O rastreamento para DG em Tabuleiro do Norte-CE envolveu 740 voluntários, assintomáticos e sem parentesco em primeiro grau com os sete pacientes do Município, durante o período de um ano.
Os dados relacionados às atividades da GBA e da quitotriosidase em SSPF foram separados por categorias (sexo, faixa etária, níveis de atividade de GBA e de quitotriosidase) e estão resumidos no APÊNDICE B. Houve maior participação de mulheres no estudo (496 mulheres ou 67%), embora as atividades educativas tenham sido direcionadas indistintamente para homens e mulheres. Atribuiu-se a maior participação das mulheres por elas serem, provavelmente, as mais interessadas nas questões relacionadas à saúde. A idade dos participantes variou de um ano a 85 anos, com média de 31,4±19,2 anos. O Gráfico 1 mostra a diferença entre a idade das mulheres (média= 33,3±18,4 anos) e a dos homens (média= 27,4±20,2 anos) foi significativa (p<0,01; IC99%).
Para fins de análise de dados, os investigados foram agrupados em quatro faixas etárias: I) 1 a 20 anos; II) 21 a 40 anos; III) 41 a 60 anos; e IV) 61 a 85 anos. Observou-se diferença significativa entre o número de participantes das quatro faixas etárias (p<0.001; IC99%), com maior participação dos indivíduos mais jovens (faixas etárias: I, 35%; II, 33%). A participação de pessoas de mais de 61 anos, mesmo em menor quantidade (8%), conforme apresenta o Gráfico 2, foi muito importante, pois conferiu maior notoriedade à pesquisa junto à comunidade.
Gráfico 1 - Correlação entre sexo e idade dos participantes. Fonte: Dados coletados pelo autor, ano 2008.
Gráfico 2 - Distribuição dos participantes por faixas etárias. Fonte: Dados coletados pelo autor, ano 2008.
As médias das atividades da GBA e da quitotriosidase em SSPF foram 3,4±1,53 nmol/h/mL (variação de 0,4-12,0) e 30,8±25,8 nmol/h/ml (variação de 0- 242,0), respectivamente. Não houve diferença significativa na atividade da GBA entre homens e mulheres (p=0,174; IC95%) e a atividade da GBA diminuiu à medida que a idade dos participantes aumentou, numa relação negativa e significativa (r de Pearson= -0.07; p<0.05; IC95%), demonstrado no Gráfico 3, ou seja, as pessoas mais velhas apresentaram (em média) menor atividade da GBA em papel de filtro do que as mais jovens.
Gráfico 3 - Relação entre a idade dos participantes e a dosagem da β-glicosidase ácida em SSPF em Tabuleiro do Norte. (β-glicosidase ácida em nmol/h/mL)
Considerando os resultados dos 740 indivíduos, as medidas das atividades da GBA e quitotriosidase em SSPF apresentaram uma relação positiva e significativa entre si (r de Pearson= 0.174; p<0.01; IC99%), demonstrado no Gráfico 4, ou seja, à
medida que novas amostras de SSPF eram analisadas, as médias das atividades da GBA e da quitotriosidase aumentavam simultaneamente.
Gráfico 4 - Relação entre as atividades da β-glicosidase ácida e quitotriosidase em sangue seco em papel de filtro
Fonte: Dados coletados pelo autor, ano 2008.
Dos 740 participantes, 135 (18,2%) apresentaram atividade de GBA abaixo de 2,19 nmol/h/ml (ponto de corte adotado neste estudo), sendo considerados “grupo de risco para DG”. Os indivíduos com atividade da GBA acima e abaixo do ponto de corte não diferiram significativamente em relação ao sexo ou idade. Paradoxalmente, a atividade quitotriosidase em SSPF foi significativamente menor entre do “grupo de risco para DG”. Esses dados estão representados na Tabela 2.
A atividade da quitotriosidase entre os homens foi significativamente menor do que entre mulheres (p<0.01; IC99%) e não foi detectada a atividade de quitotriosidase em 38 (5.2%) amostras de SSPF.
Tabela 2 - Comparação entre os indivíduos do “grupo de risco para DG” e “normais” de acordo com a atividade da GBA em sangue seco em papel de filtro.
Variável Em risco para DG
(GBA < 2,19 nmol/h/mL) n=135 Normais (GBA ≥ 2,19 nmol/h/mL) n=605 P Sexo feminino 87 (64,4%) 409 (67,6%) >0,05* Idade (anos) 32,0±19,2 31,4±19,3 >0,05** Quitotriosidase (nmol/h/mL) 25,4±21,9 32,0±26.4 0,0014*
(valor de corte GBA=2,19 nmol/h/mL; *x2;** Mann-Whitney
Fonte:Dados coletados pelo autor, ano 2008.
Considerando os valores de corte adotados em SSPF (GBA< 2,19nmol/h/ml; quitotriosidase 44 nmol/h/mL), os resultados das atividades enzimáticas ficariam distribuídos conforme mostra a Tabela 3.
Tabela 3. Distribuição dos indivíduos conforme resultados das atividades
enzimáticas da GBA e quitotriosidase em sangue seco em papel de filtro.
Atividades enzimáticas avaliadas em amostras de SSPF Quitotriosidase < 44 (nmol/h/mL) n (%) Quitotriosidase ≥ 44 (nmol/h/mL) n (%) Quitotriosidase não detectada n (%) GBA < 2,19 nmol/h/mL 104 (14,0%) 23 (3,1%) 8 (1,1%) GBA ≥ 2,19 nmol/h/mL 445 (60,1%) 130 (17,6%) 30 (4,1%)
Fonte: Dados coletados pelo autor, ano 2008.
Após analisar as atividades da GBA em leucócitos de indivíduos diagnosticados por estudo molecular como homozigotos, heterozigotos e normais
para mutações da DG, o laboratório de referência estabeleceu parâmetros de atividade da GBA em leucócitos para cada categoria. De acordo com esses parâmetros, os voluntários selecionados para análise da GBA em leucócitos foram agrupados em cinco categorias, considerando as sobreposições de valores da atividade da GBA entre as categorias como categorias intermediárias. A Tabela 4 mostra os critérios de classificação.
Tabela 4 - Critérios de classificação dos voluntários de acordo com o nível da
atividade de β-glucocerebrosidase em leucócitos periféricos.
Classificação (nmol/h/mg de proteína) Atividade de GBA
Provável doença de Gaucher ≤4,0
Limítrofe entre provável heterozigoto e provável heterozigoto 4,1-5,5
Provável heterozigoto 5,6-9,9
Limítrofe para provável heterozigoto e normal 10,0-16,4
Normal ≥ 16,5
Fonte: Dados coletados pelo autor, ano 2008.
Dos 135 indivíduos do grupo de “risco para DG” (GBA em SSPF<2,19 nmol/h/mL), quatro optaram por não participar da segunda parte do estudo. Assim, nova amostra de sangue foi coletada dos 131 voluntários restantes para a dosagem da atividade de GBA em leucócitos e de quitotriosidase no plasma. Quatro voluntários (3,1%) apresentaram atividade de GBA em leucócitos ≤4,0 nmol/h/mg de proteína (variação de 2,6-4,0 nmol/h/mg), sendo considerados como ”provável doença de Gaucher”; 6(4,6%) apresentaram valores limítrofes entre “provável doença de Gaucher e provável heterozigoto”; 63(48,1%) foram classificados como
“provável heterozigoto”; 55(42,0%) demonstraram valores limítrofes entre “provável heterozigoto e normal”; apenas 3 (2,3%) exibiram atividades normais de GBA em leucócitos (Tabela 5).
Tabela 5. Distribuição de frequência dos indivíduos de acordo com atividade de
GBA em leucócitos periféricos (N= 131).
Classificação N (%) IC95% Quitotriosidase (nmol/h/mL±D.P.)
Provável doença de Gaucher 4 (3,1%) 0,8%-7,6% 82,75±13,50
Limítrofe entre provável DG e
provável heterozigoto 6 (4,6%) 1,7%-9,7% 61,47±72,53 Provável heterozigoto 63 (48,1%) 39,3%-57,0% 43,37±36,00
Limítrofe entre provável
heterozigoto e normal 55 (42,0%) 33,4%-50,9% 57,89±69,54
Normal 3 (2,3%) 0,5%-6,5% 42,33±41,54
Fonte: Dados coletados pelo autor, ano 2008.
A comparação entre os resultados dos quatro indivíduos do grupo “provável doença de Gaucher” e os demais participantes não mostrou diferença estatisticamente significativa quanto a sexo e idade (p>0,05). O grupo “provável doença de Gaucher”, porém, apresentou dosagem de quitotriosidase no plasma maior do que os demais (82,75±13,5 nmol/h/mL versus 50,49±54,8 nmol/h/mL; p=0,023).
As atividades enzimáticas dos dez indivíduos com GBA em leucócitos<5,6 nmol/h/mg de proteína foram novamente medidas e os resultados iniciais foram confirmados. Então, esses indivíduos foram submetidos à avaliação clínica e de
exames complementares: laboratoriais (hemograma completo com contagem de plaquetas e dosagem periférica de aminotransferases); de imagem (radiografias da pelve, fêmur, da coluna lombar e do tórax; ultrassonografia abdominal; ressonância magnética dos fêmures; e densitometria óssea da coluna lombar). Todos eles eram assintomáticos e os resultados de seus exames complementares estavam dentro dos parâmetros de normailidade.
Para confirmar a suspeita de diagnóstico de homozigoto ou heterozigoto atribuídos a esses participantes com suporte nos resultados da GBA em leucócitos, amostras de mucosa bucal, colhidas por escovação da bochecha, foram submetidas ao rastreamento molecular para as mutações mais prevalentes da DG no Brasil (N370S, L444P, G377S e 55del). Seis indivíduos foram identificados como heterozigotos (G377S/*) e em quatro deles não foi encontrada nenhuma das quatro mutações rastreadas, conforme demonstrado na Tabela 6.
A etapa seguinte foi pesquisar outras mutações, diferentes das quatro pesquisadas. Para isso, amostras de sangue dos quatro indivíduos do grupo “provável DG” (GBA ≤ 4,1 nmol/h/mg de proteína) foram colhidas em papel de filtro FTA para serem submetidas ao sequenciamento de toda a região do gene codificador da GBA (1q21). O sequenciamento do DNA dessas amostras confirmou os diagnósticos de dois indivíduos heterozigotos (p.G377S/wt) e dois “normais” (wt/wt). Os heterozigotos são dois irmãos do sexo masculino (12 e 17 anos de idade; atividade de GBA em leucócitos de 4,0 e 2,6 nmol/h/mg proteína, respectivamente) e os dois “normais” são mulheres de famílias distintas (39 e 44 anos de idade; atividade de GBA em leucócitos de 4,0 nmol/h/mg de proteína).
Tabela 6. Análise enzimática e molecular dos indivíduos com atividade de
GBA ≤ 5,5 nmol/h/mg de proteínas em leucócitos
Indivíduo Idade (anos) Sexo GBA em SSPF (nmol/h/mL) Quitotriosidase em SSPF (nmol/h/mL) GBA em leucócitos (nmol/h/mg) Quitotriosidase no plasma (nmol/h/mL) Mutações1 1 17 M 1,8 3,6 2,6 76 G377S/* 2 12 M 2,0 1,1 4,0 76 G377S/* 3 44 F 1,9 36,0 4,0 76 */* 4 39 F 1,6 8,0 4,0 103 */* 5 8 M 0,4 - 4,1 0,8 G377S/* 6 40 F 1,0 16,0 4,7 16 G377S/* 7 48 F 1,4 20,0 4,8 46 G377S/* 8 46 F 1,7 5,0 4,8 45 */* 9 57 F 1,5 86,0 4,8 203 */* 10 19 M 1,8 18,0 5,4 58 G377S/*
1Mutações pesquisadas: N370S, G377S, L444p e 55del; (*) nenhuma das quatro mutações pesquisadas foi encontrada; (-) atividade enzimática não detectada.