EXAMES LABORATORIAIS

4.2.1 Avaliação das Atividades Enzimáticas em Sangue Seco em Papel de Filtro

Para preservar a identidade dos voluntários, as amostras de SSPF foram codificadas, utilizando as letras iniciais do nome, data de nascimento e sexo do participante, como exemplo: RGC03091960M.

As análises das atividades da GBA e da quitotriosidase em SSPF foram realizadas no Laboratório dos Erros Inatos do Metabolismo do Hospital das Clínicas de Porto Alegre - RS (HCPA), utilizando a técnica desenvolvida por Civallero, 2006 (MICHELIN et al., 2006).

Amostras de 2ml de sangue venoso periférico foram coletadas do antebraço de cada voluntário, sem necessidade de jejum. A punção venosa para coletar amostras de sangue foi preferida à punção de “ponta-de-dedo” por proporcionar maior quantidade de sangue e permitir a preparação de amostras mais homogêneas e de melhor qualidade para análise. O sangue coletado foi colocado em tubos de ensaio com heparina e homogeneizado. Após a completa homogeneização, uma pequena quantidade do sangue foi aspirada e gotas foram pingadas dentro de quatro círculos delimitados no papel de filtro (903 Protein Saver Card, Whatman Inc., USA). Logo após, as amostras foram secadas ao ar livre por quatro horas e acondicionadas, separadamente, em sacos plásticos, lacrados e enviados em temperatura ambiente pelos Correios para dosagem da atividade enzimática no laboratório de referência (Figura 10). As amostras chegaram ao destino cerca de três dias após a postagem.

Pequenos discos de 3 mm de diâmetro, contendo aproximadamente 3,6µL de sangue, foram destacados das amostras de SSPF e encubados a 37ºC com substrato (4-methylumbeliferyl-h-d-glucoside and 4-Methylumbeliferyl-b-D-N-N0-N00- triacetylchitotrioside) e diluentes apropriados. As amostras foram centrifugadas e submetidas à análise fluorométrica (nanomoles do substrato hidrolizado/h/mL de sangue) (CIVALLERO; MICHELIN, et al., 2006).

Os laudos identificados apenas pelo código foram decodificados pelo investigador e entregues individualmente aos participantes, que tiveram a oportunidade de esclarecer suas dúvidas ao final de cada etapa do estudo.

Figura 10 - Etapas de preparação das amostras de SSPF para análise enzimática. Fonte: Fotos obtidas pelo autor, ano 2007.

4.2.2 Avaliação das atividades _{da β-glucocerebrosidase em leucócitos e da} quitotriosidase no plasma

Para confirmação da suspeita de DG, foram realizadas medidas das atividades da GBA em leucócitos e quitotriosidase no plasma dos voluntários cujas atividades

da GBA em SSPF foram menores do que 2,19 nmol/h/mL. Amostras de 10 ml de sangue venoso do antebraço, sem necessidade de jejum, foram coletadas em tubos de ensaio com heparina para serem centrifugados em centrífuga refrigerada. Dessa forma, os leucócitos foram separados do plasma, congelados a - 300C por 24 horas e enviados em gelo seco, por via aérea, para análise enzimática da atividade da GBA em leucócitos e quitotriosidase no plasma no laboratório do HCPA. O material chegou ao seu destino no prazo máximo de 48 horas e em excelente estado de conservação. As atividades da GBA em leucócitos e da quitotriosidase no plasma foram avaliadas conforme técnicas descritas por Peters, Coyle et al. (PETERS; COYLE, et al., 1976) e de Hollak, Van Weely et al., respectivamente (HOLLAK; WEELY, et al., 1994).

4.2.3 Análise Molecular das Mutações

De início, as amostras de DNA dos indivíduos com maiores suspeitas da DG (GBA em leucócitos<5,6 nmol/h/mg de proteínas) foram extraídas de material colhido por pequena escovação da mucosa bucal (face interna da bochecha). O rastreamento das mutações (N370S, L444P, G377S e 55del) foi realizado no Departamento de Genética e Biologia Evolutiva da Universidade de São Paulo (São Paulo, Brasil), utilizando o método descrito por Richards et al. (1993). O DNA foi extraído e amplificado conforme técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) ou Reação em Cadeia da Polimerase com primers específicos para cada mutação. Em seguida, foi feita a digestão do produto de PCR com enzima de restrição (para cada mutação foi utilizada uma enzima específica). Depois da digestão da endonuclease,

os fragmentos foram submetidos à eletroforese em gel de policrilamida a 12% (N370S e G377S) ou eletroforese em gel de agarose a 2% (L444P e 33del) (ROZENBERG; ARAUJO, et al., 2006).

Para esclarecer dúvidas diagnósticas após o rastreamento das quatro mutações mencionadas (excluir a possibilidade da presença de outras mutações), amostras de sangue dos indivíduos com provável DG (atividade GBA≤4,0 nmol/h/mg de proteína) foram encaminhadas para sequenciamento do DNA da região do gene codificador da GBA (1q21) no Laboratório de Desenvolvimento Molecular do Departamento de Pediatria da Universidade de Washington, Estados Unidos da América. Para isso, foi usado sangue seco em papel de filtro FTA Classic Card (fabricado pela Whatman - Whatman), por permitir uma análise eficaz das mutações e pela facilidade de envio de amostras para centros especializados a longas distâncias, conforme descrito por Devost e Choy (DEVOST; CHOY, 2000). O sequenciamento do DNA realizado é capaz de identificar até cerca de 95% das mutações, entretanto, muitas vezes, não pode identificar deleções ou rearranjos que interferem com as ligações dos sítios nos primers.

4.2.4 Análise dos Dados

Os dados coletados foram submetidos à análise descritiva (distribuição de frequência e de tendência central), seguida por análise comparativa com o teste de Mann-Whitney e o teste do qui-quadrado para variáveis categóricas. As variáveis são sexo, idade, atividade da GBA (em SSPF e em leucócitos) e atividade

quitotriosidase (em SSPF e no plasma). O nível de significância estatística foi estabelecido em 5% (p <0,05).

Para análise estatística, os indivíduos foram inicialmente divididos em dois grupos, com base em atividade da GBA em SSPF:

a) Indivíduos em risco para DG (GBA<2,19nmol/ml/h); b) Normais (GBA≥2,19 nmol/ml/h).

A seguir, os indivíduos foram classificados em cinco categorias (“provável doença de Gaucher”, “limítrofe entre provável DG/provável heterozigoto”, “provável heterozigoto”, “limítrofe entre provável heterozigoto/normal” e “normal”) de acordo com os níveis de atividade da GBA adotados como parâmetros pelo laboratório de referência. Esses paramétricos laboratoriais foram obtidos pela análise enzimática de pessoas previamente diagnosticadas, por estudo molecular, como homozigotos, heterozigotos e normais para DG. As sobreposição de valores das atividades da GBA em leucócitos entre as categorias foram consideradas como valores limítrofres. Por fim, essas categorias foram comparadas com relação à atividade da quitotriosidase.