41extrações por SPME a partir do headspace para traçar as variações na emissão de benzenoides, aldeídos

alifáticos, sesquiterpenos e alguns derivados de ácidos graxos (Figura 12).

O H

Benzaldeído

Cadina-3,9-dieno

2-Hexanal

Decanal

FIGURA 12 | Substâncias voláteis das flores de Petunia hybrida detectadas in vivo através de SPME.

Os avanços não foram somente nas técnicas de microextração, mas também nas análises por cromatografia gasosa dos componentes extraídos, sendo que esses últimos foram tanto na detecção quanto na separação das substâncias. Entretanto, é importante ressaltar que para uma caracterização autêntica das substâncias presentes no headspace ou no óleo essencial, tais substâncias devem ser termicamente estáveis nas condições de aquecimento estabelecidas no método cromatográfico selecionado, caso contrário serão detectados e identificados artefatos.

O acoplamento do espectrômetro de massas ao cromatógrafo a gás ocorreu nos anos 50 e foi sem dúvida fundamental para a caracterização das substâncias presentes nas misturas complexas dos óleos essenciais, pois a partir disso podem ser obtidas informações sobre as estruturas químicas podendo ser empregado em estudos quantitativos e qualitativos de substâncias voláteis e semivoláteis (SNEDDON et al., 2007). Os espectrômetros de massas com fonte de ionização por elétrons (EI, Electron Ionization) foram os primeiros a serem acoplados ao cromatógrafo a gás e continuam sendo um dos mais utilizados na caracterização de componentes voláteis, porém já existem outros tipos de fontes de ionização passíveis de acoplamento com o GC (HIRAOKA, 2005).

Uma das principais vantagens da utilização desses aparelhos de GC-MS com fonte de ionização do tipo EI é a disponibilidade comercial de bibliotecas com um grande número de espectros de massas de substâncias, o que facilita na identificação das substâncias por meio da comparação entre os perfis de fragmentação (RAGUNATHAN et al., 1999). Além disso, também podem ser realizados os cálculos dos índices de retenção relativos a cada substância do cromatograma e a comparação com os índices descritos na literatura (ADAMS, 1995). Assim, com os dados de espectrometria de massas aliados aos índices de retenção pode-se propor a caracterização das substâncias de maneira mais segura.

O índice de retenção é calculado a partir de dados dos tempos de retenção de um determinado composto e dos observados para os n-alcanos de uma série homóloga. O índice de retenção é o mais difundido e utilizado, porém existem muitas outras séries alternativas para a realização da identificação de substâncias (CASTELLO, 1999), sendo que estas são menos utilizadas e cada uma delas recebe uma

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denominação particular como, por exemplo, número de carbono que é calculado a partir de ésteres metílicos de ácidos graxos saturados (WOODFORD & VAN GENT, 1960).

O acoplamento do GC com a técnica de Espectroscopia de Infravermelho (IR, Infrared Spectroscopy) surgiu nos anos 60 e próximo a esse desenvolvimento também houve a combinação desse com a MS (LOW & FREEMAN, 1967, 1968). O IR é uma técnica analítica universal, versátil e que pode ser utilizada tanto em estudos qualitativos quanto quantitativos, sendo que com o desenvolvimento da técnica com a transformada de Fourier essa se tornou mais sensível, reprodutível e rápida. A grande relevância da utilização do GC-IR é na diferenciação de isômeros, os quais não podem ser diferenciados por GC-MS (SASAKI & WILKINS, 1999). A técnica IR baseia-se nas vibrações moleculares, logo essa dependerá dos comprimentos das ligações das substâncias analisadas, massas atômicas dos átomos presentes e das interações inter e intramoleculares.

Uma das desvantagens da IR é a sensibilidade, pois apresentam limites de detecção altos quando comparados aos observados com a MS. Porém, também houve certa evolução nos tipos de interface para o IR, no qual foi possível, em alguns casos, obter detecções mais rápidas e com alta sensibilidade (GALLIGNANI & BRUNETTO, 2004). Atualmente, há disponíveis três tipos de interface que são: light pipe (LP), matrix isolation (MI) e direct deposition (DD) (SASAKI & WILKINS, 1999).

A LP, primeiro tipo de interface utilizada, é a mais simples das interfaces e apresenta baixa sensibilidade, o que acarreta problemas com relação aos limites de detecção (aproximadamente de 10 ng). Na LP os espectros de IR são obtidos em fase gasosa em um capilar de vidro de borossilicato com revestimento de ouro nas paredes (AZARRAGA, 1980), sendo que esta cela de detecção tem volume de 100-150 µL, o que limita a resolução cromatográfica (GISS & WILKINS, 1984).

Na tentativa de sanar o problema da sensibilidade da LP foram desenvolvidos outros dois tipos de interface; a MI e DD (NORTON & GRIFFITHS, 1995). Nessas duas interfaces a obtenção do espectro de IR das substâncias é realizada em fase sólida, sendo que a diferença entre elas é a forma final obtida do sólido. Na MI, a substância em fase gasosa (efluente da coluna cromatográfica) é congelada em uma matriz gasosa, geralmente contendo 2-5% de argônio, com isso há uma redução das interações intermoleculares, o que reflete na obtenção de espectros com bandas mais finas. Já na DD, as substâncias em fase gasosa são congeladas em uma janela transparente de seleneto de zinco (ZnSe) (SASAKI & WILKINS, 1999), a qual foi, posteriormente, recoberta por ouro ou prata para reduzir ainda mais o limite de detecção da DD, sendo que esta recebeu a denominação de DD-SEIRA (Direct Deposition- Surface Enhanced Infrared Absorption) (Heaps & Griffiths, 2005). Nas interfaces do tipo MI e DD, os limites de detecção são menores do que na LP, mas a utilização da DD é sem dúvida mais vantajosa, pois os espectros obtidos nessa interface são muito similares com os espectros obtidos em KBr e dessa maneira há grandes bibliotecas de espectros de substâncias para a busca de similaridade e auxílio na identificação dos isômeros (NORTON et al., 1996).

Portanto, em alguns casos para a identificação inequívoca das substâncias é necessária a utilização de mais de uma técnica de detecção, bem como a comparação dos índices de retenção. Um exemplo disso pode ser observado na análise dos constituintes do óleo essencial de Salvia sclarea L. por GC-MS e GC-IR. Em um dos picos o MS identificou a substância como sendo o monoterpeno nerol (96% de similaridade) ou o acetato de geranila (91% de similaridade) em segunda opção, porém o espectro de IR confirmou que este pico é acetato de geranila (98% de similaridade) (Figura 13). Nesse mesmo estudo, também foi possível verificar que com a técnica de subtração de espectros de IR é possível a identificação inequívoca das substâncias sem a completa separação das substâncias, no qual o MS identificou o pico apenas como α-terpineol, mas com o IR foi possível

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