UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
DALINE FERNANDES DE SOUZA ARAÚJO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DO
SORO DE LEITE CAPRINO NA COLITE EXPERIMENTAL E
NA RESPOSTA CELULAR
JOÃO PESSOA-PB
Daline Fernandes de Souza Araújo
Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino
na colite experimental e na resposta celular
João Pessoa-PB
Daline Fernandes de Souza Araújo
Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino
na colite experimental e na resposta celular
Tese apresentada ao Programa de
Pós-graduação
em
Ciência
e
Tecnologia de Alimentos, Centro de
Tecnologia, Universidade Federal da
Paraíba, em cumprimento aos
requisitos para obtenção do título de
Doutora em Ciência e Tecnologia de
Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga
Coorientadora: Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra
Daline Fernandes de Souza Araújo
Avaliação do potencial anti-inflamatório do soro de leite caprino na colite experimental e na resposta celular
Tese aprovada em 12 de agosto de 2016
Banca Examinadora
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga Universidade Federal da Paraíba
Coordenador da Banca
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Gerlane Coelho Bernardo Guerra Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Coorientadora
_____________________________________________________________ Profa. Dra. Maria Manuela Estevez Pintado
Universidade Católica do Porto, Portugal Examinador Externo
_____________________________________________________________ Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner
Universidade Federal do Rio Grande do Norte Examinador Externo
__________________________________________________________ Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa
Universidade Federal do Rio Grande do Norte Examinador Externo
_____________________________________________________________ Profa.Dra. Prof. Dra. Juliana Késsia Barbosa Soares
Aos meus avós maternos Giselda e Celsoϯ, e paternos Severinaϯ e José Pergentinoϯ, e aos bisavós maternos Luis Conzaga e Genésia
ϯ (In memorian),
AGRADECIMENTOS
Tudo posso naquele que me fortalece (Fil. 4:13). Essa passagem bíblica representa o meu agradecimento a Deus por me fortalecer nos momentos mais difíceis, que me fizeram muitas vezes duvidar da minha capacidade em realizar este trabalho de doutorado.
Agradeço em especial as minhas orientadoras Profa. Rita de Cássia Ramos do Egypto Queiroga e Professora Gerlane Coelho Bernardo Guerra, que mesmo sem me conhecerem, acreditaram em meu potencial na investigação científica. Trabalhar com experimentação animal era algo novo para mim, muito embora tivesse interesse pela área.
Aos meus pais (Clidenor e Conceição), irmã (Dennya) e cunhado (Max), família que sempre esteve presente nos momentos felizes e difíceis da minha vida. A concretização deste trabalho só foi possível com o apoio incondicional de vocês.
Agradeço à professora Maria Manuela Estevez Pintado pelos ensinamentos e possibilidade de através de uma colaboração com a Universidade Católica Portuguesa realizar o doutorado sanduíche nesta instituição. Obrigada pela acolhida durante a estadia no Porto-PT.
Aos colegas portugueses Nadia e Manu Amorim pela troca de conhecimentos e companheirismo na adaptação ao novo laboratório na cidade do Porto-Portugal. Às brasileiras colegas de laboratório e amigas que vou levar no meu coração Glenise, Adriana, Mariane e em especial Andréia Tremarin e Luciana Lima pelo companheirismo e serem confidentes principalemente nos momentos de saudosismo à família.
e sempre aptos a ajudar nas dificuldades encontradas no laboratório ou algo relacionado a pesquisa. ¡Ya os echo de menos!
Às amizades conquistadas durante o doutorado, em especial Yasmim Sousa, que partilhou muitos momentos para a realização deste trabalho, principalmente no período do doutorado sanduíche em Portugal e na Espanha. E também foi ombro amigo para os momentos felizes e difíceis quando estávamos fora do país, sem esquecer de algumas aventuras e muitas histórias para recordar!
Agradeço de forma especial à amiga Paloma Oliveira. Deus nos abençoa com pessoas que podemos chamar de irmãos, mesmo sem ter sido gerado pelo mesmo pai ou mãe, e ter o mesmo sangue. Nos conhecemos e pudemos partilhar nossas experiências do laboratório, ajudando uma a outra diretamente em nossas pesquisas. Você foi um presente de Deus em minha vida, e uma amizade que desejo que frutifique ainda mais. Agradeço à sua família que prontamente me acolheu em vários momentos de minha vinda a João Pessoa.
E outras amizades conquistadas, como a de Raphaela Rodrigues, Fernanda Rolim, Juliana Kessia e Mayara, o grupo de experimental. Aos colegas do doutorado Estefânia (pela indicação à pesquisa), Fábio e Valquiria, Amanda e José (colegas de doutorado sanduíche, os quais pude conhecer um pouco mais e admirá-los), e demais que pude conviver neste período, Karla, Eduardo, Tayanna, Íris, Isabele, Edilza, dentre outros colegas que pude partilhar um pouquinho de momentos vividos na UFPB, e à secretária do PPGCTA, Lindalva, sempre muito acessível a todos em ajudar no que estiver ao seu alcance
À Univerdidade Federal de Sergipe, pela possibilidade do afastamento dentro e fora do país para as atividades do doutorado. Agradeço pela torcida e apoio dos amigos professores Adriana, Carolina, Heloisa, que viraram uma segunda família em Sergipe, partilhando os momentos felizes, agústias, e apoio nas decisões pessoais e profissionais e aos demais colegas de trabalho.
Ao amigo e irmão de coração Fábio Resende (Professor da Faculdade de Ciências da Saúde do Trairi-UFRN), pela amizade, companheirismo, ensinamentos, a quem tenho muita admiração, pela história de vida e profissional que é. Obrigada por estar sempre por perto.
As minhas amizades fora do ambiente acadêmico, Raiana, Rayanna e Iliana. Nós que estamos diariamente (fisicamente ou não) na torcida uma pela outra. Que possamos estar cada vez mais unidas mesmo que na distância. Agradeço pela amizade sincera construída nestes últimos anos.
Agradeço a amizade de Anna Beatriz Luz, que em tão pouco tempo e ainda distantes pudemos partilhar momentos recentes e especiais de nossas vidas.
RESUMO
A Doença Inflamatória Intestinal (DII), caracterizada por apresentar uma inflamação crônica não controlada na mucosa intestinal, engloba, principalmente, duas patologias: a Colite Ulcerativa e a Doença de Crohn. Nestas, o sistema imunológico local permanece cronicamente ativado e o intestino intensamente inflamado, devido a uma incapacidade do organismo para a diminuição das respostas inflamatórias. Terapias alternativas e complementares tem sido de grande interesse para o tratamento das DII, com o objetivo de melhorar os efeitos secundários dos fármacos comumente utilizados. O soro de leite caprino apresenta na sua composição oligossacarídeos e ácido linoleico conjugado com propriedades funcionais, mas ainda insipiente como efeito na modulação intestinal. A presente tese foi dividida em dois estudos: no primeiro, foi avaliada a capacidade do soro de leite de cabra em prevenir a inflamação intestinal no modelo de inflamação induzida por ácido acético em ratos, comparando com um fármaco padrão, a sulfassalazina utilizada no tratamento da DII; no segundo, foi estudado o efeito anti-inflamatório do soro de leite no modelo de colite induzido por ácido 2,4-dinitrobenzeno sulfônico em camundongos. O pré-tratamento com soro de leite caprino (1, 2 e 4 g. Kg
-1) e sulfassalazina (250 mg. Kg-1) melhorou os marcadores inflamatórios
(mieloperoxidase, leucotrieno B4 e citocinas pró-inflamatórias) e de estresse oxidativo
(conteúdo total de glutationa e malondialdeido) no tecido colônico dos animais. A avaliação histológica e imunohistoquímica do tecido colônico revelaram, respectivamente, uma preservação da citoarquitetura e redução na expressão de COX-2, iNOS e MMP-9, em conjunto com um aumento da expressão de SOCs-1. Os resultados sugerem que o soro caprino exerceu um efeito preventivo contra o dano intestinal induzida por ácido acético, mostrando uma eficácia semelhante à mostrada por sulfassalazina, sendo, portanto, um potencial tratamento para a doença inflamatória intestinal humana. No segundo modelo, com diferente agente indutor da DII, utilizou-se a dose de soro de leite caprino que mostrou melhor resultado na melhora da inflamação do estudo anterior. Neste estudo, também houve uma melhora do dano intestinal no grupo dos animais, confirmado pela avaliação do processo inflamatório colônico, e expressão gênica do cólon dos marcadores pró-inflamatórios IL-6, IL-1 , IL-17, TNF-α, iNOS, ICAM- 1, MMP-9, reguladores da integridade intestinal epitelial (MUC-2 e MUC-3, ocludina e ZO-1) e supressor de sinalização de citocinas (SOCS-1). As propriedades anti-inflamatórias do soro foram evidenciadas no estudo in vitro em células Raw 264 de macrófagos de murinos e CMT-93 derivada de células de carcinoma retal de murinos, em que promoveu uma redução significativa da produção de óxido nítrico e IL-6. Dessa forma, o soro de leite caprino, mostra-se como um produto inovador na prevenção e controle inflamação intestinal em modelos murinos.
ABSTRACT
Inflammatory Bowel Disease (IBD) is characterized as an uncontrolled chronic inflammation of the intestinal mucosa and mainly includes two pathologies: Crohn's disease and ulcerative colitis. Accordingly, the local immune system remains compromised and the intestine intensely inflamed, due to an inability of decreasing inflammatory responses. Complementary and alternative medicines have been of great interest for the treatment of IBD, with the aim to improve the side effects of commonly used drugs. Goat whey present oligosaccharides and conjugated linoleic acid with different functional properties, but also an effect on intestinal incipient modulation. This thesis was divided into two studies: the first being goat whey ability in preventing intestinal inflammation in an inflammation model induced by acetic acid in rats, evaluated by comparing it with a standard sulfasalazine medicine used in the treatment of DII; in the second study, the anti-inflammatory effect of the whey colitis model induced by 2,4-dinitrobenzenesulfonic acid in mice. In the first, the pre-treatment with goat whey (1, 2 and 4 g. Kg-1) and sulfasalazine (250 mg. Kg-1) improved the inflammatory markers (myeloperoxidase, leukotriene B4 and pro-inflammatory cytokines) and oxidative stress (total content of glutathione and malondialdehyde) in colonic tissue of rats. Histological and immunohistochemical evaluation of colonic tissue showed cytoarchitecture preservation and reduction in COX-2 expression, respectively, as well as iNOS and MMP-9 in conjunction with an increase in SOCs-1 expression. The results suggest that goat whey exerted a preventive effect against intestinal damage induced by acetic acid, showing similar efficacy to sulfasalazine, and thus is a potential treatment for human inflammatory bowel disease. In the second model, we used the best dose of the first to conduct different analyses. In the second model with a different inducing agent of IBD was used to dose goat whey that Showed better results in improving of intestinal inflammation the previous study. This study, there was also an improvement of intestinal damage in the group of animals, confirmed by evaluating colonic inflammation and colonic gene expression of pro-inflammatory markers IL-6, IL-1 , IL-17,TNF-α, iNOS, ICAM- 1, MMP-9, regulators of intestinal epithelial integrity (MUC-2, MUC-3, occludin and ZO-1) and supressor of cytokine signaling (SOCS-1). The anti-inflammatory properties of the goat whey were demonstrated by an in vitro study on murine macrofhages line Raw 264 and CMT-93 cells derived from murine rectum carcinoma which promoted a significant reduction in nitric oxide production and IL-6. Thus, goat whey shown as an innovative product in the prevention and control of intestinal inflammation in murine models.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Vias de interação entre microbiota e células do sistema imune nas
DII 24
Figura 2 - Representação esquemática das ações do óxido nítrico (NO) indicando os efeitos fisiológicos e patológicos das isoformas de óxido nítrico sintase constitutiva (c) e induzida (i) 27
Figura 3 - Componentes bioativos do leite de cabra e ação na Doença
Inflamatória Intestinal 41
Figura 4- Funcionalidade fisiológica de alimentos – peptídeos bioativos 43
Figura 5 - Fluxograma do desenho experimental referente a obtenção e
utilização do soro de leite caprino 48
Figura 6 - Desenho experimental: colite induzida por ácido acético 10% 50
Figura 7- Esquema da determinação do conteúdo de glutationa total 53
Figura 8 - Desenho experimental: colite induzida por 2,4-dinitrobenzenos
sulfônico (DNBS) 58
Figura 9 - Equipamento utilizado da Reação de Cadeia Polimerase 60
ARTIGO 1
Figure 1 - Effect of treatments of goat whey (GW) and sulfasalazine (SAZ) on evolution of weight (A), disease activity index (DAI; B), macroscopic damage score (C), and weight/ length ratio (D) in the intestinal inflammation of acetic acid induced in rats. Data (n = 10) are presented as means ± SEM. Groups with different letters (a–d) statistically differ (P < 0.05). 116
= 10) are expressed as means ± SEM. Groups with different letters (a–e) statistically differ (P < 0.05). 117
Figure 3 - Effect of the goat whey (GW) and sulfasalazine (SAZ) in the myeloperoxidase (MPO) activity (A), leukotriene B4 (LTB4; B), glutathione content (C), and malonaldehyde (MDA; D) levels in the intestinal inflammation of the experimental model of colitis in acid-induced rats. Data (n = 10) are expressed as means ± SEM. Groups with different letters (a,b) differ statistically. 118
Figure 4 - Effect of different doses of goat whey (GW) and sulfasalazine (SAZ) in IL-1 and tumor necrosis factor (TNF)-α levels in the intestinal inflammation of the experimental model of colitis in acid-induced rats. Data (n = 10) are expressed as means ± SEM; groups with different letters (a,b) differ statistically (P < 0.05). 119
Figure 5 - Immunohistochemical analysis of the colonic tissue in the acetic acid-induced colitis rats. Immunoexpression for cyclooxygenase (COX)-2 (A), inducible nitric oxide synthase (iNOS; B), cytokine signaling-1 suppressor (SOCS-1; C), and matrix metalloproteinase (MMP)-9 (D). For each antigen, 3 immunostained sections were examined per animal (n = 5). 40× magnification, scale bar = 100 μm; 1: noncolitic; 2: acetic acid control; 3: sulfasalazine (SAZ); 4: goat whey (GW). 120
ARTIGO 2
Figure 1 - Effect of goat whey on the experimental model of colitis induced by 2,4-dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS). (A) Monitoring of body weight; (B) Disease Activity Index (DAI); (C) Food Consumption; (D) Weight / Length ratio of the colon; and (E) colonic segment of the experimental groups. Data are expressed as mean ± SEM. Groups with different letters differ significantly
(p <0.05). 152
Figure 2 - Effect of goat whey on (A) interleukin (IL)-6 and (B) tumor necrosis factor (TNF)-α production in colonic tissue on 2,4-dinitrobenzenesulfonic acid (DNBS) induced colitis in mice measured by ELISA. Data are expressed as mean ± SEM (n = 12). Groups with different letters are statistically different (P < 0.05). 153
colitis in mice, measured by RT-PCR. Data are expressed as mean ± SEM (n = 12). Groups with different letters are statistically
different (P < 0.05). 154
Figure 4 - Effects of goat whey in the 2,4 – dinitrobenzenesulfonic acid (DNBS) mouse colitis. Histological sections of colonic mucosa stained with hematoxylin and eosin (x100): (A) Healthy, (B) DNBS control, (C) Goat Whey. (D) Microscopic score assigned to the different groups according to the criteria described by Zea-Iriarte et al. (1996); data are expressed as means ± SEM (n=12); groups with different letter statistically differ (P<0.05). 155
Figure 5 - Immunohistochemistry analysis of the colonic tissue in the 2,4-dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced colitis in mice. Immunostainig for A) cytokine signaling proteins (SOCs), B) inducible nitric oxide synthase (iNOS) and C) interleukin (IL)-17. For each antigen, three immunostained sections were examined per animal (n = 5). (40 x magnification, scale bar = 100mm); 1: Healthy; 2: DNBS Control; 3: Goat Whey. 156
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição química de leite/soro de diferentes animais 45
Tabela 2 - Índice de Atividade da Doença (IAD) 52
Tabela 3 - Critério para avaliação do dano macroscópico 52
Tabela 4 - Critérios para avaliação do dano microscópico do tecido colônico
e grau de infiltração leucocitária 56
Tabela 5 - Avaliação dos marcadores por imunocoloração 57
Tabela 6 - Sequência de primers usados nas análises de PCR em tempo real do tecido colônico, modelo de colite experimental induzida por
DNBS 61
ARTIGO 2
Table 1 - Primer sequences used in real-time qPCR assays, in the model of
experimental colitis induced by DNBS. 150
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA AINE
Ácido acético
Anti-inflamatório não esteroidal
Anti-TNF-α Anticorpo monoclonal para a citocina TNF-α CD
CEUA
Doença de Crohn
Comitê de Ética no Uso Animal CLA
CMT COX
Ácido Linoleico Conjugado
Células de Carcinoma Retal de Murinos Ciclooxigenase
DII Doença inflamatória intestinal DNA Ácido Desoxirribonucleico
DNBS Ácido 2,4- dinitrobenzeno sulfônico DSS Sulfato de Sódio Dextrana
DTNB ELISA
Ácido Ditiobisnitrobenzóico
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ERN Espécies reativas de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigénio GAPDH
GMP
Glideraldeido 3-fosfato Desidrogenase Guanosina Monofosfato Cíclica GSH Glutationa Reduzida
HCl HLA HTAB
Ácido Clorídrico Histocompatibilidade
Brometo de Hexadeciltrimetilamônio IAD
ICAM-1
Índice de Atividade da Doença Molécula de Adesão Intercelular-1 IL Interleucina
iNOS Sintase do óxido nítrico induzida LPS Lipopolissacarídeo
LTB4 Leucotrieno B4
MDA Malondialdeído
MMP Metaloproteinases de matriz MPO Mieloperoxidase
MUC Mucina
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato NF-kB
NO
Factor Nuclear kappa B Óxido Nítrico
NOD Nucleotide-binding-oligomerisation-domains
PAMP Padrão molecular fitogeneticamente conservado asssociadoao patógeno (pathogen-associated molecular patterns)
PBS PCR-RT
Tampão fosfato-salino
Reação de Cadeia Polimerase em Tempo Real RAW
RNA RPMI
Células de Macrófagos de Murinos Ácido Ribonucléico
Roswell Park Memorial Institute Medium
SAZ Sulfassalazina
Ta Temperatura de Anelamento TCA Ácido Tricloroacético Th Célula T helper
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 18
2 REVISÃO DA LITERATURA 20
2.1 DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL 20
2.1.1 Etiopatogênese
2.1.1.1 Resposta Imune
2.1.1.1.1 Resposta Imune alterada 2.1.1.2 Estresse Oxidativo
2.1.1.3 Fatores Ambientais 2.1.1.4 Fatores Genéticos
2.1.2 Estratégias terapêuticas
2.1.2.1 Aminossalicilatos 2.1.2.2 Corticosteroides 2.1.2.3 Imunossupressores 2.1.2.4 Agentes biológicos
2.1.2.5 Tratamento complementar: evidências científicas 2.2MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLITE
2.2.1 Modelo de indução por Ácido Acético 2.2.2 Modelo de indução por DNBS e TNBS 2.2.3 Modelo de indução por DSS
2.3 LEITE E SORO CAPRINOS: ALIMENTOS COM POTENCIALIDADE FUNCIONAL
2.3.1 Peptideos Bioativos
2.3.2 Ácido Linoleico Conjugado - CLA 2.3.3 Oligossacarídeos
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO SORO DE LEITE CAPRINO 3.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA INTESTINAL DO SORO DE LEITE CAPRINO
3.2.1 Experimento in vivo 1: colite induzida por ácido acético
3.2.1.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal
3.2.1.1.1 Indução da colite por ácido acético
3.2.1.1.2 Índice de Atividade da Doença
3.2.1.1.3 Avaliação do dano macroscópico intestinal 3.2.1.1.4 Conteúdo Total de Glutationa
3.2.1.1.5 Determinação de Malondialdeído
3.2.1.1.6 Determinação da atividade da enzima mieloperoxidase 3.2.1.1.7 Análise de citocinas e leucotrieno B4
3.2.1.1.8 Análise Histopatológica
3.2.1.1.9 Avaliação Imunohistoquímica: marcadores COX-2, iNOS, MMP-9 e SOCS-1
3.2.2 Experimento 2: colite induzida pelo ácido 2,4 dinitrobenzeno sulfônico (DNBS)
3.2.2.1 Avaliação do processo inflamatório intestinal
3.2.2.1.1 Indução da colite por DNBS
3.2.2.1.2 Indice de Atividade da Doença e Relação Peso/ Longitude 3.2.2.1.3 Explantes intestinais
3.2.2.1.4 Avaliação Histopatológica e Imunohistoquímica 3.2.2.1.5 Análise de expressão gênica
3.2.3 Experimento in vitro: resposta celular
3.2.3.1 Dosagem de Nitrito 3.2.3.2 Determinação de IL-6 3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
REFERÊNCIAS 4 RESULTADOS
4.1 ARTIGO 1 4.2 ARTIGO 2
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA NO USO ANIMAL ANEXO B – CARTA DE ACEITE DA REVISTA JOURNAL OF DAIRY SCIENCE
1 INTRODUÇÃO
A Doença Inflamatória Intestinal (DII) é uma condição inflamatória crônica que acomete o trato digestório, caracterizada por períodos de exacerbações e remissões dos sinais e sintomas, compreendendo principalmente a Doença de Crohn e a Colite ulcerativa. A inflamação intestinal descontrolada pode levar a uma má qualidade de vida e requer intervenções médicas e/ ou cirúrgicas.
Embora a etiologia ainda não esteja bem definida, a DII envolve um conjunto de fatores ambientais, genéticos e imunológicos. A alta ingestão de fibra alimentar, incluindo frutas e legumes, apresenta ação protetora contra as DII, por outro lado a ingestão de alimentos ricos em ácidos graxos saturados tornam o organismo mais suscetível à doença (KRISHNAN; KORZENIK, 2002; FROLKIS et al., 2013). Além de uma dieta inadequada, fumo, microrganismos patogênicos, uso de anti-inflamatórios não esteroidais dentre outros podem levar a perturbações da microbiota intestinal, apresentando papel importante na patogênese da DII.
O processo inflamatório intestinal é inicialmente desencadeado pelo aumento da permeabilidade da barreira epitelial para os antígenos luminais, conduzindo a uma ativação inadequada do sistema imunitário da mucosa (DEDON; TANNENBAUM, 2004; HYUN; MAYER, 2006). Isso resulta em um aumento na ativação e influxo de neutrófilos e macrófagos, com produção de vários mediadores pró-inflamatórios, como espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN), eicosanóides, citocinas, quimiocinas (STROBER; FUSS, 2011; SHIN et al., 2015, SINGH et al., 2016) e expressão de importantes moduladores da resposta inflamatória como a ciclooxigenase 2 (COX-2) e óxido nítrico sintase induzida (iNOS) (ARDIZZONE; PORRO, 2005; SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN; 2013).
apresentem propriedades funcionais que possam reduzir a inflamação, contribuindo para a melhoria do quadro do paciente portador colite.
Tem sido discutido o potencial de nutracêuticos, alimentos funcionais e suplementos alimentares na minimização de problemas com a saúde, em especial aqueles relacionados a alterações no trato gastrintestinal. A curcumina, ácidos graxos ômega 3, glutamina, probióticos e outros nutracêuticos mostram-se promissores como
coadjuvantes ao tratamento das DII (O’SULLIVAN; NORD, 2002; GÁLVEZ;
COMALADA; XAUS, 2010; ANDERSEN et al., 2012). Além disso, alguns compostos bioativos como peptídeos, ácido graxo linoleico e oligossacarídeos na matriz láctea bovina e caprina tem sido de interesse pela comunidade científica (AHMED et al., 2015; MARTINEZ-FÉREZ et al., 2006; THUM et al., 2015).
Com relação ao leite caprino, poucos estudos verificaram o efeito benéfico de seus componentes bioativos na atividade anti-inflamatória intestinal, como mostrados por Lara-Villoslada et al. (2006) e Daddaoua et al. (2006) e mais recentemente do nosso grupo de estudo (ASSIS et al., 2016), no entanto, ainda não foi investigada a atividade do soro de leite caprino ou de suas frações isoladas nas DII. O soro do leite caprino constituiu um importante derivado lácteo, muitas vezes desprezado ou subutilizado, no entanto, esta matriz alimentar vem ganhando espaço no mercado, justificando-se a necessidade de investigações e aprofundamento sobre suas propriedades funcionais.
Dessa forma, o presente trabalho avaliou o potencial efeito anti-inflamatório do soro de leite caprino na colite experimental e na resposta celular. Neste sentido, os experimentos consistiram em verificar o efeito do soro de leite caprino no processo inflamatório intestinal por meio da avaliação do dano macroscópico intestinal, marcadores bioquímicos de inflamação (mieloperoxidase, citocinas e leucotrieno B4);
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL (DII)
A DII é complexa, sendo representada principalmente pela Doença de Crohn (Crohn Disease, CD) e retocolite ulcerativa inespecífica ou apenas colite ulcerativa (Ulcerative colitis, UC). Inclui, inflamações não infecciosas do intestino, necessitando ainda de investigações pelos gastroenterologistas e imunologistas (STROBER; FUSS; MANNON, 2007; PODOLSKY, 2002).
Uma alta prevalência da DII tem sido constatada nas populações da América do Norte e Europa, com incidência mais acentuada na segunda metade do século XX, devido ao maior desenvolvimento industrial e urbanização constante. Além disso, as populações anteriormente consideradas de "baixo risco" (como no Japão e Índia) estão vivenciando um aumento na incidência (ANANTHAKRISHNAN, 2015). No Brasil, a escassez de estudos e divulgação em meios científicos sobre as DII contribui para o atraso no diagnóstico e aumento da morbidade (OLIVEIRA; EMERICK; SOARES, 2010).
As DII são caracterizadas por inflamação intestinal crônica e recidivante, com produção anormal de citocinas, aumento da expressão de moléculas de adesão e infiltrado celular, levando a um dano da mucosa e apoptose celular (MANDALARI et al., 2011). É crucial a determinação do grau de severidade ou atividade da ambas as doenças, uma vez que a gravidade, duração e a localização da doença são importantes na resposta ao tratamento (CARUSO, 2014).
DII é uma doença inflamatória crônica recidivante, caracterizada por aumento da permeabilidade epitelial, edema, e infiltração de leucócitos do cólon. E embora grandes avanços tenham sido conquistados no tratamento desta doença nas últimas décadas, ainda não existe uma terapia definitiva, necessitando de mais esclarecimentos sobre os mecanismos envolvidos na sua patogênese (SANDS, 2000; ANANTHAKRISHNAN, 2015).
Os pacientes com CD relatam sintomas gastrointestinais de dor abdominal, diarreia e sangramento retal, bem como sintomas sistêmicos de perda de peso, febre e fadiga. Além disso, podem desenvolver estenoses com obstrução intestinal e conexões inflamatórias entre os segmentos do intestino ou entre o intestino e a pele e outros órgãos (FUSS et al., 2004).
A UC é uma doença inflamatória não transmural que afeta o reto e se estende ao cólon (proximal) com uma inflamação contínua da mucosa comprometendo parte do intestino grosso (GRAMLICH; PETRAS, 2007). A sintomatologia da UC geralmente inclui diarreia sanguinolenta, dor abdominal e eliminação de pus e/ou muco durante as evacuações (WEYLANDT et al., 2007). Essa enfermidade pode ser classificada quanto ao padrão de distribuição (proctite, pancolite extensa e colite distal), atividade (remissão, leve, moderada e grave) e curso (assintomático após surto inicial, aumento da intensidade com o tempo, sintomas crônicos contínuos ou reincidivantes) da doença (MEIER; STURM, 2011).
2.1.1 Etiopatogênese
Embora a patogênese ainda não esteja totalmente esclaredia, há um consenso, de que as DII são o resultado de alguns componentes básicos que apresentam grande interação: fatores ambientais, variações genéticas no hospedeiro, fatores luminais (relacionados a microbiota intestinal, seus antígenos e produtos metabólicos e os antígenos alimentares), relacionados à barreira intestinal (incluindo os aspectos referentes à imunidade inata e à permeabilidade intestinal), e à imunorregulação (incluindo a imunidade adaptativa) (CARUSO, 2014; GALVEZ; COMALADA; XAUS, 2010; MOLODECKY; KAPLAN, 2010; SANG et al, 2014; ANANTHAKRISHNAN, 2015).
Os estudos em modelos murinos das duas formas de DII sugerem que são causadas por uma desregulação da resposta imune da mucosa por antígenos na microbiota (STROBER; FUSS; BLUMBERG, 2002).
2.1.1.1 Resposta Imune
bacteriana (ECKBURG et al., 2005). A homeostase intestinal envolve uma ação coordenada entre células epiteliais e células da resposta imune inata e adaptativa. Contudo, a patogênese da DII considera que existe uma interação disfuncional entre a microbiota intestinal com a ativação do sistema imunológico da mucosa (STROBER; FUSS; MANNON, 2007).
A imunidade inata apresenta como principal característica a capacidade de distinguir um microrganismo do outro, sendo responsável pela proteção inicial contra as infecções. O sistema imune inato possui estratégias para o reconhecimento de microrganismos, uma das quais é o reconhecimento do padrão molecular fitogeneticamente conservado, associado ao patógeno (pathogen-associated molecular patterns– PAMP). O reconhecimento deste por meio da ativação de receptores do tipo
toll-like (TLR) acarreta a secreção de citocinas e o consequente início da resposta inata, com recrutamento e ativação de neutrófilos e macrófagos, cujo fato é essencial para a morte do patógeno (ROGERO; FOCK; BORELLI, 2013; PEARL et al., 2013).
Quando essa resposta inflamatória for insuficiente, não eliminando esses produtos microbianos a imunidade adquirida será estimulada. A resposta imune adaptativa é iniciada quando os antígenos são apresentados a célula CD4+, quando ativadas podem ser diferenciadas em células T helper (Th), Th1 e Th2 (PALLONE; MONTELEONE, 2001).
2.1.1.1.1 Resposta Imune alterada
Uma alteração existente na microbiota intestinal, quer no tipo ou número dos organismos que compreendem a população, ou forma em que os mesmos confrontam o sistema imune da mucosa, que resulta em uma perda de tolerância, uma vez que a microbiota é capaz de induzir uma resposta do sistema imune normal a antígenos microbianos em excesso (STROBER; FUSS; MANNON, 2007). De forma similar, uma inflamação na barreira epitelial intestinal aumenta sua permeabilidade, levando também à ativação inapropriada do sistema imune da mucosa em pacientes com DII (HYUN; MAYER, 2006; LARA-VILLOSLADA et al., 2006).
(sistema imune adaptativo), bem como mediadores de inflamação (citocinas e quimiocinas) (ROGERO; FOCK; BORELLI, 2013).
Na DII, os antígenos luminais ganham acesso ao tecido da mucosa subjacente através de uma barreira permeável ou mesmo por uma susceptibilidade da mucosa. Células da resposta imune inata e adaptativa expressam um perfil diferente e número de receptores de reconhecimento de padrões moleculares. Ocorre um aumento da resposta mediada por células T, sendo que as células ativas Th1, Th2 e Th17 predominam sobre as células T reguladoras (Th3, Tr). Na CD, as células T imatura (Th0) diferenciam preferencialmente em células Th1, que leva a uma produção aumentada de INF- e IL -12, e na UC, estas células se diferenciam em Th2, produzindo 4, 5 e 13 e IL-17 em maiores quantidades (STROBER; FUSS; MANNON, 2007; BAUMGART; CARDING, 2007; FUSS et al, 2004), Figura 1.
Novos componentes e características do sistema imunológico celular foram descobertos nas últimas décadas que revolucionaram a compreensão dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de DII, é o caso das células Th17. A Th17 produz IL-17 e IL-23, potentes indutoras de inflamação que estimulam infiltração celular e a produção de citocinas pró-inflamatórias (BAUMGART; CARDING, 2007; GÁLVEZ, 2014).
O desenvolvimento e a cronicidade das lesões, tanto na CD como na UC, podem ser explicados pela cascata inflamatória, responsável pelo aumento das citocinas pró-inflamatórias que está associada com o início e a progressão da doença (MÛZES et al., 2012). O desequilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias que ocorre na DII impede a resolução da inflamação e leva a perpetuação da doença (NEURATH, 2014).
Figura 1 - Vias de interação entre microbiota e células do sistema imune nas DII
Fonte: Michielan & D’Incà (β015); Ordás et al. (2012), adaptada pelo autor.
Na DII, a inflamação do epitélio aumenta a permeabilidade da barreira intestinal, que conduz à ativação do sistema imune da mucosa indevidamente, caracterizada principalmente por exacerbações agudas associadas a um aumento do influxo de neutrófilos e ao recrutamento de mediadores inflamatórios, incluindo metabolitos de nitrogênio, ERO, como superóxido, radical hidroxila, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso, além de proteases, eicosanóides, citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (DEDON; TANNENBAUM, 2004; HYUN; MAYER, 2006; STROBER; FUSS, 2011; BAUMGART; CARDING, 2007).
As primeiras citocinas liberadas na resposta inflamatória pelo macrófagos ativados incluem a IL-1 , IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), que ativam fatores pró-inflamatórios de transcrição para produzir outras citocinas, e exercem um papel fundamental na patogênese nos pacientes com DII e colite experimental (Strober & Fuss, 2011).
A IL-1 é uma citocina pró-inflamatória que desempenha um papel central nas respostas inflamatórias do intestino, provocando um aumento na permeabilidade epitelial intestinal (AL-SADI; MA, 2007; AL-SADI et al., 2013). Existe um desequilíbrio de IL-1 e o seu antagonista que ocorre naturalmente no tecido intestinal de doentes com CD, sugerindo a falta de capacidade intrínseca para neutralizar o efeito da citocina (O’NEILL; DINARELLO, 2000).
A IL-6 é melhor caracterizada como uma das citocinas pró-tumorogênicas e juntamente como outros membros da sua família afetam a proliferação, sobrevivência, diferenciação, migração celular etc. É ativada pela via de sinalização Janus Kinase/Transdutores de Sinal e Ativadores de Transcrição 3 (JAK/STAT-3), sinais importantes para o desenvolvimento de colite murina (TANIGUCHI; KARIN, 2014). Uma inibição da IL-6 em pacientes com DII, não só pode reduzir a inflamação intestinal, mas também o risco de desenvolvimento de câncer colorretal (WALDNER; NEURATH, 2014). Alguns autores relatam que a carcinogênese pode estar relacionada com a cronicidade da inflamação e um dano causado pela ativação prolongada das vias de sinalização responsáveis pela renovação celular continuada. A severidade, o tempo e a extensão das DII está relacionada ao maior risco para o surgimento de uma neoplasia (MCDONALD et al., 2006; JESS et al., 2006).
Uma outra citocina é a IL-7, que está envolvida no desenvolvimento de condições inflamatórias crônicas, incluindo a DII e doenças auto-imunes quando produzida em excesso. Por outro lado, em baixas concentrações, a IL-17 desempenha um papel chave na defesa do hospedeiro extracelular de bactérias e fungos contra infecções (BERINGER; NOACK; MIOSSEC, 2016).
da transcrição de outros mediadores pró-inflamatórios, e induz a expressão de diversos genes envolvidos nos processos anti-apoptóticas e pro-metastáticos (SALAS et al, 2002, NAUGLER; KARIN, 2008, AGARWAL et al, 2004).
Além da expressão de proteínas inflamatórias, ocorre um aumento da produção das enzimas COX-2, lipoxigenase (LOX), iNOS (SAKTHIVEL; GURUVAYOORAPPAN, 2013; JOBIN, 2008; ARDIZZONE; PORRO, 2005). A COX-2 e a LOX participam do metabolismo do ácido araquidônico, gerando produtos como prostaglandinas e tromboxanos, e leucotrienos, respectivamente. Estes eicosanóides são importantes produtos de ativação de neutrófilos e macrófagos, com a capacidade de recrutar e ativar uma gama de células efetoras (CROOKS; STOCKLEY, 1998; WHITTLE et al., 2008) com destaque para o leucotrieno B4 (LTB4), um potente
quimiotático que tem sido descrito como um mediador patogênico na inflamação intestinal (GÁLVEZ et al., 2001).
A expressão da COX e iNOS são reguladas por NF-kappaB (NF-kB) e contra-reguladas pelo supressor de NF-kB que pode atenuar a colite experimental em camundongos (NEURATH et al., 1996). A enzima COX-2 apresenta baixa expressão no epitélio intestinal normal, sendo induzida nas células apicais do epitélio inflamado do íleo terminal e cólon, apresentando-se aumentada na DII, tanto na forma aguda quanto na crônica (JIANG, 2006). A Figura 2, mostra que o NO é produzido a partir da ação do óxido nítrico sintase (NOS) na presença do substrato L-arginina, e que a NOS pode estar disponível nas isoformas constitutiva e induzida (MARLETTA, 1994).
A NOS constitutiva (cNOS) é regulada pela ação do cálcio e de ligação da calmodulina e está presente no sistema nervoso como a NOS neuronal (nNOS) ou no endotélio vascular como a óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). A cNOS produz baixos níveis de NO, que ativa a guanilato ciclase solúvel e os resultados da produção do segundo mensageiro Guanosina Monofosfato Cíclica (GMP) em locais em todo o corpo, incluindo o trato da mucosa gastrointestinal (CROSS; WILSON, 2003; WILSON et al., 1996). Por outro lado, a iNOS é induzida pelas citocinas TNF-α, IL-1, IFN- , e por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) em uma variedade de tipos de células. Na DII, a iNOS é expressa em células epiteliais e nos macrófagos teciduais da mucosa inflamada (DIJKSTRA et al., 2002).
células caliciformes que constituem um componente importante do epitélio intestinal, uma vez que são responsáveis pela produção de peptídeos cruciais para a defesa e reparo do epitélio da mucosa intestinal (MASHIMO et al., 1996; KIMURA et al., 1997). O NO é potencialmente tóxico, em grandes quantidades, estando presente, particularmente, em situações de estresse oxidativo, na geração de intermediários do oxigênio e na deficiência do sistema antioxidante; e pode apresentar ação potente sobre a adesão de leucócitos e quimiotaxia (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003).
Figura 2 - Representação esquemática das ações do óxido nítrico (NO) indicando os efeitos fisiológicos e patológicos das isoformas de óxido nítrico sintase constitutiva (c) e induzida (i)
Fonte: Cross e Wilson (2003).
2.1.1.2 Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre o excesso de produção de radicais livres e o sistema de defesa antioxidante. Destacam-se ERO, como o peróxido de hidrogênio, ânions superóxido e radicais hidroxilo e ERN, como peroxinitrito e NO, além de outras substâncias potencialmente tóxicas. O excesso de ERO e ERN pode ser verificado como um processo de intermediação de doenças como inflamação, isquemia, trauma, doenças degenerativas e morte celular por ruptura da membrana (lipoperoxidação) e inativação enzimática (KOURY; DONANGELO, 2003).
A produção de radicais livres ocorre como um processo contínuo e fisológico nas funções biológicas do organismo. Em quantidades adequadas possibilita a geração de energia, ativação de genes e na participação de mecanismos de defesa durante o
Pequenos níveis de cNOS (fisiológico)
Guanilato ciclase solúvel
Guanosina monofosfato
cíclica
Altos níveis de iNOS (tóxico)
Respiração mitocontrial Outra enzima FeS Apoptose
processo de infecção. Contudo, em quantidades elevadas pode levar a um dano oxidativo (BARBOSA et al., 2010).
Na patogênese da DII, o estresse oxidativo também desempenha um papel importante, podendo influenciar na inflamação intestinal através de mecanismos que resultam na produção de citocinas pró-inflamatórias, ativação de macrófagos, alteração da permeabilidade e da microbiota intestinal (BONAZ; BERNSTEIN, 2013; BAILEY et al., 2011).
Os radicais livres são responsáveis pela peroxidação de lipídeos que é um processo de reação em cadeia, iniciado geralmente por um radical hidroxila, o qual tem a capacidade de retirar um átomo de hidrogênio da molécula de lipídeo. Este ataque ocasiona a fragmentação de lipídeos poli-insaturados e gera produtos secundários, como o malondialdeido (MDA), que reage com proteínas e fosfolipídeos, inclusive com o Ácido Desoxirribonucleico (DNA), causando lise e morte celular (BARREIROS; DAVID, 2006).
O excesso de radicais livres no organismo é combatido por sistemas de defesa antioxidantes endógenos, com a participação das enzimas superóxido dismutase, glutationa peroxidase e a catalase, capazes de neutralizar o estresse oxidativo na mucosa intestinal e como papel importante no reparo do DNA (MANDALARI et al., 2011; ROESSNER et al., 2008).
A enzima superóxido dismutase catalisa a dismutação do ânion radical superóxido a peróxido de hidrogênio e oxigênio; a catalase atua na decomposição de peróxido de hidrogênio, oxigênio e água; e a glutationa peroxidase, que atua sobre peróxidos em geral, com utilização de glutationa como co-fator (VASCONCELOS et al., 2007). Outros antioxidantes podem ser provenientes da dieta como o αtocoferol, -caroteno, ácido ascórbico, e compostos fenólicos, em especial flavonoides (HALLIWELL et al., 1995).
2.1.1.3 Fatores Ambientais
microbianos, permeabilidade intestinal e apendicectomia (DANESE; SANS; FIOCCHI, 2004; HO; BOYAPATI; SATSANG, 2015).
A relação entre o tabagismo e DII é um pouco intrigante. Estudos mostram que o hábito de fumar é um fator de risco para o desenvolvimento de CD, ou complicações na doença (formação de fístulas e estenoses). Os efeitos do tabagismo resultam na soma dos efeitos contraditórios de várias substâncias, incluindo nicotina e monóxido de carbono, além de serem modulados por: gênero, antecedentes genéticos, localização da doença e atividade, dose e concentração de nicotina do cigarro (COSNES, 2004). O aumento da concentração de monóxido de carbono pode amplificar o comprometimento da capacidade de vasodilatação nos microvasos cronicamente inflamados, resultando em isquemia e perpetuando em ulceração e fibrose (PULLAN, et al., 1994; HATOUM et al., 2003).
Por outro lado, o tabagismo pode exercer um efeito protetor no aparecimento da UC (CALABRESE et al., 2012). Esse efeito tem relação com os níveis de citocinas pró-inflamatórias IL-1 , IL-8 e TNF-α no cólon, sendo significativamente menores em fumantes, do que não-fumantes com colite (ALDHOUS et al., 2008; BAUMGART; CARDING, 2007). Isso foi demostrado em estudos in vivo em modelos de colite ulcerativa que revelaram que a nicotina tem um efeito inibitório sobre Th-2, mas não exerce efeito inibitório em células Th-1 (COSNES, 2004).
Outro fator ambiental relacionado a patogênese da DII é a dieta que tem sido amplamente estudada. Mas os resultados devem ser interpretados com cautela, pois os pacientes podem mudar sua dieta antes do diagnóstico, para reduzir os sintomas da doença. Estudos demonstraram que uma alta ingestão de fibra alimentar, incluindo frutas e legumes, protege contra DII. O mecanismo pelo qual as frutas e legumes pode conferir proteção está relacionado com a sua capacidade de modificar enzimas envolvidas na remoção de ERO (AMRE et al., 2007).
Estudos tem mostrado a relação epidemiológica de causa-efeito entre o uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) e DII. Santos et al., (2006) mostraram que além de efeitos adversos no trato gastrintestinal superior, o uso contínuo de AINEs pode provocar lesões no intestino delgado e cólon. Em modelos animais de colite espontânea usando camundongos deficiente deIL-10, a administração de AINEs não seletivos demostrou uma rápida e severa inflamação colônica associada ao bloqueio da proteção de protaglandinas E2 e alteração imune da mucosa (BERG et al., 2002).
2.1.1.4 Fatores Genéticos
Em 2001, foi descoberto o primeiro gene de susceptibilidade para a CD, o domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeos (NOD2), localizado no cromossomo 16q12 (OGURA et al., 2001; HUGOT et al., 2001). Atualmente mais de 160 locus genéticos foram associados com a susceptibilidade da DII (JOSTINS et al., 2012).
Em estudos genéticos de coorte em pacientes com CD, foram identificadas mutações no gene de Domínio do Recrutamento e Ativação de Caspase (CARD15), que codifica NOD2, sendo responsável por 10-15% da prevalência da doença (SARTOR, 2006; MOLODECKY; KAPLAN, 2010). Um modelo murino de mutação do gene CARD15 mostrou perda de sua função e produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias em resposta a sinalização mediada pelo TLR em macrófagos deficientes de CARD15 (STROBER et al., 2006).
Embora os camundongos deficientes em NOD2 sejam mais susceptíveis à infecção por agentes patégenos bacterianos específicos, ainda não se sabe até que ponto a deficiência de NOD2 pode alterar a resposta imune do hospedeiro para destruir bactérias comensais (DESHMUKH et al., 2009).
Outros genes também são conhecidos que estão envolvidos na regulação da imunidade inata (genes de Histocompatibilidade - HLA, genes NOD, genes de interleucina), gene associado à produção alterada de adipocinas (ATG16L1), aqueles envolvidos nas funções epiteliais (genes de mucina), dentre outros (OGURA et al., 2001).
de portadores dessa doença, indicando ainda o papel da IL-23 na resposta inflamatória crônica a bactérias luminais (RIOL-BLANCO et al., 2010).
Mais de 50% dos locus genéticos de susceptibilidade da DII também estão associados a outras doenças auto-imunes e inflamatórias. Estes genes sobrepostos podem ter efeitos contrastantes em diferentes doenças (KHOR; GARDET; XAVIER, 2011). A exemplo das variantes genéticas MST1, IL2, CARD9 e REL que são compartilhados entre UC e a colangite esclerosante primária, uma inflamação das vias biliares; e o NOD2, C13orf31 e LRRK2, compartilhado com o Mycobacterium leprae e a CD (ZHANG et al., 2009; JANSE et al., 2111).
Os sintomas articulares constituem a manifestação extra-intestinal mais comum em pacientes com UC e DC. Polimorfismos do gene CARD15 já foram associados a um risco maior de se desenvolver DC e são considerados preditores tanto de doença inflamatória intestinal crônica em pacientes com espondiloartrites quanto de sacroiliíte em acometidos por DC (LANNA et al., 2006).
2.1.2 Estratégias terapêuticas
Os principais objetivos para o tratamento da DII são promover a remissão dos sintomas da fase aguda, manter a remissão por controle da inflamação crônica, para impedir a reativação do processo inflamatório intestinal, diminuir as complicações associadas ao tratamento e à doença, e melhorar a qualidade de vida dos pacientes (CHINYU; GARY, 2004).
2.1.2.1 Aminossalicilatos
Os aminossalicilatos medicamentos que contêm na sua molécula de ácido 5-aminossalicílico (5-ASA ou mesalazina), que contém propriedades terapêuticas. Seu mecanismo de ação não é plenamente estabelecido, embora seja conhecido por estar envolvido na inibição da síntese de produtos do ácido araquidônico, inibição da quimiotaxia sobre os macrófagos intestinais e recrutamento leucócitos (ACOSTA, 2016). Além de reduzirem a secreção de anticorpos pelas células mononucleares, diminuírem a secreção de citocinas pró-inflamatórias, e inibirem o fator NF-κB ou devido a uma ação antioxidante (WHITTLE; VARGA, 2010).
Meta-análises têm mostrado a eficácia da administração de 5-aminossalicilato via retal como terapia de indução em pacientes com ligeira a moderada proctite ulcerosa ativa ou da colite instalada mais ao lado esquerdo do cólon (BRESSLER et al., 2015).
A maioria dos efeitos adversos do fármaco tem sido relacionada a intolerância gástrico, alergias de pele, anemia hemolítica, hepatite, pancreatite e oligospermia, embora tenha sido demonstrado que tratamento com sulfassalazina é eficaz em induzir a remissão de surtos de UC leve a moderada (ACOSTA, 2016).
2.1.2.2 Corticosteroides
Os corticoides são a segunda opção após falha dos aminossalicilatos, mas estes também estão associados com uma incidência relativamente alta de efeitos adversos (GISBERT et al., 2002; GONZALEZ-LAMA et al., 2012).
Os corticosteróides "clássicos" ou "convencional" (prednisona, prednisolona, metilprednisolona) que foram e continuam sendo usados no tratamento de escolha para surtos graves, apresentam limitações importantes como o desenvolvimento da doença metabólica dos ossos e das complicações infecciosas, devendo usar uma dose mais eficaz por um menor tempo possível, e associar uma suplementação com o cálcio e vitamina D durante o tratamento (ACOSTA, 2016).
início) a corticoterapia oral sem recorrência dos sintomas (TURNER et al., 2007; BRESSLER et al., 2015).
2.1.2.3 Imunossupressores
Os medicamentos imunossupressores são utilizados no tratamento das DII, por serem eficazes em induzir a remissão da doença, contudo sem benefícios para mantê-la, e portanto, não devem ser mantidos por um longo prazo (CARBONNEL et al., 2016).
A ciclosporina, um fármaco de resgate para doentes refratários a esteroides e com colite severa (HANAUER, 2008). Já foi demonstrada ser benéfica em crises graves, apesar de efeitos colaterais, incluindo hipertensão, nefrotoxicidade e desequilíbrio eletrolítico estarem frequentemente associados ao seu uso (MOCCIARO et al., 2012).
2.1.2.4 Agentes biológicos
Técnicas de investigação estão em avanço constante, conduzindo progressivamente a uma maior compreensão dos principais processos fisiopatológicos subjacentes a estas doenças, permitindo por sua vez o desenvolvimento de terapias novas e poderosas (STROBER; FUSS; MANNON, 2007).
Um grande avanço na terapia das DII foi a introdução do tratamento com anticorpos monoclonais de TNF-α (anti-TNF) como o infliximabe, o adalimumabe e o certolizumabe. A terapia com esses agentes biológicos é usada em casos moderados/severos que não apresentam resposta aos tratamentos anteriores (ARDIZZONE; PORRO, 2005; NGO et al., 2010; TARGAN, 2006). Contudo não mostraram eficácia em todos os pacientes, sendo sua utilização limitada por baixas taxas de remissão ao longo prazo e por um risco de infecções graves, incluindo infecções oportunistas (NYBOE et al., 2015).
No entanto, apesar destes fármacos demonstrarem eficácia clínica, existe uma proporção importante de efeitos secundários que podem limitar a sua utilização a longo prazo (SIEGEL, 2011), como o aumento do risco de infecção, as reações do lupus e a formação de anticorpos antinucleares (WALSH; MABEE; TRIVEDI, 2011).
Neste contexto, novas terapias para a DII que combinam eficácia e segurança são necessárias. Entre estas, as intervenções dietéticas com nutracêuticos e/ ou alimentos funcionais parecem representar uma alternativa segura para modular a resposta imune alterada da mucosa que ocorre na inflamação intestinal, sendo conseguida principalmente através do seu impacto sobre a microbiota intestinal, como foi relatado por prebióticos (ROBERFROID et al., 2010).
2.1.2.5 Tratamento complementar: evidências científicas
Condições patológicas crônicas, como inflamações intestinais e câncer geralmente exigem tratamentos longos ou estão associados com períodos alternados de remissão e recidiva. Atualmente, tem sido apresentada a associação das terapias tradicionais com probióticos, melhorando significativamente o quadro clínico da colite ulcerativa em humanos (HEGAZY; EL-BEDEWY, 2010; LEBLANC; LEBLANC, 2016) e em ensaios animais (FITZPATRICK et al., 2008; HERIAS et al., 2005; PHILIPPE et al., 2011). O consumo de probióticos no leite e leite fermentado forneceu proteção contra a perda de peso e inflamação intestinal em um modelo murino de colite induzido por DSS como relatado por Lee et al. (2015).
Entre as investigações sobre o efeito anti-inflamatório de plantas, a curcumina (Curcuma longa, o componente ativo do açafrão) levou a remissão da doença em seres humanos, sendo a terapêutica mais promissora até agora (BALIGA et al., 2014). Além disso, apresenta ações farmacológicas, incluindo efeitos anti-inflamatórios, antioxidante, antitumoral, e como alternativa no tratamento das DII, podendo ser utilizada como uma terapia adjunta para indivíduos que procuram uma combinação à medicina convencional (JURENKA, 2009; TAYLOR, LEONARD, 2011). Em estudos animais com colite, a curcumina regulou negativamente a expressão de genes inflamatórios (JIANG, 2006).
Dados recentes sugerem que a vitamina D ou seu receptor pode ter um papel na patogênese e no curso da DII. Em ratos, a deficiência de 1,25-di-hidroxi vitamina D3 (1,25 (OH) 2D3) está associada com um risco aumentado de desenvolvimento de colite. Sua administração melhorou a inflamação e suprimiu a expressão de genes pró-inflamatórios, incluindo TNF-α (FROICU; CANTONA, β007; FROICU; ZHU;
CANTONA, 2006).
Além disso, glutamina (VICARIO et al., 2007), histidina (ANDOU et al., 2009), taurina (ZHAO et al., 2007), e curcumina (UNG et al., 2009) foram relatados ter efeitos anti-inflamatórios em modelos experimentais de DII. Esses resultados mostram que dietética podem ser uma alternativaa de melhorar a inflamação intestinal.
2.2MODELOS EXPERIMENTAIS DE COLITE
Com intuito de compreender os mecanismos envolvidos na patogênese das DII, vários modelos animais foram desenvolvidos nas últimas décadas, como o de indução química por 2,4-dinitrobezeno sulfônico (DNBS), 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS), ácido acético, oxazolona, sulfato de sódio dextrana (DSS), etc. Embora esses modelos não representem na totalidade a complexidade da doença que acomete o homem, são importantes para análise de muitos aspectos importantes das DII que são difíceis de serem estudados em humanos.
Os modelos animais são considerados ferramentas valiosas e indispensáveis que fornecem uma grande variedade de opções para investigar o envolvimento de vários fatores na patogênese da doença, contribuindo para avaliar diferentes opções terapêuticas e selecionar os tratamentos mais eficientess e seguros (PERSE; CERAR, 2012). No entanto, é importante considerar que não existe um modelo animal ideal que reproduza completamente a DII humana, uma vez que não se pode mostrar em modelos experimentais a etiologia completa dessa doença (GÁLVEZ; COMALADA; XAUS, 2010; DOTHEL et al., 2013).
Existem duas categorias principais de indução da colite, uma delas induzida por agentes químicos, mais comumente utilizados, e que reproduzem vários aspectos imunológicos e histopatológicos das DII em humanos, e existem também modelos animais em que as DII desenvolvem-se espontaneamente. Nestes modelos, as mutações genéticas relacionadas aos componentes do sistema imune causam processos inflamatórios intestinais de diversos tipos e, nestes casos, a sintomatologia inflamatória geralmente se intensifica progressivamente (GÁLVEZ, COMALADA, XAUS, 2010).
A deleção de genes responsáveis pela transcrição de algumas citocinas também pode favorecer o desenvolvimento de colite espontânea em animais. Dentre estes modelos se destacam os que utilizam camundongos knockout (modificados geneticamente) para as citocinas IL-10 e IL-2. Neste caso, os animais desenvolvem colite espontânea, devido à desregulação da interação entre as células do sistema imune e a microbiota entérica (BERG et al., 2002; BOONE et al., 2002). As mutações genéticas relacionadas aos componentes do sistema imune causam processos inflamatórios intestinais de diversos tipos e, nestes casos, a sintomatologia inflamatória geralmente se intensifica progressivamente até a morte do animal (WIRTZ et al., 2007).
pré-clínicos e de patogênese da DII (NEURATH; FUSS; STROBER, 2000; WIRTZ; NEURATH, 2007).
2.2.1 Modelo de indução por Ácido Acético
Em 1978, MacPherson e Pfeiffer propuseram um modelo experimental de indução pelo ácido acético a 10% via retal. Embora seja um modelo antigo, ainda hoje é bastante estudado, principalmente na pesquisa de fármacos eficazes contra as DII (NOA et al, 2000; GUERRA et al., 2015).
O ácido acético é usado exclusivamente para modelo agudo de colite e a sua administração intracolônica provoca um processo inflamatório similar à UC, com alterações endoscópicas e histopatológicas de fácil reprodutibilidade, no qual os mediadores inflamatórios como ERO, aminas vasoativas e eicosanoides desempenham um papel importante (CARTY et al., 2000).
A administração por via intracolônica de ácido acético em murinos provoca lesões epiteliais do cólon com necrose e inflamação associada a infiltração de neutrófilos e macrófagos no tecido colônico. A resposta inflamatória resultante desse processo é devido à produção de ERO e ao produto de influxo do conteúdo luminal para a lâmina própria, decorrente da destruição das células epiteliais (MILLAR et al., 1996). Neste modelo de indução, Guerra et al (2015) verificaram um aumento da lipoperoxidação e diminuição do conteúdo de glutationa total no homogeinado de intestino grosso distal dos ratos quando comparados ao grupo controle negativo.
A perda da barreira que se situa entre as células imunológicas e o lúmen do intestino provoca a injúria do tecido e, consequentemente, a ativação de uma cascata inflamatória. Sendo assim, a utilização deste modelo animal também contribui para uma melhor compreensão da colite humana com respeito às alterações imunológicas, já que, além de reproduzir as lesões macroscópicas na mucosa colônica, também se mostra satisfatório no padrão de citocinas expressas após a indução com o ácido acético (BERTEVELLO et al., 2005).
2.2.2 Modelo de indução por DNBS e TNBS
notavelmente pela predominância do NF-kB dependente da ativação de células Th1 (CANNARILE et al., 2009; NEURATH et al., 2002; STROBER; FUSS; BLUMBERG, 2002). Essas substâncias quando administradas por via retal promovem uma inflamação crônica mediada por células Th1, simulando uma CD com um aumento da produção de IL-12 por macrófagos que compõem a mucosa intestinal (TE VELDE; VERSTEGE; HOMMES, 2006; BOUMA; STROBER, 2003; RANDHAWA et al., 2014).
Além disso, a colite induzida por DNBS e TNBS permite estudar a patogênese da DII associada a fatores ambientais, tais como estresse e dieta, os efeitos de potenciais terapias, e os mecanismos da inflamação intestinal subjacente e lesão da mucosa (MORAMPUDI et al., 2014).
O DNBS, assim como o TNBS são haptenos administrados em combinação com etanol (40-50%), para romper a barreira da mucosa intestinal e permitir a penetração do ácido para o interior da parede do intestino. A resposta imune induzida por hapteno provoca graves ulcerações da mucosa e da barreira epitelial caracterizada pela infiltração de células mononucleares transmural (MORRIS et al., 1989).
No modelo de TNBS e DNBS, o tipo de resposta imunitária induzida por hipersensibilidade retardada é uma reminiscência da célula mediada por resposta inflamatória humana que ocorre na CD. No entanto, apenas uma dose única de TNBS ou DNBS é utilizada na maioria dos estudos pré-clínicos (TE VELDE; VERSTEGE; HOMMES, 2006).
O TNBS é metabolizado pelas enzimas do cólon produzindo uma reação imunomediada por citocinas pró-inflamatórias e substâncias citotóxicas. Nesse modelo a lesão pode ser aguda ou crônica dependendo da dose administrada (YAMADA et al., 1993).
2.2.3 Modelo de indução por DSS
O DSS provoca uma lesão mais semelhante a colite ulcerativa que é morfologicamente e macroscopicamente caracterizada por hiperemia, ulceraçõoes, moderado a severo edema na submucosa, acompanhada de lesão por mudanças histopatológica com infiltrações de granulócitos (DHARMANI; LEUNG; CHADEE, 2011).
A colite aguda geralmente é induzida pela administração contínua de 2-5% DSS por curto período (4-9 dias). Enquanto que a colite crônica pode ser induzida por um tratamento contínuo de baixas concentrações de DSS ou administração cíclica do mesmo, como por exemplo, 2 ciclos de tratamento DSS por 7 dias intercalados de 10 dias de água. As manifestações clínicas na fase crônica da colite geralmente não refletem a gravidade da inflamação ou características histológicas encontradas no intestino grosso (PERSE; CERAR, 2012).
As diferentes respostas parecem ser dependentes não só da concentração, peso molecular, a duração da exposição, fabricante e lote do DSS, mas também dos fatores genéticos (tensão e subestirpe, gênero) e microbiológicos (estado microbiológico e flora intestinal). Além disso, o aparecimento e gravidade da colite podem variar com com o estresse do animal (MELGAR et al., 2008).
O DSS é tóxico para as células epiteliais do cólon e provoca defeitos na integridade da barreira epitelial. O mecanismo de como DSS passa através das células epiteliais da mucosa permanece incerto. As primeiras mudanças relacionadas ao DSS foram observados após um dia de tratamento com DSS, sendo a perda de um da zona de oclusão-1 (ZO-1) e o aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL -1, IFN-y, IL-10 e IL-12) no cólon (ICHIKAWA-TOMIKAWA et al., 2011; LAPRISE, 2011; PORITZ et al., 2007).
Outro modelo disponível, que provou ser particularmente útil na colite é a indução por oxazolona, por administração intra-retal deste agente hapteno. Quando administrados intra-retalmente oxazolona sem sensibilização prévia, vê-se um desenvolvimento rápido da inflamação histologicamente, em que ele é marcado por uma lesão superficial edematosa, que afeta a porção distal do cólon (BOIRIVANT et al., 1998).
2.3 LEITE E SORO CAPRINOS: ALIMENTOS COM POTENCIALIDADE FUNCIONAL
Os alimentos funcionais são aqueles alimentos que se destinam a ser consumidos como parte da dieta normal e que contêm componentes biologicamente ativos como potencial na melhora da saúde ou redução do risco de doença. Exemplos de alimentos funcionais incluem alimentos que contêm minerais específicos, vitaminas, ácidos graxos ou fibra dietética, alimentos com adição de substâncias biologicamente ativas, tais como fitoquímicos ou outros antioxidantes e probióticos que contêm culturas vivas.
O leite é um produto que possui naturalmente em sua composição proteínas de alto valor biológico, lipídeos, lactose, hormônios, fatores de crescimento, nucleotídeos, enzimas, oligossacarídeos e peptídeos bioativos que apresentam efeitos benéficos à saúde (PEREIRA, 2014).
Estudos populacionais têm demonstrado que o consumo de leite e derivados estão associados a um menor risco de desenvolvimento de síndrome metabólica, hipertensão, doenças cardiovasculares e certos tipos de câncer, como o de cólon (GOLDBOHM et al., 2011) e também à melhora da densidade óssea (FAO, 2013). O leite de vaca apresenta destaque com produção mundial de 83%, e também com maior consumo mundial 50 Kg/ per capta/ ano (FAOSTAT, 2012). No entanto, esta matriz láctea não é indicada para infantes, uma vez que apresentam uma alta densidade energética, proteínas alergênicas, e menor conteúdo de imunoglobulinas e lactoferritina ideais para esta fase. O leite materno é o produto mais indicado, sendo indicado o aleitamento exclusivo até os 6 meses de vida, sendo complementar até 1-2 anos (BALLARD; MORROW, 2013).
Figura 3 - Componentes bioativos do leite de cabra e ação na Doença Inflamatória Intestinal
Fonte: Elaborado pelo autor (2016).
A cabra é um animal que se adapta muito bem a condições ambientais extremas com escassez de forragem e água, dessa maneira por muitas décadas associou-se o uso do leite de cabra com pobreza e ao subdesenvolvimento. No Nordeste Brasileiro, por muito tempo a produção e consumo do leite caprino eram comuns. Em contrapartida, em países do mediterrâneo a criação de cabras leiteiras já representavam mercado econômico importante (BOYAZOGLU; HATZIMINAOGLOU; MORAND-FEHR, 2005), devido ao interesse principalmente de produtos como queijos e iogurte (HAENLEIN, 2004). A produção leiteira mundial de cabras em 2010 foi de 2,4%, mundialmente, contudo em regiões como a África Subsaariana a produção média é 12,6%, enquanto que o Brasil detém uma produção de 0,5%, muito inferior a seu potencial (FAOSTAT, 2012).
Atualmente, não só o leite, mas os derivados caprinos (queijos, iogurtes e bebidas lácteas) tem ganhado cada vez mais destaque também nos países em desenvolvimento, no mercado produtor e consumidor, por serem promissores alimentos funcionais na promoção da saúde e prevenção de doenças.
A fabricação de queijos é uma das mais importantes, pelo crescente mercado econômico dessa matriz láctea. No entanto, apresentam alguns problemas, a exemplo da da produção do soro de queijo, a qual para produzir 1 Kg de quejo, são necessários 10 Kg de leite, resultando em 9 Kg de soro, e cerca de 50% desse soro não é aproveitado,
Compostos Bioativos do Leite Caprino
Imunoglobulinas Fator de Crescimento
Proteínas e Peptídeos Bioativos
Oligossacarídeos
Lipídios Bioativos CLA Minerais e Vitaminas
Adesão leucocitária
Imunomodulador Linfócitos
Anti-inflamatório
IL-6; IL-1 ; IL-17, TNF-α
IL-10; IL-2, Mucinas
