na área de produtos naturais e metabolômica envolvendo estudos de caso.
Na área de produtos naturais, a aplicação de métodos in silico como ferramenta para a elucidação estrutural de substâncias tem crescido bastante e os métodos empregados tem evoluído. Há alguns anos, passou a ser comum realizar modelagem molecular por meio do cálculo de campos de força e estudos conformacionais com algumas estruturas. Os resultados desses estudos de dinâmica e mecânica molecular eram aliados a dados experimentais de RMN, como por exemplo NOE e constantes de acoplamento, no sentido de auxiliar na determinação da estereoquímica relativa e estabelecer a conformação de algumas estruturas (SPRING et al., 2001). Relativamente simples, essa prática tem sido realizada até os dias de hoje e trazido bons resultados, sendo que para tal existem vários programas e pacotes disponíveis, como o próprio Hyperchem (seção Programas, Geradores e Sistemas Especialistas). Existem, atualmente, trabalhos similares de mecânica quântica envolvendo cálculos teóricos de deslocamentos químicos e constantes de acoplamento (CONTRERAS et al., 2009), enquanto que na EM ela tem auxiliado no estudo dos processos químicos envolvidos em fragmentações (VESSECCHI et al., 2008).
Recentemente, o interesse dos químicos de produtos naturais por bancos de dados espectrais e programas para realizar predições e simulações de espectros tem aumentado, estimulando a academia e as companhias do setor a suprirem tais necessidades. Atualmente, a oferta de ferramentas para auxílio à elucidação estrutural por meio de métodos in silico tem sido considerável e tanto a comunidade científica como o setor empresarial que realizam rotinas de elucidação de estruturas passaram a aceitá-las com mais naturalidade. O grande gargalo ainda continua sendo a carência de bons geradores de estruturas, os quais, a partir de dados espectrais, fornecem propostas convincentes de estruturas ou subestruturas, ou mesmo sistemas CASE generalistas, funcionais e totalmente automáticos. Embora várias publicações acadêmicas a respeito deste tema tenham surgido, os produtos ainda não podem ser publicamente testados e tampouco comercializados (STEINBECK, 2004; ELYASHBERG et al., 2010). Deve ser lembrado que um químico de produtos naturais não está encarregado de desenvolver algoritmos ou aplicativos para elucidação estrutural, mas sim gerar e fornecer dados e suporte para que essas ferramentas possam ser cada vez mais aprimoradas.
Na área de metabolômica de plantas a situação é diferente, pois as ferramentas realmente necessárias são as mais difíceis de serem desenvolvidas, havendo muito poucas disponíveis. O grande desafio nos estudos de metabolômica é trabalhar com matrizes biológicas contendo misturas complexas de metabólitos. Logo, as ferramentas in silico para auxílio à desreplicação e elucidação estrutural nestes estudos devem considerar esse fato.
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A análise metabolômica propriamente dita ainda é inviável, pois seu objetivo é detectar e quantificar todos os metabólitos em um organismo. Segundo alguns autores (VERPOORTE et al., 2005), os estudos de metabolômica podem ser classificados basicamente em três grupos: aqueles que utilizam métodos cromatográficos (CLAE e CG), os que são baseados em peso molecular (EM) e os que se valem de características físicas (RMN), cada qual com suas vantagens e limitações. Os objetivos desses estudos podem ser variados, por exemplo com foco na identificação de uma determinada classe de substâncias em um organismo (metabolic profilig), ou análise da impressão digital de metabólitos em um organismo sem se preocupar com sua identificação (metabolic fingerprinting). A combinação de diferentes métodos, como as técnicas hifenadas CLAE-EM e CG-EM, também é bastante empregada, ao passo que a CLAE-RMN ainda é pouco usada (VERPOORTE et al., 2005; VAN DER KOOY, 2009). Tais características dos estudos de metaboloma fazem com que o desenvolvimento de métodos in silico para elucidação estrutural seja realmente um grande desafio.
Nesse contexto, com relação a EM, atualmente tem-se tentado associar ferramentas de predição de fragmentações de estruturas a bancos de dados, mas como foi descrito na seção denominada Espectrometria de Massas, ainda há pouco material confiável disponível, sendo que ao usuário restam praticamente os bancos de dados, os quais são bastante utilizados em metabolômica.
No caso de RMN, conforme discutido na seção Ressonância Magnética Nuclear, tem havido interesse em desenvolver ferramentas capazes de realizar a subtração de espectros simulados daqueles obtidos experimentalmente de misturas, o que é muito importante em estudos de metaboloma. Por exemplo, substâncias comuns como ácidos orgânicos do ciclo de Krebs, aminoácidos e carboidratos já são facilmente identificados em matrizes biológicas com base em seus deslocamentos químicos. Uma outra abordagem interessante seria, a partir dos sinais de RMN de uma mistura, gerar estruturas compatíveis e obter seus respectivos espectros simulados para em seguida subtraí-los sucessivamente do espectro da mistura. Entretanto, ferramentas com essa finalidade ainda não estão disponíveis. Os maiores problemas quando se utiliza RMN-
1H para a identificação de substâncias são a sobreposição de sinais e os seus multipletos, o que congestiona
demais os espectros. Nesses casos, inicialmente os dados espectrais são extraídos e analisados por métodos quimiométricos ou de estatística multivariada, tais como Análise dos Componentes Principais (PCA) ou regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS), com intuito de reconhecer padrões e encontrar sinais discriminantes para alguns marcadores e, portanto, poder comparar grupos de amostras com base em seus constituintes. Embora os sinais de RMN-13C sejam cruciais para a determinação estrutural, fornecendo o esqueleto básico
das estruturas, o problema passa a ser baixa sensibilidade e os longos tempos de relaxação. Assim, no caso de RMN em metabolômica, o uso de experimentos bidimensionais como COSY, TOCSY, J-RES, HSQC e HMBC são bastante importantes (VAN DER KOOY, 2009). Entretanto, mesmo com todo esse aparato, ainda há limitações. Em suma, atualmente o que mais há em oferta para estudos de metaboloma são as ferramentas in silico que dão suporte à desreplicação e análise de dados, tais como bancos de dados e softwares para manipular dados, realizar o processo de desconvolução e análises estatísticas, quimiométricas ou outras técnicas de modelagem. Uma área que necessita evoluir mais e que pode ser uma grande aliada dos métodos de desreplicação é a predição de tempos de retenção cromatográficos para CLAE e CG, realizada por meio de estudos de QSRR (Quantitative Structure-Retention Relationship). Utilizando descritores estruturais diversificados e métodos de predição com base em IA (ver item intitulado Metodologias, Técnicas Computacionais e Algoritmos e Figura 4), a QSRR tem funcionado bem para a geração de modelos de predição de tempos de retenção de estruturas análogas e congenéricas, porém ainda tem deixado a desejar no caso de predição para estruturas diversas. Modelos de QSRR são importantes e podem auxiliar na desreplicação, por exemplo, ao gerar tempos de retenção de estruturas oriundas de bancos de dados virtuais ou das que são propostas a partir de dados experimentais de EM ou RMN. Assim, os tempos de retenção experimentais provenientes de CLAE-EM e os calculados por QSRR podem ser comparados e as estruturas cujos tempos estiverem muito fora de uma janela preestabelecida podem ser descartadas. Um outro aspecto