Experimento 2: colite induzida pelo ácido 2,4 dinitrobenzeno sulfônico (DNBS)

O experimento apresentado a seguir foi realizado durante o doutorado Sanduíche no período de outubro 2014 a julho de 2015 no Centro de Investigação Biomédica (CIBM) da Universidade de Granada, Granada, Espanha.

Camundongos CD1, machos de 9-10 semanas de idade e 30 ± 2,0 g, foram mantidos em ambiente específico, com ciclo claro/ escuro de 12 horas, temperatura ambiente (média de 22 ± 3ºC) e umidade relativa (50 a 55%), controlados. Os animais foram alimentados com dieta AIN-93 (REEVES et al., 1993), controlada após a indução e água ad libitum.

Os estudos foram conduzidos em concordância com o Guide for the Care and

Comité Ético em Experimentación Animal da Universidade de Granada (Espanha) (Ref.

No. CEEA: 2010 – 286).

Os camundongos foram divididos em três grupos: grupo controle negativo (não colítico); grupo controle positivo (controle DNBS), grupo tratamento com soro de leite caprino (4g. Kg-1/ dia)(dose escolhida com base nos resultados obtidos no experimento 1).

O delineamento experimental consistiu de um pré-tratamento com o soro caprino por via oral, 12 dias seguidos e 1h antes da indução da colite e continuado o tratamento até 4 dias após a indução. No 13º dia, a indução foi realizada como descrito por Morris et al., (1989), Figura 8. Nos dias seguintes, o IAD foi avaliado diariamente, sendo que no 4º dia após a indução os animais colíticos sem tratamento apresentavrm-se mais comprometidos (IAD próximo ao escore 4) e desta forma, realizada a eutanásia no 17º dia do experimento.

Figura 8 - Desenho experimental: colite induzida por 2,4-dinitrobenzenossulfônico

(DNBS)

13 17 dias CD1

* Grupos não colítico e controle DNBS receberam veículo (água) durante o experimento Fonte: Elaborado pelo autor (2016).

3.2.2.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal

3.2.2.1.1 Indução da colite por DNBS

Os animais foram submetidos a um período de jejum de 24 horas e, anestesiados utilizando quetamina (100 mg/ Kg) e xilazina (10 mg/Kg), por via intraperitoneal. A colite foi induzida com o ácido 2,4-dinitrobenzenossulfônico (DNBS).

O DNBS (2,5 mg/ animal) foi diluído em 100 uL de etanol a 50% (v/v), e administrado via retal (intracolônica) com a ajuda de um catéter de teflón (diâmetro de 2

Eutanásia

Tratamento com Soro de Leite Caprino*

mm, nº 6), o qual foi introduzido pelo ânus dos animais (controle positivo e animais tratados) até uma distância de 4,5 cm. O grupo saudável recebeu solução salina pela mesma via. Os animais foram mantidos em posição vertical por 15 min (de cabeça para baixo) para a instilação do hapteno.Todos os animais foram eutanasiados do 17º dia do experimento, com anestésicos ketamina e xilasina em dose letal e posterior deslocamento cervical.

3.2.2.1.2 Indice de Atividade da Doença e Relação Peso/ Longitude

O acompanhamento do peso corporal dos animais foi realizado em dias alternados antes da indução e dias consecutivos após a indução da colite. E o IAD avaliado conforme os critérios mencionados anteriormente.

Para a eutanásia, os animais receberam a mesma dose de anestésicos utilizados na indução da colite, e posteriormente foi realizado o deslocamento cervical. Após a eutanásia, o seguimento colônico foi extraído na sua totalidade, lavado com solução fisiológica (0,9%) a temperatura ambiente para remover restos de material fecal, e colocado sobre uma placa de Petri com gelo para a remoção das aderências mesentéricas gordura visceral. O peso e a longitude do cólon (ainda fechado) foram aferidos para identificação da relação P/L.

3.2.2.1.3 Explantes intestinais

Após abertura longitudinal do cólon, explantes intestinais foram obtidos e incubados em 1 mL de meio de cultivo RPMI-1640 - Roswell Park Memorial Institute

Medium completo, em estufa (37ºC) de CO2 (5%). Após 24 horas, os explantes foram

recolhidos e o meio transferido para microtubos e centrifugados a 4000 G por 10 min a 4ºC, procedendo-se a determinação de citocinas (IL-6 e TNF-α) por ELISA, método apresentado no modelo anterior, usando anticorpos específicos para camundongos, e o resultado expresso em pg/g de tecido.

3.2.2.1.4 Avaliação Histopatológica e Imunohistoquímica

Amostras do intestino (0,5 cm de comprimento) foram retiradas da região inflamada distal e fixada em formaldeído 10% tamponado para os estudos histológicos.

Na avaliação imunohistoquímica foram utilizados os anticorpos iNOS (1:500), SOCs-1 (1:800) e IL-17 (1:1000). Os métodos já foram descritos com detalhes anteriormente.

3.2.2.1.5 Análise de expressão gênica

A expressão gênica ocorre quando a informação contida em um gene, como a sequência de um DNA, é processada em um produto gênico, tal como uma proteína. Para isso, o tecido do cólon remanescente foi seccionado em fragmentos para isolamento do RNA, sendo armazenados em ependorf livre de RNAse e emergidos em solução de RNA Later®.

O RNA total das amostras do cólon foi extraído com Trizol (Invitrogen®) seguindo o protocolo do fabricante. Todas as amostras de RNA foram quantificadas com o espectrofotômetro NanoDropTM 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) e 2 µg de RNA foram objeto de transcrição reversa utilizando o iniciador oligo (dT) (Promega, Southampton, Reino Unido).

A amplificação de reação em cadeia da polimerade (PCR) em tempo Real foi quantificada e a detecção realizada em placa de 48 poços com um Sistema Óptico Real- Time EcoTM PCR (Ilumina, CA, EUA, Figura 9) usando com 20 ng de DNAc, água livre de Rnase, KAPA SYBRs FAST qPCR Master Mix (Kapa Biosystems, Inc., Wilmington, MA, EUA) e primers específicos (fitas de DNA) com concentração de 10µM de Fw (Forward) e Rv (Reverse) (Tabela 6).

Figura 9 – Equipamento utilizado da Reação de Cadeia Polimerase

Fonte: Eco™ Real-Time PCR System User Guide (2012)

O programa de ciclo térmico consistiu de uma ativação da DNA polimerase de 2 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de reação: desnaturação - 8s (95ºC), anelamento -

20s (Ta, Tabela 7) e extensão - 5s (80ºC). A fluorescência foi medida no final do período de anelamento de cada ciclo para monitorar o progresso da amplificação, e a curva de dissociação (ou curva de Melt) foram adicionadas para confirmar a especificidade da amplificação do sinal em cada um dos casos. Para normalizar a expressão RNAm, foi medido o gene da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). A quantificação relativa de RNA foi calculada usando o método ΔΔCT (Comparação dos valores CT do gene da amostra com o gene normalizador) - ΔΔCT= ΔCT amostra - ΔCT referência. Os primers dos genes para a expressão dos marcadores pró-inflamatórios, e de regulação da inflamação são apresentados na Tabela 6.

Tabela 6 - Sequência de primers usados nas análises de PCR em tempo real do tecido

colônico, modelo de colite experimental induzida por DNBS

Gene Sequência 5′–γ′ Ta (°C) GAPDH Fw 5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG 60 Rv 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG IL-1 Fw 5′-TGATGAGAATGACCTCTTCT 55 Rv 5′-CTTCTTCAAAGATGAAGGAAA IL-6 Fw 5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC 60 Rv 5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC iNOS Fw 5′-GTTGAAGACTGAGACTCTGG 56 Rv 5′-GACTAGGCTACTCCGTGGA ICAM-1 Fw 5′-GAGGAGGTGAATGTATAAGTTATG 60 Rv 5′-GGATGTGGAGGAGCAGAG MMP-9 Fw 5′-TGGGGGGCAACTCGGC 60 Rv 5′-GGAATGATCTAAGCCCAG MUC-3 Fw 5′-CGTGGTCAACTGCGAGAATGG 60 Rv 5′-CGGCTCTATCTCTACGCTCTC TNF- α Fw 5′-AACTAGTGGTGCCAGCCGAT 56 Rv 5′-CTTCACAGAGCAATGACTCC Ocludina Fw 5′-ACGGACCCTGACCACTATGA 56 Rv 5′-TCAGCAGCAGCCATGTACTC ZO-1 Fw 5′-GGGGCCTACACTGATCAAGA 56 Rv 5′-TGGAGATGAGGCTTCTGCTT

Legenda: Ta: Temperatura de Anelamento; GAPDH: Glideraldeido 3-fosfato Desidrogenase; IL-1 : Interleucina 1 ; IL-6: Interleucina 6; iNOS: Óxido Nítrico Sintetase Induzida; ICAM-1; Molécula de Adesão Intercelular-1; MMP-9: Matrix Metaloproteinase-9; MUC-3: Mucina-3; TNF- α: Fator de Necrose Tumoral- α; ZO-1: Zona de Oclusão -1.