Experimento in vivo 1: colite induzida por ácido acético

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso Animal da Universidade Federal da Paraíba (CEUA/UFPB, protocolo n° 0608/2013, ANEXO A). Os cuidados animais e protocolos de pesquisa foram baseados nos princípios do Guide for the Care

and Use of Laboratory Animals (NATIONAL INSTITUTE OF HEALTHY, 1985) e

Lei Arouca, nº 11.794, de 8 de outubro de 2008.

Os experimentos foram realizados em ratos albinos Wistar fêmeas (Rattus

norvegicus) com 12 semanas de idade e peso de 220 ± 20 g, mantidos em condições

padrão (12h ciclo claro/ escuro, 22 ± 0,1°C e umidade 50- 55%) com acesso ad libitum a ração AIN-93 (REEVES et al., 1993) e água.

Os animais foram divididos em 6 grupos (n = 10): grupo controle negativo (não colítico), grupo controle positivo (ácido acético – AA), grupos tratados com diferentes doses de soro de leite caprino atomizado (SC) (1 g, 2 g ou 4 g. Kg-1/dia) e grupo tratado com sulfassalazina (SAZ, 250 mg. Kg-1/dia) (Figura 6).

Figura 6 _{– Desenho experimental: colite induzida por ácido acético 10%}

0 14 17 dias E U T A N Á S I A Não Colítico Controle AA SAZ 250mg.Kg-1 SC (1g.Kg-1) SC (2g.Kg-1) SC(4g.Kg-1) Ácido Acético 10%

SAZ: Sulfassalazina; SC: Soro de Leite Caprino Atomizado; AA: Ácido Acético

Os animais tratados receberam as doses de SC e SAZ (dissolvidas em 1 mL de água e administradas por via oral) 14 dias, diariamente, antes e 72 horas seguidos após a indução da colite, e os grupos controles, apenas o veículo (1 mL de água).

3.2.1.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal

3.2.1.1.1 Indução da colite por ácido acético

Os animais foram mantidos em jejum durante a noite por 18 horas e anestesiados com quetamina (70 mg. Kg-1, 10%) e xilazina (10 mg. Kg-1, 2%), intraperitoneal, para a indução do processo inflamatório intestinal.

A indução da colite com AA 10% (diluido em solução salina 0,9%) foi realizada de acordo com os métodos originalmente descritos por MacPherson e Pfeiffer (1978) e modificado por Millar et al. (1996). O cateter foi cuidadosamente inserido no cólon (8 cm do ânus para a região proximal), e em seguida, o ácido acético (0,5 mL) foi instilado no lúmen do cólon.

O grupo não colítico recebeu apenas o veículo (0,5 mL de solução salina 0,9%) intracolonicamente. Os ratos foram mantidos na posição de cabeça para baixo durante 30 s para evitar a fuga do ácido. Os animais foram eutanasiados com dose letal de tiopental sódico (90 mg. Kg-1), via intraperitoneal, 72 horas após a indução da colite.

3.2.1.1.2 Índice de Atividade da Doença

A evolução da inflamação intestinal foi acompanhada por meio de avaliação do Índice de Atividade da Doença (IAD), considerando os seguintes parâmetros: perda de peso, consistência das fezes e presença de sangue na região perianal ou sangue oculto nas fezes, de acordo com Cooper et al., (1993) adaptado pela pontuação em cruzes no iten sangue nas fezes. Cada parâmetro foi pontuado como descrito na Tabela 2 e dividido por 3.

Tabela 2 _{– Índice de Atividade da Doença (IAD)} Escore Perda de peso corporal

(%)

Consistência Sangue nas fezes*

0 0 Normal -

1 1-5 +

2 6-10 Fezes brandas ++

3 11-20 +++

4 > 20 Diarreia ++++

Fonte: Cooper et al (1993), adaptado.

* Presença de sangue na região perianal ou sangue oculto nas fezes

3.2.1.1.3 Avaliação do dano macroscópico intestinal

Após a eutanásia, o cólon foi removido, lavado com solução salina (0,9%) e transferido para a superfície da placa petri com gelo, para remoção do tecido adiposo e aderências. Em seguida, o cólon foi pesado em balança eletrônica digital (MARTE, modelo AL 500, com sensibilidade de 0,001) e medido o comprimento sob uma carga constante (2 g) em uma das extremindades do cólon. A relação Peso/ Longitude (P/L) é um importante parâmetro para avaliar a inflamação intestinal, uma vez que o encurtamento e espessamento da parede do cólon é comum na DII.

O cólon foi aberto longitudinalmente para avaliação da extensão da área inflamada pontuando com escore por meio do Índice de Dano Macroscópico (IDM), que considera a extensão e gravidade do dano (BELL; GALL; WALLACE, 1995) (Tabela 3).

Tabela 3 - Critério para avaliação do dano macroscópico Escore Critério

0 Cólon normal (sem dano)

2 Ulceração sem hiperemia nem engrossamento da parede

3 Ulceração com ponto de inflamação

4 Dois ou mais sítios de ulceração e/ou inflamação

5 Zonas grandes de inflamação e ulceração com uma extensão maior que 1 cm

6-10 Zonas grandes de dano tissular com uma extensão maior que 2cm, adicionando-se 1 (até 10) ponto a cada 1 cm adicional de extensão.

Segmentos no sentido longitudinal do cólon foram separados e congelados a - 80ºC para posteriores determinações bioquímicas: marcadores de estresse oxidativo (conteúdo total de glutationa e malondialdeído) e de inflamação (atividade da enzima mieloperoxidase e níveis das citocinas IL-1 e TNF-α). Um dos fragmentos foi homogeneizado (Homogeneizador Ultra Stirrer, Modelo 80) imediatamente com tampão fosfato-salino (PBS) (pH = 7,4), incubado a 37ºC em banho maria, centrifugado a 4000 G (4ºC, 10 min) e armazenado o sobrenadante para determinação de leucotrieno B4.

3.2.1.1.4 Conteúdo Total de Glutationa

O conteúdo total de glutationa foi quantificado como descrito por Anderson (1985). As amostras de tecido colônico foram descongeladas, picadas, diluída para uma concentração de 1:20 (m/ v) de ácido tricloroacético a 5% e homogeneizadas (Homogeneizador Ultra Stirrer, Modelo 80) em banho de gelo. Os homogenatos foram centrifugados a 10.000 G (15 min a 4ºC) e os sobrenadantes utilizados para quantificação do conteúdo total de glutationa.

Em placa de 96 poços foram acrescentadas alíquotas de 20 uL do sobrenadante do homogeinato em duplicata, 15 uL de tampão PBS-EDTA e 20 uL de ácido ditiobisnitrobenzóico (DTNB), promovendo a transformação da glutationa reduzida (GSH) para glutationa oxidada (GSSG). Com a adição de 140 uL de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) em cada poço ocorreu a redução da GSSG pela ação da glutationa redutase, constituindo um ciclo redox essencial para manutenção da integridade do sistema protetor celular (WANG; BALLATORI, 1998) (Figura 7).

Este ciclo contínuo é proporcional à quantidade total de glutationa (GSH + GSSG), sendo medido imediatamente em Leitor de microplacas Polaris® (Celer Biotecnologia S. A.) a 412 nm. Os resultados foram expressos como nmol/ g de tecido. Todos os reagentes foram adquiridos pela Sigma-Aldrich® (St Louis, MO, EUA).

Figura 7 – Esquema da determinação do conteúdo de glutationa total

DTNB glutationa redutase NADPH GSH GSSG

3.2.1.1.5 Determinação de Malondialdeído

As concentrações de malondialdeido (MDA) foram determinadas no tecido colônico como descrito por Esterbauer e Cheeseman (1990). As amostras foram descongeladas, picadas e homogeneizadas (Homogeneizador Ultra Stirrer, Modelo 80) com tampão Tris HCl (pH = 7,4) na proporção 1:5 (m/ v). O homogenato obtido foi centrifugado a 2500 G por 10 minutos a 4 oC e ao sobrenadante (300 uL) adicionado 750 uL de reativo cromogênico (composto por 1-metil-2-fenilindol 10,3 mM em acetonitrila 3:1) e 225 uL de ácido clorídrico (HCl - 37%).

O conteúdo de MDA foi calculado através da interpolação em curva padrão com o 1,1,3,3 – tetraetoxipropano (10 mM), hidrolisado durante a incubação com o HCl a 45

o_{C por 40 min, gerando o MDA. Uma molécula de MDA reage com duas moléculas do}

reativo cromogênico, 1-metil-2-fenilindol, para se obter um cromóforo estável.

A leitura das absorbâncias foi realizada em Leitor de microplacas Polaris® (Celer Biotecnologia S. A.) a 586 nm e dados expressos em nmol/ g de tecido. Todos os reagentes foram adquiridos pela Sigma-Aldrich® (St Louis, MO, EUA).

3.2.1.1.6 Determinação da atividade da enzima mieloperoxidase

Amostras de cólon foram homogeneizadas (Homogeneizador Ultra Stirrer, Modelo 80) em tampão de brometo de hexadeciltrimetil- amónio (HTAB, 0,5%), pH = 6,0, na proporção de 1:20 proporção m/ v, que atua como detergente, facilitando a liberação da enzima MPO dos grânulos intracelulares presentes nos neutrófilos. Em seguida, foram sonicadas (Sonicador Limp Sonic) e submetidas a três ciclos de congelamento-descongelamento, os homogenatos foram centrifugados e os sobrenadantes utilizados para a mensuração da atividade de MPO.

A reação da MPO com 150 uL de reativo cromogênico (o-dianisidina, tampão fosfato e peróxido de hidrogênio), resulta na formação de um cromóforo que possui absorbância máxima em 450 nm, esta que é medida aproximadamente 2 minutos após a reação. A atividade da enzima MPO foi calculada por interpolação em uma curva padrão, realizada com MPO procedente de neutrófilos humanos.

Considera-se uma unidade (U) de MPO aquela que degrada 1 nmol/ min de peróxido de hidrogênio a 25 °C. Os resultados foram expressos como U/ g de tecido

(KRAWISZ; SHARON; STESON, 1984). Todos os reagentes foram adquiridos pela Sigma- Aldrich® (St Louis, MO, EUA).

3.2.1.1.7 Análise de citocinas e leucotrieno B4

Para análise de citocinas e LTB4, amostras do cólon foram homogeneizadas

(Homogeneizador Ultra Stirrer, Modelo 80) em PBS (pH = 7,4), e centrifugadas a 4000 G por 10 min a 4ºC (McCAFFERTY RIOUX.; WALLACE, 1992). As citocinas IL-1 , TNF-α e o LTB4 foram determinadas usando kits de Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay (ELISA) comercial (R & D Systems, Minneapolis, MN, EUA), de acordo com o

protocolo do fabricante.

Resumidamente, as placas de microtitulação foram revestidas com 100 uL de anticorpos de captura para cada citocina e LTB4 e deixados overnight. Entre cada etapa

posterior, procedeu-se lavagem da placa (3 vezes) com aproximadamente 300 uL de tampão (Tween 20). As placas foram bloqueadas com 300 uL de Reagente Diluente (solução de 0,1% de albumina do soro bovino, 0,05% de Tween 20 em tampão Tris salino, pH = 7,4) durante 1 hora. Após, o anticorpo padrão (para cada citocina e LTB4) e

os sobrenadantes das amostras foram incubados durante 2 h (100 uL de cada). E em seguida, 100 uL dos anticorpos de detecção anti-IL-l , anti-TNFα ou anti-LTB4, foram

incubados a temperatura ambiente durante 1 h.

As placas foram revestidas com 100 uL de estreptavidina-HRP-conjugada por 20 min. A adição de 100 uL solução substrato (composto por reagente de coloração A – H2O2, e B - Tetrametilbenzidina) ao complexo enzima-anticorpo-antígeno resultou em

um produto de coloração. Nas etapas seguintes, não houve mais lavagem com o tampão. A reação enzimática foi parada com 50 uL de solução de paragem (stop solution) - H2SO4 (2N), e a absorbância medida em Leitor de microplacas Polaris® (Celer

Biotecnologia S. A.) a 450 nm. Os resultados foram expressos em ng/g de tecido.

3.2.1.1.8 Análise Histopatológica

Amostras dos cólons (n = 5) foram coletadas e fixadas em paraformaldeído tamponado (10% em PBS, pH 7,2) durante 24 horas, e processados de acordo com a técnica histológica de rotina. Após inclusão em parafina, seções de tecidos (3-5 µm de

largura) foram confeccionadas com o auxílio de um micrótomo, depositados sobre lâminas, e corado com hematoxilina e eosina para exame histológico por microscopia óptica.

Os critérios de determinação do dano microscópico e grau de infiltração leucocitária foram avaliados como descrito por Zea-Iriarte et al. (1996), Tabela 4. A análise histopatológica foi realizada por dois patologistas cegos.

Tabela 4 - Critérios para avaliação do dano microscópico do tecido colônico e grau de

infiltração leucocitária Escore Critério Dano Microscópico 0 1 2 3 4 5 6

Tecido do cólon normal

Inflamação ou ulceração focal limitada à mucosa

Ulceração e inflamação focal ou extenso limitada à mucosa e submucosa

Ulceração e inflamação focal ou extensa, com envolvimento da muscular própria

Ulceração focal e inflamação transmural com envolvimento da serosa Ulceração extensa e inflamação transmural com envolvimento da serosa

Ulceração focal ou extensa e inflamação transmural e perfuração

Infiltração leucocitária 0 1 2 3 Tecido normal Infiltração leve Infiltração moderada Infiltração intensa

Fonte: Fonte: Zea-Iriarte et al. (1996).

3.2.1.1.9 Avaliação Imunohistoquímica: marcadores COX-2, iNOS, MMP-9 e SOCS-1

Seções finas (3 uM) de cólon de 5 animais por grupo (3 seções por animal) foram obtidas com um micrótomo e transferidas para lâminas silanizadas (Dako, Glostrup, Denmark), e submetidas a processos de desparafinização e hidratação. Em seguida, as lâminas foram lavadas com 0,3% de Triton X-100 em tampão de fosfato, tratadas com peróxido de hidrogênio a 3%, e incubadas overnight a 4 °C com os seguintes anticorpos primários e diluições respectivas: COX-2 (1: 500); iNOS (1: 500); MMP-9 (1: 800); SOCS-1 (1: 800) (Santa Cruz Biotechnology, Interprise, Brasil).

Depois de lavadas com tampão fosfato, as lâminas foram incubadas com um anticorpo secundário de estreptavidina-HRP-conjugado (Biocare médica, Concord, CA, EUA) durante 30 minutos e a imuno reatividade para COX-2, iNOS, MMP-9 e SOCs-1 foi visualizada por meio de um kit de detecção de base colorimétrica, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante (Trek Avidina-HRP etiqueta + Kit de Biocare médica, Dako, EUA). Controles positivos e negativos foram incluídos em cada lote. As amostras foram visualizadas em microscópio Nikon LED E200 com lente objetiva de alta potência (400x). A intensidade da imunocoloração das células foi determinada para cada grupo conforme a Tabela 5. A intensidade de marcação foi avaliada por dois examinadores previamente treinados de forma duplo-cego.

Tabela 5 – Avaliação dos marcadores por imunocolocaração Escore Critério

1 Sem células positivas