Fórmulas contendo apenas o elemento de interesse

Os estudos nesta parte envolvem íons moleculares hipotéticos de fórmula geral Ap, isto é, contendo

apenas o elemento de interesse A. Por sua vez, o elemento A modelado possui apenas dois isótopos separados por uma unidade de massa: m_{A e}m+1_{A. Do ponto de vista do padrão isotopomérico, esta}

classe de íons moleculares engloba, não apenas aqueles contendo somente o elemento de interesse, mas também aqueles que possuem outros elementos mono-isotópicos além do de interesse.

O único parâmetro ajustado pelo método Z em todas as regressões realizadas nestes estudos foi a abundância do isótopo mais leve (m_{A) do elemento A. A abundância do isótopo} m+1_{A é dada pela}

condição de normalização do padrão isotópico. Entretanto, para a geração dos gráficos, foi utilizada a razão entre as abundâncias dos isótopos m_{A e}m+1_{A, isto é, a razão isotópica do elemento A, pois}

esta grandeza é a mais comumente determinada em análises isotópicas.

Ruído As figuras 3.1, 3.2 e 3.3 contêm o desvio padrão relativo da razão isotópica ajustada do

elemento A em função da abundância verdadeira do isótopom_{A para moléculas de fórmula A}

p com

p igual a 1, 2, 4 e 8. Cada ponto dos gráficos foi calculado através da equação 3.2 utilizando séries de Monte Carlo de 1000 pontos cada.

Nas figuras 3.1 e 3.2, o ruído simulado foi amostrado de uma distribuição normal de probabilidades. A diferença entre elas é que, enquanto na figura 3.1 (dados homoscedásticos) o ruído de todos os pi- cos foi amostrado de uma mesma distribuição com desvio padrão igual a 0,001, na figura 3.2 o ruído de cada pico foi amostrado de uma distribuição diferente, com desvio padrão igual a 0,1% da inten- sidade do pico. Em ambos os casos, para todos os números de fórmula e abundâncias verdadeiras, os espectros verdadeiros (aqueles aos quais foi adicionado o ruído para as simulações de Monte Carlo) foram normalizados de modo que os seus picos base tivessem itensidades iguais a 1.

Quando os dados são homoscedásticos (figura 3.1), observa-se que as medidas de razões isotópicas são tanto menos precisas, quanto próxima dos extremos (1 e 0) é a abundância verdadeira do isótopo

pode ser entendido facilmente. Neste caso, a razão isotópica é simplesmente a razão entre as intensi- dades registradas nos canais correspondentes aos isótoposm_{A e}m+1_{A, aqui chamados de I}

m e Im+1

respectivamente. Considerando-se que os ruídos de ambas essas intensidades são amostrados de uma distribuição normal de média zero e desvio padrão σ, pode-se calcular analiticamente uma estimativa para o desvio padrão da razão isotópica:

σr = σ   ∂r ∂Im !2 + ∂r ∂Im+1 !2  1/2 = σ " 1 I2 m+1 + I 2 m I4 m+1 #1/2

Portanto, o desvio padrão relativo da razão isotópica é: σ_rrel = σr r = σ 1 I2 m + 1 I2 m+1 !

Ou seja, para dados homoscedásticos, o desvio padrão relativo da razão isotópica vai a infinito à medida que o elemento torna-se mono-isotópico, sendo mínimo quando seu padrão isotópico é 1:1. O mesmo comportamento é observado na figura 3.1 para números de fórmula maiores que 1, entretanto, observa-se que as razões obtidas são sistematicamente tanto mais precisas, quanto maior for o número de instâncias do elemento de interesse no íon molecular analisado. Isto, apesar do fator de qn

n0

multiplicado aos desvios padrões estimados para simular um tempo finito de aquisição4_.

No caso dos dados heteroscedásticos (figura 3.2), para íons elementares (p = 1), observa-se que o desvio padrão relativo da razão isotópica calculada é independente da abundância verdadeira do isótopo m_{A (abscissas do gráfico). Aplicando raciocínio semelhante ao usado na interpretação do}

comportamento dos dados homoscedásticos, conclui-se que o desvio padrão relativo da razão isotó- pica ajustada deve ser igual a√2σrel_{, onde σ}rel_{é o desvio padrão relativo das intensidades. Já quando}

p > 1, observam-se desvios padrões relativos maiores que os obtidos com p = 1 nas extremidades, porém menores no centro. Observando cuidadosamente os valores para os quais os desvios padrões relativos obtidos com p > 1 tendem nos dois extremos do gráfico, percebe-se que eles são aproxima- damente iguais ao obtido com p = 1 multiplicados por q(p + 1) /2, isto é, o fator deqn/n0 usado

para considerar o tempo finito de medida. Por outro lado, na região central do gráfico observa-se um ganho de precisão quando íons poli-atômicos são usados, apesar do mesmo fator ainda estar sendo multiplicado.

Na figura 3.3, foram plotados também desvios padrões relativos por mil da razão isotópica ajustada, calculados através da equação 3.2 sobre séries de Monte Carlo de 1000 pontos. Entretanto, a intensi- dade de cada pico simulado é amostrada de uma distribuição de Poisson cuja média é igual a 106_vezes

a intensidade nominal do mesmo5_{. Neste caso, observa-se um comportamento parecido com o obtido}

no caso dos dados normais homoscedásticos. De fato, seria de se esperar que os resultados obtidos com dados com estatística de Poisson fossem intermediários aos normais homo e heteroscedásticos. A conclusão que os estudos acima sugerem é que as análises isotópicas através de íons moleculares contendo múltiplas instâncias do elemento de interesse não podem ser consideradas desvantajosas em relação às tradicionais a priori. Na verdade, em muitos casos, ao contrário do que o senso comum possa sugerir, observa-se um ganho de precisão quando se trabalha com íons mais complexos, apesar de o número de picos que têm de ser monitorados ser tanto maior quanto maior for o número de fórmula do elemento de interesse.

Discriminação instrumental de massas Os efeitos da discriminação instrumental de massas so-

bre os resultados do método Z foram estudados transformando cada pico de cada espectro através da equação 3.3 (página 42). A constante α utilizada neste modelo exponencial de discriminação foi 9,95·10−3_{, o que corresponde a um aumento de sensibilidade do espectrômetro de massas de aproxi-}

madamente 1% por unidade de m/z. O valor m0tomado como referência para todos os espectros foi

a massa do isotopômero mais leve da molécula6_.

Foi obtido um δr (equação 3.1, página 39) igual a −9,901 por mil para todos os números de fórmula e para todas as abundâncias verdadeiras. Para o caso p = 1, pode-se calcular analiticamente o valor de δr esperado isto é feito transformando as intensidades Im e Im+1, correspondentes aos isótoposmA e m+1_{A respectivamente, através da equação 3.3, que descreve o modelo de discriminação instrumental}

de massa: δr = Imeα(m−m0) Im+1eα(m+1−m0) − r0 r0 = r0e −α_{− r} 0 r0 = −9, 901 · 10 −3 _(3.7)

5_{No caso dos sinais amostrados de distribuições normais, a média (intensidade nominal) e o desvio padrão (ruído)}

podem ser determinados independentemente, de modo que, uma vez escolhida a faixa de intensidade do sinal (no nosso caso, ela é dada pela normalização para pico base igual a 1), escolhe-se um desvio padrão adequado para se obter uma certa relação sinal/ruído, que é o que vai afetar a precisão dos resultados. No caso da distribuição de Poisson, a relação sinal/ruído é determinada pelo seu único parâmetro: a média. Desse modo, para que a relação sinal/ruído dos dados simu- lados com estatística de Poisson assumisse um valor comparável aos que são normalmente encontrados em experimentos reais, foram passadas como médias para o gerador de números pseudo-aleatórios as intensidades nominais multiplicadas

por 106_{. Por este motivo, os desvios plotados na fi gura 3.3 são tão diferentes dos plotados nas fi guras 3.1 e 3.2.}

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abundância do isótopo

m

A

1 10 100

σ

r

r /

%

o p = 1 p = 2 p = 4 p = 8

Figura 3.1: Desvio padrão relativo (por mil) da razão isotópica ajustada como função da abundân- cia verdadeira do isótopo m_{A para moléculas de fórmula A}

p, com diferentes valores de p. Dados

homoscedásticos.

Cada ponto foi calculado a partir de 1000 espectros simulados considerando que cada intensidade de pico foi amostrada de uma distribuição normal independente com desvio padrão igual a 0,1% da intensidade do pico-base do espectro.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abundância do isótopo

m

A

1 2 3

σ

r

r /

%

o p = 1 p = 2 p = 4 p = 8

Figura 3.2: Desvio padrão relativo (por mil) da razão isotópica ajustada como função da abundân- cia verdadeira do isótopo m_{A para moléculas de fórmula A}

p, com diferentes valores de p. Dados

heteroscedásticos.

Cada ponto foi calculado a partir de 1000 espectros simulados considerando que cada intensidade de pico foi amostrada de uma distribuição normal independente com desvio padrão igual a 0,1% da intensidade nominal do próprio pico.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abundância do isótopo

m

A

2 4 6 8 10

σ

r

r /

%

o p = 1 p = 2 p = 4 p = 8

Figura 3.3: Desvio padrão relativo (por mil) da razão isotópica ajustada como função da abundância verdadeira do isótopom_{A para moléculas de fórmula A}

p, com diferentes valores de p. Dados com

distribuição de Poisson.

Cada ponto foi calculado a partir de 1000 espectros simulados considerando que cada intensidade de pico foi amostrada de uma distribuição de Poisson de média igual a 1, 0 · 106 _{vezes a intensidade}

O curioso é observar que o efeito da discriminação instrumental de massas sobre a exatidão do resul- tado é independente, tanto da fórmula, quanto do padrão isotópico verdadeiro. Intuitivamente, talvez o contrário fosse esperado: pelo fato de os espectros das moléculas maiores abrangerem faixas de m/z maiores, talvez fosse de se esperar que eles também fossem mais afetados pela discriminação instrumental de massas.

Na verdade, esta observação sugere que, do ponto de vista da discriminação de massas, há vantagens em se trabalhar com íons poli-atômicos. Isto deve-se ao fato de que, se por um lado o efeito da deformação por discriminação de massas sobre os resultados do método Z é independente da fórmula, por outro lado, estudos experimentais mostram que a discriminação de massas tende a diminuir com o aumento da massa dos íons [92].

Não-linearidade de detecção Semelhantemente ao que foi feito no estudo sobre os efeitos da dis-

criminação instrumental de massas sobre os resultados do método Z, para a caracterização do com- portamento dos mesmos em relação à não-linearidade de detecção, os espectros perfeitos simulados foram deformados segundo a equação 3.4 (página 42). Desta vez, entretanto, a alteração sofrida por cada pico não é função da sua massa, mas da sua intensidade. Dentro da normalização de intensidades unitárias para os picos base dos espectros, utilizou-se um tempo morto τ = 0, 03 [tempo]7_.

Observa-se que os desvios da razão obtida em relação à esperada são, em valores absolutos, máximos quando o elemento A é quase mono-isotópico. No caso de p = 1, este comportamento é razoa- velmente intuitivo: como a modificação sofrida por cada pico é função apenas da sua intensidade, quanto mais uniformes as intensidades dos picos do espectro, menor é a deformação global sofrida por ele. Quando os dois picos são iguais (razão esperada igual a 1), ambos são modificados na mesma extensão e, conseqüentemente, não há deformação alguma. Para p = 1, é fácil deduzir a expressão analítica para o desvio da razão isotópica em função da abundância verdadeira, mas isto não trará grandes contribuições.

Entretanto, examinando as curvas para p > 1, observa-se um comportamento que não é tão intuitivo assim: quanto maior o valor de p, mais largo é o patamar onde o desvio é próximo de zero. Ou seja, quanto maior for p, menos sensíveis aos efeitos do tempo morto são as razões isotópicas obtidas. In- tuitivamente, alguém poderia pensar que, como a complexidade do espectro aumenta com p, também

7_{Isto equivale a, por exemplo, um tempo morto de 30 ns quando a intensidade do pico base é 1 MHz. Na verdade, o}

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abundânia do isótopo

m

A

-30 -20 -10 0 10 20 30

δ

r /

%

o p = 1 p = 2 p = 4 p = 8

Figura 3.4: Efeito do tempo morto do detector sobre a razão isotópica ajustada para fórmulas Ap.

Espectros normalizados para intensidade de pico-base igual a 1 e τ =0,03 [unidade de tempo]. aumentaria a deformação global sofrida por ele em virtude da não linearidade e, conseqüentemente, também aumentaria o erro da razão isotópica ajustada. Na prática, observa-se exatamente o contrário.

Má compensação de linha base Na figura 3.5 estão plotados os desvios da razão isotópica ajustada

em função da abundância verdadeira do isótopom_{A e do número de fórmula p. Dentro da normali-}

zação de intensidade de pico base igual a 1, foi somada a cada pico de cada espectro simulado uma constante de valor igual a 0,01, isto é, 1% da intensidade do pico base.

Nos extremos do gráfico, isto é, quando o elemento A é aproximadamente mono-isotópico observa-se, em valor absoluto, um maior efeito do deslocamento de linha base sobre a razão isotópica ajustada. Na região central, os efeitos do erro de atribuição de linha base sobre a razão isotópica são menores. Para o caso p = 1, a explicação é simples: como trata-se de um efeito dependente da intensidade, quanto mais homogêneas forem as intensidades do espectro, menor será a deformação sofrida por ele. Aqui, isto não é tão evidente quanto no caso da não-linearidade de detecção, mas também é observado: os desvios das razões isotópicas ajustadas em relação às esperadas são, em valores absolutos, tanto

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abundânia do isótopo

m

A

-400 -200 0 200 400 600 800 1000

δ

r /

%

o p = 1 p = 2 p = 4 p = 8

Figura 3.5: Efeito do erro de atribuição de linha base sobre a razão isotópica ajustada para fórmulas Ap. Espectros normalizados para intensidade de pico-base igual a 1 e offset de linha base igual a 0,01.

menores quanto maior é o número de fórmula. A conclusão a que se chega é que o aumento do número de fórmula do elemento de interesse aumenta a robustez da determinação de razão isotópica a erros de atribuição de linha base.

Falta de resolução A figura 3.6 contém os desvios relativos da razão isotópica ajustada em relação

aos valores esperados para diferentes abundâncias verdadeiras do isótopo m_{A e diferentes números}

de fórmula p quando os espectros fornecidos como entrada para o método Z são afetados por falta de resolução de m/z. Isto foi simulado dando aos picos espectrais formas de gaussianas centradas nas suas respectivas massas nominais e cujas alturas são iguais às suas respectivas intensidades nominais (equação 3.5, página 43). O desvio padrão usado para as gaussianas é igual a 0,25 e a largura da janela de integração usada na equação 3.6 é δm =0,2. A figura 3.6 mostra também um exemplo de espectro contínuo com esta forma de pico.

O resultado obtido neste caso é semelhante aos obtidos nos casos da não-linearidade de detecção e do erro de compensação de linha base. Novamente, nas situações em que o elemento A é quase

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abundânia do isótopo

m

A

-20 -10 0 10 20 30 40 50

δ

r /

%

o p = 1 p = 2 p = 4 p = 8 5m 5m+1 5m+2 5m+3 5m+4 5m+5 0 0,5 1

Figura 3.6: Efeito da falta de resolução sobre a razão isotópica ajustada para fórmulas Ap.

O gráfico menor mostra o espectro simulado para a fórmula A5 e abundância demA igual a 0,8.

mono-isotópico observa-se um maior efeito da falta de resolução sobre as razões isotópicas obtidas. Na região central do gráfico, onde a abundância relativa do isótopo m_{A é aproximadamente igual a}

0,5, observa-se um menor efeito da não-idealidade sobre a razão isotópica. A explicação para este comportamento no caso p = 1 é igual à dada quando se estava avaliando os efeitos da não-linearidade e da linha base.

Novamente, observa-se um sutil aumento de robustez das razões isotópicas ajustadas perante a falta de resolução com o aumento do número de fórmula, o que sugere que, também tendo em vista esta fonte de erro sistemático, pode ser vantajoso trabalhar com íons moleculares contendo um número maior de instâncias do elemento de interesse.

No documento Deconvolução de padrões isotopoméricos obtidos de espectros de massas de baixa resolução... (páginas 57-67)