assim conseguir ensinar tanto.
A todos os outros professores que encontrei no ensino fundamental, médio e na graduação. A uns tenho eterna devoção; a outros, a gratidão de me ensinar a não ser parecido com eles. Gratidão e carinho, em especial aos professores de graduação: Márcia da Silveira, Roberto Santos, Maria José, Emanoel Sávio, Júlio Brando, Miguel Alvaci, Nelson Loretto, Sandra Moraes, Silvia Sarinho, Gerhilde Callou e Vera Pimentel.
Hébel Galvão, Ana Miryam, Bruno Gurgel, Lélia Maria, Kênio Lima, Carlos Augusto e Leão Pereira Pinto. Eles foram mais que professores, foram atenciosos e companheiros até quando precisei por motivos pessoais. Tenho que deixar registrado um agradecimento especial à Profa. Patrícia Teixeira por todo carinho e apoio durante essa jornada. Também gostaria de deixar registrado que a Profa. Márcia Miguel é uma malvada favorita, ela nos incentiva diariamente a buscar excelência e sem ela não haveria tantas noites mal dormidas, seguidas por banho de mar após as sabatinas imunológicas. Muito obrigado a todos vocês por ajudarem a construir o meu sonho. Vocês me ensinaram durante esses seis anos nossa arte, nosso ofício, a Patologia Oral.
Agradeço à Universidade Federal do Rio Grande do Norte; tenho muito orgulho de ter estudado aqui. Aos funcionários maravilhosos, Hévio, Sandra, Gracinha, Ricardo, Beth, Idel, Lurdinha e todos os outros. Sentirei muita saudade de toda essa equipe que diariamente faz a pós-graduação acontecer nos bastidores. Tenho muita sorte de ter encontrado vocês na jornada, principalmente Hévio e Sandrinha que me mimaram e nunca me disseram um não, sempre prontos para me ajudar.
Ao HCP e seus prestativos funcionários do SAME, CEP e setor de Patologia, assim como aos Patologistas Dra. Mariana Borges e Dr. Sérgio Moura por todo apoio e disponibilidade na obtenção da amostra.
Ao CNPq e a CAPES que forneceram as bolsas de estudos para que eu realizasse esse sonho. Saliento que não foi um favor. Eu estou pronto para trabalhar pelo nosso País.
“Não há no mundo exagero mais belo que a gratidão.” Jean de la Bruyere
Tenho morrido muitas vezes. Depois, respiro fundo, lavo o rosto, sigo em frente.
Não é fácil morrer, difícil é renascer, fingir-se de sol, cegar a lua, beber o mar. Detestável seria ter a covardia dos que me mataram. Eu sigo renascendo, eles seguem covardes. Pedro Munhoz
“Não, Não Me Arrependo de Nada Nem o bem que me fizeram Nem o mal, tudo isso, tanto faz para mim! Está pago, varrido, esquecido; Varridos os amores E todos os seus temores Varridos para sempre Recomeço do zero Não Me Arrependo de Nada...” Trecho traduzido da música: “Non, Je Ne Regrette Rien Édith Piaf
ao tratamento, recidiva e óbito em tumores de glândula salivar não são totalmente conhecidos. Nesse sentido, é importante ressaltar que as células-tronco (CT) dentro de um tumor (CTT) estão relacionadas com a tumorigenicidade e progressão em neoplasias humanas. Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão de marcadores relacionados às CT (ALDH-1 e SOX-2) em neoplasias de glândula salivar e verificar se suas expressões apresentam associação com dados clinicopatológicos e desfecho dos pacientes. Foram selecionados 103 casos de neoplasias malignas (25 CME; 15 CCA; 13 CAC; 10 ACP; 13 ACSOE; 8 CEME; 7 CAEXAP; 5 CDS; 4 ACCB; 3 CCC) e 51 casos de neoplasias benignas (25 AP; 9 MIO; 7 TW; 5 ACA; 5 ACB). Os dados obtidos foram analisados no software Statistical Package for Social Science, GraphPad Prism e STATA. O nível de significância de 5% foi adotado para os testes estatísticos (p<0.05). Os pacientes do estudo foram principalmente do sexo masculino, com média de idade de 52 anos; a parótida foi o sítio anatômico mais afetado. A maioria das neoplasias malignas, foi classificada como T1-T2, N0 e M0. A expressão das proteínas foi avaliada através de imuno-histoquímica e confirmadas por meio de Western-blot, verificando-se que os resultados foram semelhantes entre as técnicas e que estavam correlacionados estatisticamente, tanto para SOX-2 (p<0.001) quanto para ALDH-1 (p=0.039). Em relação a expressão da SOX-2, a maioria dos tumores benignos foi negativa (n=39; 76.5%), sendo constatada expressão apenas nos tumores sem diferenciação mioepitelial (ACA e TW) (p<0.0001). Em contraparte a maioria dos tumores malignos estudados foi positiva para SOX-2 (n=54; 52.4%) sendo esse resultado estatisticamente significativo (p=0.002). Também foi evidenciada que essa expressão ocorreu em casos sem diferenciação mioepitelial (p=0.006) principalmente em CME e CCC. Não foram evidenciadas associações estatisticamente significativas entre a expressão de SOX-2 e parâmetros clínicos. A proteína ALDH-1 esteve frequentemente expressa no parênquima de neoplasias malignas (n=88; 85.6%) e benignas (100%). De maneira geral, a expressão da ALDH-1 no parênquima não se associou com parâmetros clínicos das neoplasias malignas, entretanto, os casos de CME com alta expressão no parênquima estavam associados com tumores de estadiamento clínico avançado (p=0.047). Foi constatada expressão da ALDH-1 em células do estroma tumoral, principalmente de neoplasias malignas (n=67; 65.0%), estando associada com metástase em linfonodos (p=0.032), estadiamento clínico avançado (p=0.008), recorrência tumoral (p=0.006) e óbito (p=0.013). A sobrevida global e livre de doença em 5 e 10 anos foi menor em pacientes diagnosticados com CAC, estadiamento clínico avançado, que apresentaram recorrência e com expressão estromal de ALDH-1. Destaca-se que na análise multivariada, o estadiamento clínico avançado e expressão estromal da ALDH-1 representaram fatores prognósticos independentes na sobrevida livre de doença. Com base nos resultados apresentados pode-se concluir que o perfil que caracteriza as CTT apresenta variações nos diferentes tumores de glândula salivar. A expressão diferencial da SOX-2 e ALDH-1 nessas neoplasias sugere que existem subtipos diferentes de CTT que podem ser ativadas por vias moleculares distintas. Conclui-se também que a presença de marcação estromal para ALDH-1 caracteriza células com perfil de CT mesenquimais que podem estar diretamente relacionada com o comportamento biológico e progressão de tumores malignos em glândula salivar.
Palavras-chave: Glândulas salivares; Neoplasias; Células tronco; Imuno-histoquímica; Western blot.
treatment response, recurrence, and death in salivary gland tumors are not fully known. In this matter, stem cells (SC) within a tumor (TSC) are related to tumorigenicity and progress in human neoplasms. As such, the aim of this study was to evaluate the expression of SC-related markers (ALDH-1 and SOX-2) in salivary gland neoplasms and their possible association with clinicopathological data and patient outcomes. We selected 103 cases of malignant neoplasms (25 mucoepidermoid carcinoma; 15 acinic cell carcinoma; 13 adenoid cystic carcinoma; 10 polymorphous adenocarcinoma; 13 adenocarcinoma NOS; 8 epithelial-myoepithelial carcinoma; 7 carcinoma ex pleomorphic adenoma; 5 salivary duct carcinoma; 4 basal cell adenocarcinoma; 3 clear cell carcinoma) and 51 cases of benign neoplasms (25 pleomorphic adenoma; 9 myoepithelioma; 7 Warthin tumor; 5 canalicular adenoma; 5 basal cell adenoma). Data were analyzed in Statistical Package for Social Science, GraphPad Prism and STATA softwares. A significance level of 5% was adopted for the statistical tests (p<0.05). Most patients were male, with a mean age of 52 years, and the parotid was the most common anatomical site. Most malignant neoplasms were classified as T1-T2, N0 and M0. Protein expression assessed by immunohistochemistry and confirmed by western blot showed similar results that were statistically correlated for both SOX-2 (p<0.001) and ALDH-1 (p=0.039). Regarding the expression of SOX-2, most benign tumors were negative (n=39; 76.5%), and expression was only observed in tumors without myoepithelial differentiation (p<0.0001). In the other hand, most of the malignant tumors were positive for SOX-2 (n=54; 52.4%), being statistically significant (p=0.002). The expression occurred in cases without myoepithelial differentiation (p=0.006) mainly in mucoepidermoid carcinoma and clear cell carcinoma. No association was found between SOX-2 expression and clinical parameters. ALDH-1 was frequently expressed in the parenchyma of malignant (n=88; 85.6%) and benign (100%) neoplasms. Overall, the presence of ALDH-1 in the parenchyma was not associated with clinical data of malignant neoplasms; nevertheless, the cases of mucoepidermoid carcinoma with high expression in the parenchyma were associated with advanced clinical stage (p=0.047). The expression of ALDH-1 in tumor stroma cells occurred mainly in malignant neoplasms (n=67; 65.0%), being associated with lymph node metastasis (p=0.032), advanced clinical stage (p=0.008), recurrence (p=0.006) and death (p=0.013). Overall survival and Disease-free survival at 5 and 10 years were lower in patients diagnosed with adenoid cystic carcinoma, advanced clinical stage, recurrence and stromal expression of ALDH-1. Multivariate analysis showed advanced clinical stage and stromal expression of ALDH-1 were independent prognostic factors for disease-free survival. Based on the results, the profile of TSC presents variations in different salivary gland tumors. The differential expression of SOX-2 and ALDH-1 in these neoplasms suggests that there are different subtypes of TSC that can be activated by distinct molecular pathways. Also, the presence of ALDH-1 stromal expression characterizes cells with mesenchymal CT profile that may be directly related to the biological behavior and progress of malignant tumors in the salivary gland.
Keywords: Salivary glands; Neoplasms; Stem cells; Immunohistochemistry; Western blot.
Figura 1. Esquema de classificação do adenocarcinoma polimorfo, desde o reconhecimento como entidade distinta (1983) até a atual classificação
da OMS (2017)... 45
Figura 2. Text mining das principais proteínas citadas em CTT. Utilizando a
ferramenta STRING, uma análise da interação entre artigos científicos
pode ser feita. Pode ser observada relação determinada
experimentalmente entre ALDH1 e SOX-2 e citação que menciona as
duas proteínas juntas na base de dados PubMed... 57
Figura 3. Distribuição absoluta dos pacientes de acordo com o comportamento
biológico do tumor e a idade categorizada por décadas de
vida... 80
Figura 4. Gráfico de barras representando as proporções dos casos negativos e
exibindo imunoexpressão baixa ou alta de SOX-2 no parênquima dos
tumores benignos de glândulas salivares... 84
Figura 5. H&E (A, C, E, G e I). Imunoexpressão nuclear da SOX-2 em neoplasias
benignas de glândulas salivares. Ausência de imunopositividade em AP (B), ACB (D) e MIO (F); Alta expressão em casos de ACA (H); TW (J)
(Barra de escala 50-200 μm)... 85
Figura 6. Gráfico de barras representando as proporções dos casos negativos e
exibindo imunoexpressão baixa ou alta de ALDH-1 no parênquima dos
tumores benignos de glândula salivares... 86
Figura 7. H&E (A, C, E, G e I). Imunoexpressão citoplasmática difusa com
intensidade de moderada a forte da ALDH-1 em neoplasias benignas de glândulas salivares. AP (B); ACB (D); MIO (F); ACA (H); TW (J)
(Barra de escala 50-200 μm)... 87
Figura 8. Gráfico ilustrando a correlação negativa moderada entre os escores de
expressão das proteínas no parênquima dos tumores benignos. O melhor ajuste linear e as correlações estatisticamente significativas estão identificadas nos gráficos. Rho = coeficiente de correlação de postos de
Spearman... 88
Figura 9. Gráfico de barras representando as proporções dos casos negativos e
exibindo imunoexpressão baixa ou alta de SOX-2 no parênquima dos diferentes tipos histopatológicos dos tumores malignos de glândula
salivares... 89
Figura 10. H&E (A, C, E, G e I). Imunoexpressão nuclear de SOX-2 em áreas
focais de neoplasias malignas de glândulas salivares. CAC (B), ACCB
(D), CAEXAP (F) e ACP (J). Ausência de imunoexpressão no CEME
(H); (Barra de escala 50-200 μm)... 91
Figura 11. H&E (A, C, E, G e I). ). Imunoexpressão nuclear difusa de SOX-2 em
neoplasias malignas de glândulas salivares. CME (B), CCA (D) e CCC
(F). Imunoexpressão focal em ACSOE (H) e ausência de
diferentes tipos histopatológicos dos tumores malignos de glândula
salivares... 93
Figura 13. H&E (A, C, E, G e I). Imunoexpressão citoplasmática difusa de
ALDH-1 em neoplasias malignas de glândulas salivares. CAC (B); ACCB (D); CAEXAP (F); CEME (H); ACP (J) (Barra de escala 50-200
μm)... 95
Figura 14. H&E (A, C, E, G e I). ). Imunoexpressão citoplasmática difusa de
ALDH-1 em neoplasias malignas de glândulas salivares. CME (B); CCA
(D) e CCC (F). Imunoexpressão focal em ACSOE (H) e em CDS (J)
(Barra de escala 50-200 μm)... 96
Figura 15. Imunoexpressão difusa de ALDH-1 em células fusiformes no estroma
peritumoral de neoplasias malignas de glândulas salivares. CME (A), CDS (B), CAEXAP (C) e CAC (D) (Barra de escala 100-200
μm)... 97
Figura 16. Gráfico ilustrando a correlação positiva fraca entre os escores de
expressão das proteínas no parênquima dos tumores malignos. O melhor ajuste linear e as correlações estatisticamente significativas estão identificadas nos gráficos. Rho = coeficiente de correlação de postos de
Spearman... 97
Figura 17. Distribuição absoluta dos pacientes de acordo com o comportamento
biológico e a imunoexpressão de (A, B) SOX-2 e (C, D) ALDH-1 no
parênquima e estroma tumoral... 100
Figura 18. Expressão por Western blot da proteína SOX-2 em tumores malignos e
benignos de glândulas salivares. Bandas de expressão da SOX-2 e
β-actina (A); Densitometria normalizada através de β-actina
(B)... 101
Figura 19. Gráfico ilustrando a correlação positiva entre os escores de expressão da
proteína SOX-2 por imuno-histoquímica e Western blot. O melhor ajuste linear e as correlações estatisticamente significativas estão identificadas
nos gráficos... 101
Figura 20. Expressão por Western blot da proteína ALDH-1 em tumores malignos
e benignos de glândulas salivares. Bandas de expressão da β-actina e ALDH-1 (A); Densitometria normalizada através de β-actina
(B)... 102
Figura 21. Gráfico ilustrando a correlação positiva entre os escores de expressão da
proteína ALDH-1 por imuno-histoquímica e Western blot. O melhor ajuste linear e as correlações estatisticamente significativas estão
identificadas nos gráficos... 103
Figura 22. Curva de probabilidade de sobrevida global em cinco e dez anos dos
pacientes com tumores malignos de glândula salivar... 104
Figura 23. Gráficos das curvas de sobrevida global em 5 anos para as variáveis de
tipo histológico, estágio clínico, tratamento e
estroma tumoral... 107
Figura 25. Gráficos das curvas de sobrevida global em 10 anos para as variáveis de
tipo histológico, estágio clínico, tratamento e
recorrência... 108
Figura 26. Gráficos das curvas de sobrevida global em 10 anos para as variáveis de
expressão imuno-histoquímica da SOX-2 e ALDH-1 no parênquima e
estroma tumoral... 109
Figura 27. Curva de probabilidade de sobrevida livre de doença em cinco e dez anos
dos pacientes com tumores malignos de glândula salivar... 111
Figura 28. Curvas de probabilidade de sobrevida livre de doença em cinco anos dos
pacientes com tumores malignos de glândulas salivares segundo parâmetros de tratamento, localização anatômica tipo histológico e
estágio clínico... 113
Figura 29. Curvas de probabilidade de sobrevida livre de doença em cinco anos dos
pacientes com tumores malignos de glândulas salivares segundo parâmetros de expressão imuno-histoquímica da SOX-2 e ALDH-1 no
parênquima e estroma tumoral... 114
Figura 30. Curvas de probabilidade de sobrevida livre de doença em 10 anos dos
pacientes com tumores malignos de glândulas salivares segundo parâmetros de tratamento, localização anatômica tipo histológico e
estágio clínico... 115
Figura 31. Curvas de probabilidade de sobrevida livre de doença em dez anos dos
pacientes com tumores malignos de glândulas salivares segundo parâmetros de expressão imuno-histoquímica da SOX-2 e ALDH-1 no
Página
Quadro 1. Lista da classificação dos tumores de glândulas salivares segundo a atual
classificação dos Tumores de Cabeça e Pescoço da OMS (2017).
Natal-RN, 2019... 29
Quadro 2. Distribuição mundial de tumores de glândula salivar publicados nos
últimos 10 anos (2008-2018). Natal-RN, 2019... 31
Quadro 3. Lista da classificação dos tumores de glândulas salivares segundo a atual
classificação dos Tumores de Cabeça e Pescoço da OMS (2017).
Natal-RN, 2019... 71
Quadro 4. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e
tempo de incubação do anticorpo primário. Natal-RN,
Página
Tabela 1. Distribuição dos tumores de glândulas salivares de acordo com o subtipo
histopatológico e localização anatômica. Natal/RN,
2019... 81
Tabela 2. Distribuição dos tumores de glândulas salivares de acordo com as
variáveis demográficas, clinicopatológicas e comportamento biológico.
Natal-RN, 2019... 82
Tabela 3. Características clínicas, tratamento e desfecho clínico dos tumores
malignos de glândulas salivares. Natal-RN, 2019... 83
Tabela 4. Distribuição da expressão de SOX-2 no parênquima dos tumores
benignos (n=51) de acordo com as variáveis demográficas, localização
anatômica e diferenciação mioepitelial. Natal-RN,
2019... 84
Tabela 5. Distribuição da expressão de ALDH-1 no parênquima e estroma dos
tumores benignos (n=51) de acordo com as variáveis demográficas, localização anatômica e diferenciação mioepitelial. Natal-RN,
2019... 86
Tabela 6. Associação entre a expressão de SOX-2 e as características
demográficas e clinicopatológicas dos tumores malignos de glândulas
salivares (n=103). Natal-RN, 2019... 90
Tabela 7. Associação entre a expressão de ALDH-1 e as características
demográficas e clinicopatológicas dos tumores malignos de glândulas
salivares (n=103). Natal-RN, 2019... 94
Tabela 8. Distribuição da expressão de ALDH-1 de acordo com as variáveis
clinicopatológicas do CME (n=25). Natal-RN, 2019... 98
Tabela 9. Análise univariada da sobrevida global em cinco e dez anos dos
pacientes com tumores malignos em glândulas salivares (n=103), de acordo com as variáveis clinicopatológicas e expressão
imuno-histoquímica de SOX-2 e ALDH-1. Natal-RN, 2019... 105
Tabela 10. Análise multivariada de Cox para o risco de óbito dos pacientes com
tumores malignos em glândulas salivares (n=103). Natal-RN,
2019... 110
Tabela 11. Análise univariada da sobrevida livre de doença em cinco e dez anos dos
pacientes com tumores malignos em glândulas salivares (n=103), de acordo com as variáveis clinicopatológicas e expressão
imuno-histoquímica de SOX-2 e ALDH-1. Natal-RN,
2019... 112
Tabela 12. Análise multivariada de Cox para o risco de recorrência da doença nos
pacientes com tumores malignos em glândulas salivares (n=103).
▪ ACSOE Adenocarcinoma sem outra especificação
▪ ABC ATP-Binding Cassette
▪ ACB Adenoma de células basais
▪ ACP Adenocarcinoma polimorfo
▪ ACL Adenocarcinoma cribriforme de língua
▪ ACLGSM Adenocarcinoma cribriforme de língua e glândulas salivares menores ▪ ACA ▪ APBG ▪ ALDH-1 ▪ AP ▪ ACCB ▪ CAC ▪ CAEXAP ▪ CCA ▪ CCC ▪ CE ▪ CEME ▪ CMIO ▪ CME Adenoma canalicular
Adenocarcinoma polimorfo de baixo grau Aldeído desidrogenase-1
Adenoma pleomórfico
Adenocarcinoma de células basais Carcinoma adenoide cístico
Carcinoma ex-adenoma pleomórfico Carcinoma de células acinares Carcinoma de células claras Carcinoma epidermoide
Carcinoma epitelial-mioepitelial Carcinoma mioepitelial
Carcinoma mucoepidermoide
▪ °C Grau Celsius
▪ CCE Carcinoma de células escamosas ▪ CDS Carcinoma do ducto salivar
▪ Ck Citoqueratina
▪ CSC Sigla do inglês: Cancer stem cell
▪ CT Célula tronco
▪ CTC Célula tronco do câncer ▪ CTT Célula tronco tumoral ▪ CTM Célula tronco mesenquimal ▪ CEP Comitê de Ética em Pesquisa ▪ EGF Fator de crescimento epidérmico
▪ EGRF Receptor do fator de crescimento epidérmico ▪ FISH Hibridização fluorescente in situ
▪ H&E Coloração através da técnica de hematoxilina e eosina ▪ HHF35 Actina músculo específica-35
▪ mA Miliampere
▪ Min Minutos
▪ µm Micrômetro
▪ µl Microlitro
▪ ml Mililitro
▪ NOS Sigla do inglês: Not otherwise specified ▪ OMS Organização Mundial de Saúde
▪ p63 Proteína homóloga a p53
▪ QT Quimioterapia
▪ ROS Espécies reativas de oxigênio ▪ RT
▪ SC
Radioterapia Stem cells
▪ SMA Actina de músculo liso
▪ SG Sobrevida global
▪ SOE Sem outra especificação ▪ SLD Sobrevida livre de doença
▪ SOX-2 Região Y-box 2 determinante de sexo ▪ S-100
▪ TSC
Marcador de origem epidérmica (Solúvel 100%) Tumor stem cell
▪ TNM Sistema de estadiamento (T=Tumor; N=linfonodo; M=metástase)
▪ TW Tumor de Warthin
▪ V Volts
1 INTRODUÇÃO... 24
2 REVISÃO DE LITERATURA... 28
2.1 TUMORES DE GLÂNDULAS SALIVARES: CONSIDERAÇÕES GERAIS... 28
2.2 TUMORES BENIGNOS DAS GLÂNDULAS SALIVARES... 33
2.2.1 Adenoma pleomórfico... 33 2.2.2 Mioepitelioma... 35
2.2.3 Adenoma de células basais... 35
2.2.4 Tumor de Warthin... 36 2.2.5 Adenoma Canalicular... 37
2.3 TUMORES MALIGNOS DAS GLÂNDULAS SALIVARES... 38
2.3.1 Carcinoma mucoepidermoide... 38 2.3.2 Carcinoma adenoide cístico... 40 2.3.3 Carcinoma de células acinares... 42 2.3.4 Adenocarcinoma polimorfo... 43
2.3.5 Adenocarcinoma sem outra especificação... 46
2.3.6 Carcinoma epitelial-mioepitelial... 47 2.3.7 Carcinoma ex-adenoma pleomórfico... 48 2.3.8 Adenocarcinoma de células basais... 49
2.3.9 Carcinoma do ducto salivar... 51
2.3.10 Carcinoma de células claras... 52
2.4 CÉLULAS TRONCO: CONSIDERAÇÕES GERAIS... 53 2.5 CÉLULAS TRONCO TUMORAIS... 55
2.6 PROTEÍNA ALDH-1 (Aldehyde dehydrogenase-1)... 60
2.7 PROTEÍNA SOX-2 (Sex determining Region Y-box 2)... 63
3 OBJETIVO... 66 3.1 OBJETIVO GERAL... 67 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 67 4 MATERIAIS E MÉTODOS... 68 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS... 69 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO... 69 4.3 POPULAÇAO... 69 4.4 AMOSTRA... 70 4.4.1 Critérios de inclusão... 70 4.4.2 Critérios de exclusão... 70
4.7.1 Método imuno-histoquímico... 72
4.7.2 Análise do perfil imuno-histoquímico... 73
4.8 ESTUDO POR WESTERN BLOT... 74 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 78
5 RESULTADOS... 79
5.1 PERFIL DEMOGRÁFICO E CLINICOPATOLÓGICO... 80
5.2 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DE SOX-2 E ALDH-1 EM TUMORES DE
GLÂNDULAS SALIVARES... 83 5.2.1 Imunoexpressão de SOX-2 e ALDH-1 em tumores benignos... 83 5.2.2 Imunoexpressão de SOX-2 e ALDH-1 em tumores malignos... 88 5.2.3 Análise comparativa da imunoexpressão de SOX-2 e ALDH-1 entre
tumores benignos e malignos de glândula salivar... 99
5.3 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO SOX-2 E ALDH-1 POR WESTERN BLOT EM
TUMORES BENIGNOS E MALIGNOS DE GLÂNDULAS SALIVARES... 100
5.4 ANÁLISE DA SOBREVIDA EM TUMORES MALIGNOS DAS GLÂNDULAS
SALIVARES... 103
6 DISCUSSÃO... 118
7 CONCLUSÕES... 136
REFERÊNCIAS... 139 ANEXOS... 156
1. INTRODUÇÃO
As lesões que acometem a região de cabeça e pescoço muitas vezes representam um desafio tanto no diagnóstico, quanto na conduta terapêutica adequada, tendo em vista a grande complexidade e diversidade histopatológica que culminam em variados comportamentos biológicos (HELLQUIST & SKALOVA, 2014; NEVILLE et al., 2016). Essas lesões são categorizadas por grupos de acordo com a origem tecidual, no entanto, alguns grupos demandam contínuas investigações científicas, na tentativa de elucidar o comportamento e refinar as modalidades diagnósticas e terapêuticas, com o intuito de estabelecer tratamentos menos mutiladores e melhorar o prognóstico dos pacientes acometidos.
Dentre os grupos de lesões em cabeça e pescoço, destacam-se as neoplasias das glândulas salivares pela grande variedade de subtipos histopatológicos. Atualmente, a Organização Mundial de Saúde (OMS) publicou algumas mudanças na classificação dos tumores de glândulas salivares, reconhecendo mais de 30 tipos de neoplasias epiteliais primárias (EL-NAGGAR et al., 2017). Apesar da grande quantidade de subtipos, essas neoplasias representam cerca de 3-6% de todos os tumores de cabeça e pescoço, com uma incidência global estimada de 0,4 a 13,5 por 100.000 pessoas anualmente (BARNES et al., 2005; TIAN et al., 2010; GAO et al., 2017). Considerando a ampla variedade de tipos histopatológicos e comportamentos biológicos que estes tumores apresentam, o conhecimento acerca das características biológicas e moleculares é extremamente relevante para fins científicos e clínicos.
Os tumores salivares benignos mais comuns são o adenoma pleomórfico (AP) e o tumor de Warthin (TW), por outro lado, o carcinoma mucoepidermoide (CME) e o carcinoma adenoide cístico (CAC) são os tumores malignos mais prevalentes. Esses tumores malignos representam um grande desafio clínico, uma vez que, tumores de alto grau e algumas variantes histopatológicas apresentam acentuada redução da sobrevida global mesmo após tratamentos radicais (BARNES et al., 2005; NEVILLE et al., 2016). Salienta-se também que mesmo tumores benignos como o AP, quando apresentam longa evolução e histórico de recidivas podem passar por transformação maligna, levando ao carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CAEXAP) que diminui as chances de cura dos pacientes acometidos (MARIANO et al., 2013; SEDASSARI et al., 2015; SILVA et al., 2017a).
A heterogeneidade morfológica e molecular que é observada em tumores sólidos pode ser parcialmente entendida pela teoria da existência de célula tronco (CT) do câncer (CSC) ou CT tumoral (CTT), onde uma pequena subpopulação de células neoplásicas com propriedades semelhantes a células-tronco (CT) daria origem à diversidade de células diferenciadas que constituem toda a população tumoral (CABRERA et al., 2015). Além disso, devido à sua ilimitada autorrenovação e capacidade de diferenciação, a CTT tem sido também associada à iniciação e progressão neoplásica, bem como manutenção do crescimento do tumor, metástase e resistência terapêutica. Essas células demonstram morfologia, perfil de expressão proteica e comportamento próprios (KRESO & DICK, 2014; CABRERA et al., 2015; SEDASSARI et al., 2017).
A identificação de subpopulações de células neoplásicas que expressam marcadores associados a CT e sua correlação com as características clinicopatológicas tem sido evidenciada em trabalhos recentes que estudaram tanto tumores em cabeça e pescoço, quanto em outros sítios (HERREROS-VILLANUEVA et al., 2013; LEE et al., 2014; ZHOU et al., 2014; SEDASSARI et al., 2017). Nesse sentido, a enzima ALDH-1 (Aldeído desidrogenase-1) e a proteína SRY (região de determinação de sexo - Y relacionada ao HMG-box-2), ou simplesmente SOX-2 tem sido utilizadas para identificar células tumorais com características de CT em neoplasias sólidas humanas (ZHOU et al., 2014; ADAMS et al., 2015; SEDASSARI et al., 2015; SEDASSARI et al., 2017).
O papel dos marcadores relacionados às CT em neoplasias de glândulas salivares precisa ser mais investigado, tendo em vista que a célula tumoral com perfil de CT tem sido relacionada em diversas neoplasias humanas com a invasão do tumor, recorrência, metástase e baixa resposta terapêutica que levam a diminuição da sobrevida dos pacientes acometidos. Até o momento poucos estudos avaliaram a influência das CTT em diferentes subtipos de tumores de glândulas salivares. Baseado no exposto, o presente estudo teve como objetivo analisar a expressão de marcadores relacionados com CTT (ALDH-1 e SOX-2) em vários subtipos de tumores epiteliais de glândula salivar com o intuito de compreender se a expressão desses marcadores e consequente caracterização de CTT pode estar envolvida com o comportamento biológico desses tumores.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Tumores de glândulas salivares: Considerações gerais
As glândulas salivares são glândulas exclusivamente exócrinas, de eliminação merócrina do conteúdo produzido e de origem a partir do epitélio oral primitivo (ectoderma) (EGUSA et al., 2012). As glândulas parótidas, submandibulares e sublinguais são as principais glândulas salivares denominadas de glândulas maiores, em adição, as glândulas salivares menores são numerosas e estão distribuídas na cavidade oral, principalmente em parte do palato, lábios, bochechas e língua. O sistema ducto-túbulo-acinar das glândulas salivares é complexo, sendo morfológica e fisiologicamente semelhante em glândulas maiores e menores (células ductais, mioepiteliais e acinares), o que leva a um potencial variável e diversificado para o desenvolvimento de tumores primários independentemente do sítio anatômico (TIAN et al., 2010; HELLQUIST & SKALOVA, 2014; WANG et al., 2015; EMMERSON & KNOX, 2018).
As neoplasias de glândulas salivares perfazem cerca de 3% a 6% dos tumores da região da cabeça e pescoço. Considerando a ampla variedade de comportamentos biológicos e tipos histopatológicos que estes tumores apresentam, a abordagem deste tema torna-se um desafio (SANTOS et al., 2003; TIAN et al., 2010). A revisão de grandes séries dessas neoplasias mostra que 68% a 80% dos tumores primários de origem epitelial ocorrem em parótida, 7% a 11% em glândula submandibular, menos de 1% em glândula sublingual e de 9% a 23% em glândulas salivares menores. Quanto a sua natureza, de 54 a 79% das neoplasias de glândulas salivares são benignas e de 21 a 46% são malignas. O pico de incidência dos tumores de glândulas salivares ocorre na sexta e sétima décadas de vida (ELLIS & AUCLAIR, 1996; BARNES et al., 2005; TIAN et al., 2010; GAO et al., 2017).
Considerando a ampla variedade de subtipos morfológicos e comportamentos distintos que estes tumores apresentam, a OMS publicou em 2017 (EL-NAGGAR et al., 2017) uma nova classificação de tumores de glândulas salivares que apresenta algumas modificações e inclusões que difere da sua classificação de 2005 (BARNES et al., 2005). A nova lista de tumores epiteliais benignos e malignos primários das glândulas salivares classificados pela OMS pode ser analisada no Quadro 1.
Quadro 1. Lista da classificação dos tumores de glândulas salivares segundo a atual classificação
dos Tumores de Cabeça e Pescoço da OMS (2017). Natal-RN, 2019.
Nota: Os códigos morfológicos são da Classificação Internacional de Doenças para Oncologia (ICD-O ou CID-O). Código de comportamento dos tumores: /0 para tumores benignos; /1 para comportamento não
especificado, limítrofe ou incerto; /2 para carcinoma in situ ou neoplasia intraepitelial de grau III; /3 para tumores malignos. FONTE: EL-NAGGAR et al., 2017.
As principais modificações na atual classificação dos tumores consistiram em inclusão de uma nova entidade e modificações de nomenclatura em outras neoplasias. Em edições passadas da classificação de tumores de cabeça e pescoço da OMS, o atual “adenocarcinoma polimorfo” era nomeado como “adenocarcinoma polimorfo de baixo grau”, pois, se aceitava que esse tumor apresentava um indolente curso clínico. Entretanto, 10 a 33% dos pacientes desenvolvem recorrências locais, 9 a 15% desenvolvem metástases nodais e alguns casos podem se transformar em um tumor extremamente agressivo caracterizando um tumor de alto grau com comportamento
Tipo de Tumor ICD-O
✓ Tumores benignos
Adenoma Pleomórfico 8940/0
Mioepitelioma 8982/0
Adenoma de células basais 8147/0
Tumor de Warthin 8561/0 Oncocitoma 8290/0 Linfadenoma 8563/0 Cistadenoma 8440/0 Sialadenoma papilífero 8406/0 Papilomas ductais 8503/0 Adenoma sebáceo 8410/0
Adenoma canalicular e outros adenomas ductais 8149/0 ✓ Tumores malignos
Carcinoma mucoepidermoide 8430/3
Carcinoma adenoide cístico 8200/3
Carcinoma de células acinares 8550/3
Adenocarcinoma polimorfo 8525/3
Carcinoma de células claras 8310/3 Adenocarcinoma de células basais 8147/3
Carcinoma intraductal 8500/2
Adenocarcinoma sem outra especificação (SOE) 8140/3
Carcinoma do ducto salivar 8500/3
Carcinoma mioepitelial 8982/3
Carcinoma epitelial-mioepitelial 8562/3 Carcinoma ex-adenoma pleomórfico 8941/3
Carcinoma secretório 8502/3
Adenocarcinoma sebáceo 8410/3
Carcinossarcoma 8980/3
Carcinoma pobremente diferenciado (indiferenciado) 8020/3 Carcinoma neuroendócrino de grandes células 8013/3 Carcinoma neuroendócrino de pequenas células 8041/3
Carcinoma linfoepitelial 8082/3
Carcinoma de células escamosas 8070/3
Carcinoma oncocítico 8290/3
clínico impreciso (EL-NAGGAR et al., 2017; MARIANO et al., 2017; SEETHALA & STENMAN 2017). Considerando a variação de comportamento desse tumor, a nova edição (2017) da classificação da OMS abandonou o termo “baixo grau” e agora designa esses tumores simplesmente como adenocarcinoma polimorfo (ACP). Esta modificação ajuda a evitar uma possível confusão de terminologia e facilita a escolha terapêutica para aqueles casos que não são caracterizados como baixo grau. Outras modificações de nomenclatura, incluem o cistadenocarcinoma que foi considerado como um sinônimo de carcinoma intraductal e o adenocarcinoma mucinoso que foi considerado como uma variante do adenocarcinoma sem outra especificação (ACSOE) (EL-NAGGAR et al., 2017).
Em relação ao reconhecimento de uma nova entidade, recentemente foi incluído o carcinoma secretório, que representa uma malignidade de glândula salivar que foi essencialmente diferenciada do carcinoma de células acinares (CCA) e do ACSOE por apresentar grande similaridade com o carcinoma secretor de mama, além de abrigar uma translocação específica t(12;15)(p13; q25) que resulta em um gene de fusão ETV6-NTRK3 (SKALOVA et al., 2010). Segundo a OMS, para padronizar a nomenclatura internacional, a designação oficial para essa entidade atualmente é simplesmente “carcinoma secretório” ao invés de “carcinoma secretório análogo ao mamário” como foi descrito inicialmente. Este tumor tem curso clínico indolente como o CCA, mas pode apresentar uma maior probabilidade de se tornar agressivo e emitir metástase para linfonodos cervicais (até 25%) (EL-NAGGAR et al., 2017; SKALOVA et al., 2010).
Apesar da quantidade de subtipos de tumores salivares, a maioria das lesões são muito raras e outras apresentam incidência e prevalência variáveis de acordo com a região estudada e características gerais da população. O AP representa o tumor benigno mais comum com prevalência entre os tumores de glândula salivar que varia entre 40 e 80% de todos os tumores. O segundo tumor benigno mais comum é o tumor de Warthin (TW) com prevalência significativamente mais baixa. Em relação aos tumores malignos, o CME é a malignidade mais frequente, diagnosticada em aproximadamente 30% de todos os tumores malignos nessas glândulas, seguido pelo CAC e outros subtipos (TIAN et al., 2010; GAO et al., 2017; SILVA et al., 2018). Um panorama global da incidência e prevalência de tumores malignos e benignos de glândulas salivares de acordo com estudos publicados no mundo nos últimos anos, pode ser observado no Quadro 2.
Quadro 2. Distribuição mundial de tumores de glândula salivar publicados nos últimos 11 anos
(2008-2018). Natal-RN, 2019.
FONTE: DA SILVA., et al. 2018.
De maneira geral, clinicamente, os tumores salivares apresentam-se geralmente como um nódulo de crescimento lento, assintomático e que pode tomar grandes dimensões quando não tratado. Na parótida, a maioria dos casos, atinge a região inferior do lóbulo superficial causando um abaulamento sobre o ângulo da mandíbula, ligeiramente abaixo e a frente da orelha. Em estágios iniciais, os tumores de parótida são geralmente móveis, mas quando não tratados, os tumores se tornam mais nodulares e fixos. Quando são benignos raramente causam paralisia facial, mesmo em tumores
País e Continente Autores Casos (n) Ben (%) Mal (%) Tumores benignos mais comuns Tumores Malignos Mais comuns América do Sul Brasil
SILVA et al., 2018 (Multicêntrico) 2,292 57.7 42.3 AP > ACB CME > CAC
VASCONCELOS et al., 2016 (Sul) 109 78.0 22.0 AP > TW CAC > CME = CCA
BITTAR et al., 2015 (Sul) 271 79.3 20.7 AP > TW CME > CCE
FONSECA et al., 2012 (Sudeste) 493 74.8 25.1 AP > TW CME > ACSOE
DE OLIVEIRA et al., 2009 (Centro-oeste) 599 78.3 21.7 AP > TW CAC > ACSOE
Chile ARAYA et al., 2015 259 72.6 27.4 AP > TW CME > CAC = ACSOE
América do Norte
México MEJÍA-VELÁZQUEZ et al., 2012 346 79.2 20.8 AP > TW CAC > CME
Europa
Croácia LUKŠIĆ et al. 2012 779 64.2 35.8 AP > TW CAC > CME
Inglaterra BRADLEY et al., 2013 1,060 86.4 13.6 AP > TW CME > CAC JONES et al. 2008 741 64.9 35.1 AP > ACB CME > CAC
Finlândia BELLO et al.2012 1888 85.1 14.9 AP > TW CAC > CME
África
Camarões SANDO et al., 2016 200 71.8 28.2 AP CAC > CME
Nigéria
LAWAL et al., 2013 413 46.5 53.5 AP > MIO CAC > CME
OCHICHA et al., 2009 76 56.6 43.4 AP CME > ACP = CAC
FOMETE et al. 2015 135 28.9 71.1 AP > ONC CAC > CME
Ásia
China
GAO et al., 2017 (Norte) 7,190 64.73 35.27 AP > TW CME > CAC
WANG et al., 2015 (Nordeste) 2,508 77.1 22.9 AP > TW CME > CAC
WANG et al., 2012 1,154 76.9 23.1 AP > TW CME > CAC
TIAN et al. 2010 (Leste) 6,982 68.0 32.0 AP > TW CAC > CME
LI et al. 2008 (Oeste) 3,461 59.8 40.2 AP > TW CME > CAC
Índia SUBHASHRAJ, 2008 684 62.0 38.0 AP > TW CAC > CME BUSSARI et al., 2016 82 46.3 53.7 AP > ACB CME > CAC
Irã
TAGHAVI et al., 2015 184 35.3 64.7 AP > MIO CME > CAC
TORABINIA et al., 2014 229 55.5 44.5 AP > MIO CME > CAC
JAAFARI-ASHKAVANDI et al., 2013 366 67.8 32.2 AP > TW CAC > CME
SHISHEGAR et al. 2011 392 68.2 31.8 AP > TW CAC > CME
ATARBASHI MOGHADAM et al., 2010 112 75.0 25.0 AP > WT CME > CAC
SAGHRAVANIAN et al.2013 165 51.5 48.5 AP > MIO CME > CAC
Israel BELLO et al.2012 330 66.7 33.3 AP > TW CAC > CME
Sri Lanka TILAKARATNE et al. 2009 713 49.9 50.1 AP > TW CME > CAC
Turquia KIZIL et al., 2013 500 70.8 29.2 AP > TW CAC > CME KARA et al. 2010 121 75.2 24.8 AP > TW CAC > ACSOE
Arábia S AL SARRAJ et al., 2015 314 74 26 AP > TW CME > CAC
maiores. Quando recorrentes são geralmente multinodulares e aparecem clinicamente como múltiplos e pequenos nódulos que à palpação são aparentemente fixos (BARNES et al., 2005; HELLQUIST & SKALOVA, 2014;). Os tumores malignos podem se apresentar como nódulos dolorosos e fixos desde o primeiro momento e quando acometem glândulas salivares menores podem se apresentar ulcerados e com infiltração óssea (BARNES et al., 2005; NEVILLE et al., 2016; EL-NAGGAR et al., 2017).
Uma variável que vem sendo discutida recentemente acerca dos tumores malignos salivares é o fenômeno de transformação de alto grau. Trata-se de uma progressão biológica identificável de uma neoplasia de baixo grau e bem diferenciada para uma neoplasia de alto grau, pouco diferenciada, que apresenta uma zona nítida de transição. A região transformada representa um carcinoma pouco diferenciado ou indiferenciado, com perda de padrões arquiteturais convencionais, áreas de necrose e anaplasia nuclear mescladas com áreas dos tumores convencionais. Esse fenômeno foi descrito em quase todos os tipos de neoplasias de glândulas salivares, incluindo CCA, CAC, CEME, CMIO ACC, ACP e carcinoma secretório. A média de idade para apresentação de um tumor com transformação de alto grau é de 10 a 20 anos mais avançada, além disso, é frequentemente vista em tumores recorrentes ou em glândulas salivares menores. As metástases nodais cervicais são muito mais comuns em casos transformados, quando comparadas às suas contrapartes convencionais (BADLANI et al., 2018)
Em relação à terapêutica, a remoção cirúrgica total do tumor e da glândula afetada representa o tratamento rotineiro para todos os tumores de glândulas salivares benignos ou malignos. Em relação ao tratamento dos tumores malignos em parótidas, a parotidectomia superficial preservando o nervo facial permanece como a modalidade de tratamento recomendada. O tratamento adjuvante (quimioterapia e radioterapia) e a remoção dos linfonodos cervicais são geralmente reservadas para tumores com gradação histopatológica de alto grau ou estadiamento clínico (TNM) avançado. Os fatores que influenciam o desfecho oncológico desses pacientes incluem o grau e tipo histopatológico, o status do tumor primário, o envolvimento linfonodal regional e o uso adjuvante de quimio-radioterapia (EL-NAGGAR et al., 2017; FAISAL et al., 2018).
A radioterapia pós-operatória pode reduzir o risco de recidiva loco-regional e diminui o risco de dano ao nervo facial em casos de recidivas após tratamento cirúrgico com bordas comprometidas. Pode ser recomendado uma dose de 60Gy em frações
diárias de 2Gy, essa dose parece representar um consenso prático. Avanços na técnica de radioterapia, como a radioterapia de intensidade modulada (IMRT) têm sido aplicados ao tratamento desses tumores com sucesso variável, mas não para todos os casos. Infelizmente, para tumores avançados e de alto grau histopatológico, a radioterapia adjuvante não parece melhorar a sobrevida global dos pacientes (EL-NAGGAR et al., 2017; FAISAL et al., 2018).
Não se conhece os mecanismos moleculares que estão associados a uma baixa resposta ao tratamento radio-quimioterápico nos casos de tumores malignos de glândula salivar, no entanto é importante ressaltar que as CT são consideradas resistentes à quimioterapia e à radiação, devido, pelo menos em parte, às taxas mais lentas de proliferação e à função diferencial das proteínas transportadoras (ADAMS et al., 2015). Sendo assim, talvez haja uma quantidade variável de CTT em subtipos diferentes dos tumores salivares que precisam ser melhor investigadas.
2.2 Tumores benignos das glândulas salivares 2.2.1 Adenoma Pleomórfico
O AP é a neoplasia de glândula salivar mais comum e representa aproximadamente 45-60% de todos os tumores diagnosticados em glândulas salivares (TIAN et al., 2010; FONSECA et al., 2012; GAO et al., 2017). A incidência anual é de aproximadamente 2 a 3,5 casos por 100.000 habitantes. Normalmente manifesta-se como um nódulo assintomático e de crescimento lento. Este tumor geralmente ocorre entre a terceira e sexta décadas de vida, mas pode apresentar-se em qualquer idade, com predileção pelo sexo feminino, sendo a glândula parótida o sítio mais comumente acometido (EL-NAGGAR et al., 2017).
Apesar de apresentar etiologia desconhecida, foi relatada que a incidência de AP parece aumentar 15-20 anos após uma exposição à radiação (EL-NAGGAR et al., 2017). Estudos citogenéticos mostraram que aproximadamente 70% dos casos de AP são cariotipicamente anormais, com 25% dessas anormalidades observadas na região 8q12, onde o gene PLAG1 está localizado. Entre as anormalidades associadas ao PLAG1, 40% são a translocação t(3;8)(p21;q12), resultando na formação de um gene de fusão com a beta-catenina 1 (CTNNB1-PLAG1) (EL-NAGGAR et al., 2017; ASAHINA et al., 2019)
Além disso, os genes CHCHD7, LIFR, TCEA1 também foram encontrados como alvos de fusão do gene PLAG1. O gene HMGA, também conhecido como HMGI-C, é bem conhecido como um gene envolvido em rearranjos na região 12q14-15 em AP, representando 8% dos tumores. Até agora, três genes de fusão (NFIB, HMGA2-FHIT, e HMGA2-WNT) foram identificados nesses tumores. Embora aproximadamente metade dos casos de AP não apresente rearranjo cromossômico envolvendo os genes PLAG1 ou HMGA2 e as fusões LIFR-PLAG1 foram relatadas em outros tumores, os genes de fusão PLAG1 e HMGA2 parecem representar características genotípicas específicas do AP. Em casos de AP, os níveis de expressão da proteína PLAG1 são constantemente elevados, independentemente do status de fusão do gene PLAG1 (ASAHINA et al., 2019).
Morfologicamente, há uma dupla população celular (ductal e mioepitelial) onde esses componentes exibem uma ampla variedade de morfologias celulares, incluindo células claras, fusiformes, pavimentosas, basaloides, plasmocitoides e cúbicas. O epitélio usualmente forma cordões ou estruturas semelhantes a ductos. As estruturas ductiformes mostram células cuboidais junto à luz e podem coexistir camadas de células mioepiteliais compondo a espessura da parede. A metaplasia escamosa, por vezes com formação de pérolas de ceratina, poderá ser observada. O componente similar a mesênquima (estroma) é mucoide/mixoide, fibroso, condroide ou hialinizado e, por vezes, esse tecido compõe a maior parte do tumor. Esses tumores podem ser classificados em tumores tipo clássico, rico em estroma ou tipo celular. O material semelhante à cartilagem no estroma do AP é positivo para colágeno II e queratan sulfato. Tecido ósseo também pode se formar no interior dessa cartilagem, ou diretamente por metaplasia óssea do estroma (BARNES et al., 2005; EL-NAGGAR et al., 2017; LOPES et al., 2017). De acordo com Bento et al. (2006) a expressão de proteínas envolvidas na formação de tecidos normais, também pode ser observada em AP. Esses autores mostraram que a fibronectina e tenascina estavam fortemente expressas no estroma fibroso e condroide, moderadamente expressa em estroma hialino e mixoide em AP sugerindo que essas proteínas possam estar envolvidas com a tumorigênese dessa lesão.
As taxas de recorrência são baixas. A ressecção completa garante menor chance de recidivas. O extravasamento extracapsular no transoperatório dos tumores também foi relatado como variável com efeito independente sobre a recorrência tumoral; 26,9% dos tumores perfurados e 80% dos casos com extravasamento recidivaram. A transformação
maligna ocorre em aproximadamente 6,2% dos casos de AP. Recorrências múltiplas, localização profunda do lobo parotídeo, sexo masculino e idade mais avançada do paciente estão associadas ao aumento do risco de malignização (EL-NAGGAR et al., 2017).
2.2.2 Mioepitelioma
O mioepitelioma (MIO) foi primeiramente descrito por Sheldon em 1943. Por muito tempo foi considerado uma variante do AP com predominância de células mioepiteliais, no entanto desde 1991 foi reconhecido como uma entidade distinta pela OMS. Esta neoplasia é rara e representa aproximadamente 1% de todos os tumores das glândulas salivares, acometendo principalmente pacientes na faixa etária dos 30 aos 50 anos. A parótida é a localização mais comum em glândulas salivares maiores e para glândulas salivares menores, o palato é mais frequentemente acometido (KULKARNI et al., 2015; EL-NAGGAR et al., 2017; DA SILVA et al., 2018).
Este tumor é composto por células mioepiteliais que exibem morfologia variável, apresentando-se fusiformes, epitelioides, plasmocitoides e como células claras, podendo conter um número limitado de estruturas ductais (5-10% do componente tumoral). O perfil imuno-histoquímico do MIO é semelhante ao AP. Particularmente os marcadores miogênicos apresentam expressão variável em muitos casos de MIO, enquanto que o S-100, p63, calponina e vimentina são mais amplamente expressos. Esse tumor é encapsulado, bem circunscrito, apresenta menores taxas de recidiva e menor risco de transformação maligna que o AP. O tratamento consiste na excisão cirúrgica conservadora. Apesar de ser mais comum em glândula salivar, este tumor também pode ser encontrado em pele, tecidos moles, traqueia, laringe e trato sino-nasal (DA SILVEIRA et al., 2006; KULKARNI et al., 2015; EL-NAGGAR et al., 2017; DA SILVA et al., 2018).
2.2.3 Adenoma de células basais
O adenoma de células basais (ACB), assim como uma variedade de tumores benignos salivares (tumor de Warthin, oncocitoma, mioepitelioma e adenoma canalicular), eram descritos e frequentemente denominados de “adenomas monomórficos” devido a necessidade de distingui-los histologicamente do AP, que representa o tumor benigno de glândula salivar mais comum (MCMILLAN et al., 1993).
Os ACB correspondem a aproximadamente 1 a 3,7% dos tumores de glândulas salivares. Eles são mais frequentes em pacientes idosos; a média de idade do paciente que apresenta esse tumor varia de 57 anos a 70 anos, com uma ligeira predileção pelo sexo feminino. A maioria dos casos de ACB surge nas glândulas salivares maiores, tendo a glândula parótida como o local mais comum (responsável por mais de 80% dos casos), seguida pela glândula submandibular, sendo considerado extremamente raro em glândulas salivares menores. Esses tumores se apresentam como massas solitárias tipicamente bem definidas e móveis, podem ser evidenciados como múltiplos nódulos e coexistir sincronicamente com cilindromas ou tricoepiteliomas dérmicos (BARNES et al., 2005; EL-NAGGAR et al., 2017).
Histopatologicamente, os tumores mostram uma mistura de quatro padrões: sólido, trabecular, tubular e membranoso. Esses padrões são compostos por células basaloides com citoplasma escasso, bordas celulares indistintas e núcleos redondos a ovais que apresentam frequentemente paliçada periférica. Células grandes com núcleos de coloração mais pálida podem estar presentes no centro dos ninhos basaloides. O padrão membranoso apresenta material hialino proeminente, com gotículas coalescentes intercelulares dentro dos ninhos tumorais. A imunomarcação por pancitoqueratina (AE1/AE3) é positiva em todas as células tumorais, sendo mais intensa nas células ductais, já as células da paliçada (mais externas) são positivas para marcadores miogênicos, indicando uma diferenciação mioepitelial. O tratamento cirúrgico não radical é suficiente para o ACB, sendo raro a notificação de recidivas (BARNES et al., 2005; EL-NAGGAR et al., 2017).
2.2.4 Tumor de Warthin
O tumor de Warthin (TW) ou cistadenoma papilar linfomatoso é apontado como o segundo tumor mais frequente em glândulas salivares, representando 5 a 28% dos tumores benignos, ocorrendo quase exclusivamente na glândula parótida (SAUNDERS et al., 2008; EL-NAGGAR et al., 2017). Clinicamente, apresenta-se como um nódulo assintomático que pode manifestar-se de forma bilateral, principalmente em pacientes do sexo masculino na sexta década de vida. Sua etiologia, assim como dos outros tumores salivares é imprecisa, no entanto, acredita-se estar relacionada ao tabagismo. A exposição à radiação, relação com doenças autoimunes e infecção por EBV também tem sido associada com a tumorigênese dessa neoplasia (ELLIS, 2007; EL-NAGGAR et al., 2017).
Histologicamente, o TW mostra áreas císticas de forma papilar, compostas por células oncocíticas colunares ou cuboidais poliédricas dispostas em dupla camada celular e estroma formado por tecido linfoide maduro com presença de centros germinativos e sem atipia linfocitária. Áreas com focos limitados de células escamosas, mucosas, ciliadas e sebáceas, podem estar presentes nesses tumores. A excisão cirúrgica completa é geralmente suficiente para tratar esses tumores. A taxa de recorrência local é baixa e quando há recorrência, provavelmente seja devido a tumores multifocais ou excisão inadequada. A transformação maligna de um TW é extremamente rara, no entanto, há alguns exemplos relatados de transformação tanto no componente epitelial quanto no componente linfoide (EL-NAGGAR et al., 2017).
2.2.5 Adenoma canalicular
O adenoma canalicular (ACA) é uma neoplasia benigna incomum de glândula salivar que foi reconhecida como uma entidade separada de outros tumores monomórficos somente na segunda classificação da OMS em 1991. Origina-se provavelmente das células de reserva dos ductos salivares principalmente de glândulas salivares menores e acomete comumente o lábio superior. Este tumor compreende cerca de 1-3% de todas as neoplasias de glândulas salivares, sendo mais comum em pacientes do sexo feminino com idade superior a 50 anos (THOMPSON et al., 2015; SILVA et al., 2017b).
Clinicamente, esses tumores apresentam-se como um aumento de volume submucoso de até 3cm, indolor com crescimento lento e cor variando do róseo ao azulado, podendo apresentar-se como nódulo solitário ou múltiplos nódulos (multifocal). Microscopicamente, é constituído por células cúbicas ou cilíndricas que usualmente exibem cordões, fileiras alternadas e separadas que formam estruturas anastomosadas denominadas de canalículos; esse tumor exibe um estroma caracteristicamente paucicelular com aspecto mixoide e bem vascularizado (THOMPSON et al., 2015; SILVA et al., 2017b).
O perfil imuno-histoquímico demonstra uma provável origem a partir do sistema ductal de glândulas salivares, uma vez que se observa uma imunomarcação forte e difusa para o AE1/AE3, S-100 e CK7. Em contrapartida, marcadores miogênicos em células tumorais mostram-se negativos. Tais achados confirmam uma única diferenciação celular em proliferação apenas do tipo ductal/luminal nos casos de ACA. Esse tumor faz
diagnóstico diferencial com o CAC e principalmente com o ACB, no entanto, os achados morfológicos somados aos imuno-histoquímicos são úteis para diferenciá-los. O tratamento mais indicado consiste na excisão cirúrgica conservadora. As recidivas são consideradas raras, no entanto tumores multifocais apresentam maior tendência a recorrências (THOMPSON et al., 2015; SILVA et al., 2017b).
2.3 Tumores malignos das glândulas salivares 2.3.1 Carcinoma mucoepidermoide
O CME representa a neoplasia maligna mais comum das glândulas salivares, correspondendo a aproximadamente 30% de todos os tumores malignos (GAO et al., 2017). Cerca de 60% dos CME ocorrem em glândulas salivares maiores, principalmente em parótidas e 35% em glândulas salivares menores. As glândulas menores do palato e mucosa jugal são as mais acometidas, seguidas de orofaringe, língua e assoalho bucal. Apresenta uma discreta predileção por mulheres, é o tumor maligno mais comum em todas as faixas etárias, no entanto, o pico de incidência é observado a partir da segunda década de vida (BARNES et al., 2005; EL-NAGGAR et al., 2017).
Histologicamente, o CME é composto classicamente por células intermediárias, células epidermoides e células mucosas, mas a presença de células claras, oncocíticas e colunares pode ser observada. As células intermediárias são pequenas, maiores que os linfócitos, redondas ou ovoides com núcleo escasso e escuro com o citoplasma eosinofílico. As células epidermoides podem organizar-se de forma sólida ou em ninhos simulando carcinomas de células escamosas. As células claras podem variar em tamanho e forma, com citoplasma amplo, claro e núcleo pequeno ou vesicular disposto centralmente. As células colunares assemelham-se aos ductos secretórios das glândulas salivares que podem transformar-se em células mucosas. As células mucosas usualmente são grandes e em forma de “balão”, com núcleo pequeno e deslocado para a periferia. Geralmente, as células mucosas mostram positividade para mucicarmim e ácido periódico de Schiff (PAS) (ELLIS & AUCLAIR,1996).
A aparência microscópica do CME depende do grau histopatológico de diferenciação. O CME de baixo grau de malignidade caracteriza-se por estruturas císticas limitadas por quantidade elevada de células produtoras de mucina, além de epidermoides ou intermediárias. Quantitativamente as células mucosas são mais numerosas nos carcinomas de grau intermediário e baixo, que não apresentam grandes áreas celulares
