Índice de Quadros
1.3.2. Factores de risco associados ao carcinoma de células renais
Estudos epidemiológicos realizados nos últimos anos têm demonstrado que alguns estilos de vida parecem estar envolvidos na etiologia e desenvolvimento de CCR
30. O tabagismo, a obesidade, a doença renal cística adquirida (DRCA) e a história
familiar da doença, encontram-se bem estabelecidos como factores de risco 34. No
entanto, existem outros, como os factores nutricionais, a hipertensão arterial (HTA) e os factores ocupacionais, que parecem também modular o desenvolvimento de CCR, apesar de serem necessários mais estudos para comprovar a sua associação 34.
O tabagismo é considerado um factor de risco para o desenvolvimento de CCR pela International Agency for Research on Cancer (IARC) 37. Este acarreta um aumento
de 1,2 a 2,3 vezes no risco de desenvolvimento desta neoplasia, comparativamente aos não fumadores, aumentando este risco com o aumento do número de cigarros fumados por dia 35. O risco induzido pelo fumo dos cigarros parece diminuir com o tempo de
cessação de fumar, mas apenas em indivíduos que tenham deixado de fumar há dez anos ou mais anos 32. Para além dos efeitos dos carcinogénios contidos no tabaco, o
fumo do cigarro pode aumentar o risco para CCR através da hipóxia crónica tecidual 30.
Estima-se que a obesidade, também considerada um factor de risco para o desenvolvimento de CCR, contribui para mais de 40% dos casos de CCR nos Estados Unidos e para mais de 30% dos casos de CCR registados na Europa, nas duas últimas
1. Introdução
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décadas do século XX 38. A hipoxia crónica dos tecidos, a resistência à insulina, a
resposta inflamatória induzida pela obesidade, a peroxidação de lípidos e o stress oxidativo são alguns dos mecanismos que podem explicar o aumento do risco para CCR em pessoas obesas 38.
A HTA ou os fármacos utilizados no seu tratamento têm sido também associados a um aumento do risco de desenvolvimento de CCR 30,32. No entanto, a contribuição
independente de cada um destes factores é difícil de distinguir, dado que o consumo de diuréticos e de outros anti-hipertensores está frequentemente ligado a indivíduos com história de HTA 30. Apesar da forte relação entre o CCR, a obesidade e a HTA, estas
patologias parecem estar associadas de forma independente ao risco de desenvolvimento desta neoplasia. O risco para CCR é maior em indivíduos simultaneamente obesos e hipertensos do que naqueles que apenas apresentam exposição a um destes factores 32. Também a Diabetes mellitus parece estar associada a
um aumento de risco para CCR, no entanto, o seu efeito é difícil de separar da contribuição que a HTA e a obesidade têm para o desenvolvimento desta neoplasia 32.
Uma dieta equilibrada rica em frutas e vegetais, bem como a prática regular de exercício físico parecem contribuir de forma indirecta para a diminuição do risco de desenvolvimento de várias neoplasias, onde se inclui o CCR, uma vez que contribuem para a diminuição do risco de obesidade e HTA. Por outro lado, o contributo do consumo de álcool, café e chá para o desenvolvimento de cancro renal não é unânime 35.
Algumas doenças renais em fases avançadas, nomeadamente a DRCA, parecem estar associadas a um aumento do risco de desenvolvimento de CCR. Verifica-se que a incidência de CCR parece ser muito mais elevada em pacientes com DRCA do que na população em geral 39.
À semelhança do que acontece com outras neoplasias, o CCR ocorre tanto na forma esporádica como na familiar 40. A história familiar de doença tem sido associada a
um risco acrescido para o desenvolvimento de CCR. Tendencialmente, os doentes com CCR familiar apresentam tumores múltiplos e bilaterais e em idades mais precoces 41.
1. Introdução
12 1.3.3. História natural da doença
O rim é um dos órgãos mais diferenciados do corpo apresentando aproximadamente trinta tipos diferentes de células 7. Esta panóplia de células é
responsável por modular vários processos fisiológicos complexos, cruciais para o funcionamento adequado e para a homeostasia do organismo 7. As funções que os rins
desempenham podem ser sintetizadas em três funções principais: excretora, homeostática e endócrina 42,43.
Durante o século XX, persistiu a noção de que o rim albergaria um número limitado de doenças 44. No entanto, essa corrente de pensamento foi sendo
progressivamente substituída pela ideia de que o rim, de facto, apresentaria um elevado número de patologias distintas com diferentes prognósticos e alterações genéticas particulares 44.
O principal factor de divisão das neoplasias do rim é a idade. Nas crianças, os tumores nefroblásticos são os mais frequentes, onde se destaca o nefroblastoma que abarca cerca de 80% da totalidade das neoplasias no rim até aos dez anos de idade 41.
Por outro lado, nos adultos, predominam as neoplasias com origem nos túbulos renais e são constituídos pelos diferentes tipos histológicos de CCR 41. Os restantes tipos de
tumores, metanefréticos, mesenquimatosos, mistos epiteliais, entre outros, são muito raros 41.
Descrito pela primeira vez em 1826 por Konig 45, o CCR é, por sua vez, um grupo
heterogéneo de tumores 41. A Organização Mundial de Saúde, na classificação de 2004,
reconhece vários subtipos histológicos de CCR: células claras (RCCcc) (75%), papilar tipos I e II (10%), cromófomo (5%), familiar (4%), dos ductos colectores de Bellini, medular, associado à translocação Xp11.2/TFE3, associado ao neuroblastoma, tubular mucinoso e células fusiformes (todos inferiores a 1%) e inclassificáveis (4-6%) 46.
Muitas neoplasias renais permanecem assintomáticas e não palpáveis até ao final do curso natural da doença 47 devido, sobretudo, à localização anatómica dos rins no
retroperitoneu que permite que o crescimento local de um tumor renal passe despercebido até atingir dimensões consideráveis. O exame físico tem um papel limitado no diagnóstico de CCR, mas pode ser valioso em alguns pacientes, sobretudo naqueles em que a doença apresenta sintomatologia 47. A hematúria é o sintoma de apresentação
mais frequente (60% dos casos), seguida da dor lombar (40% dos casos) e da palpação de massa renal (30 a 40% dos casos) 47. A tríade clássica de Guyon (dor no flanco,
hematúria e massa palpável abdominal) não é habitual, sendo apenas encontrada em cerca de 6 a 10% dos doentes, denotando no entanto doença avançada, dado que está presente em 50% dos pacientes com doença metastizada 48. Aproximadamente 30% dos
1. Introdução
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doentes com CCR, durante a evolução da sua doença, desenvolvem uma síndrome paraneoplásica, como resultado da produção de substâncias biologicamente activas pelo tumor ou por tecidos normais em resposta ao tumor 47,48.
O CCR apresenta uma grande variabilidade quanto ao seu comportamento biológico. Todavia, os tumores possuem características que ajudam a prever a agressividade da doença, nomeadamente, a dimensão do tumor inicial e o grau histológico (Grau de Fuhrman). O Grau de Fuhrman é habitualmente usado na classificação dos tumores renais dado que permite relacionar a agressividade da neoplasia com as características histológicas dos tumores, nomeadamente a dimensão do núcleo, irregularidade da membrana nuclear e proeminência dos nucléolos 49. De
acordo com este esquema, nas células tumorais classificadas de G1 e G2 os núcleos são pequenos e uniformes ou com alguma irregularidade, apresentando de baixo grau de malignidade 49. Por sua vez, as células tumorais classificadas de G3 e G4 exibem
contornos claramente irregulares, pleomórficos e bizarros, denotando alto grau de malignidade 49.
A par do diagnóstico histopatológico, o estadiamento clínico estabelecido aquando do diagnóstico constitui um dos passos mais importantes para orientar a terapêutica e inferir acerca do prognóstico da doença 50. O estadiamento clínico consiste
no agrupamento dos casos em categorias, tendo por base a extensão da doença, sendo esta uma descrição detalhada do grau de disseminiação da doença a partir do órgão de origem. O sistema de estadiamento TNM é, actualmente, o mais usado para avaliar a extensão do tumor primário (T), envolvimento dos gânglios linfáticos regionais (N) e presença de metástases à distância (M) 51.
Para indivíduos diagnosticados em estadios iniciais de desenvolvimento de CCR a excisão cirúrgica (nefrectomia) completa ou parcial é a única opção terapêutica curativa
47. Em indivíduos com tumores de estadios mais avançados a cirurgia é efectuada
apenas nos doentes seleccionados, frequentemente acompanhada de outras intervenções terapêuticas, nomeadamente o uso de imunoterapia, com recurso a citocinas 47. Aproximadamente um terço dos doentes apresenta doença metastática no
momento do diagnóstico 52e 25% dos doentes submetidos a cirurgia curativa irão
progredir e desenvolver doença metastática 53. As tradicionais terapêuticas sistémicas
baseadas nas citocinas, com baixa actividade anti-tumoral, deram lugar a novas terapias dirigidas, com melhores taxas de resposta, que têm como alvo vias envolvidas na angiogénese e metabolismo celular do tumor 54. Dentro das terapêuticas dirigidas
destacam-se os inibidores do vascular endothelial growth factor (VEGF) (Bevacizumab), os inibidores dos receptores cínase de resíduos de tirosina (Sunitinib, Sorafenib, Pazopanib) e os inibidores mammalian target of rapamycin (mTOR) (Temsirolimus) 53,55.
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Vários estudos revelaram que o CCR esporádico, sobretudo o CCRcc, apresenta características genéticas semelhantes à Síndrome Von Hippel-Lindau, uma síndrome hereditária que aumenta o risco de desenvolvimento de vários tipos de tumores incluindo o CCR 56. De facto, aproximadamente 50% dos CCRcc esporádicos apresentam
mutações somáticas no gene supressor tumoral VHL e cerca de 10 a 20% apresentam hipermetilação desse mesmo gene 57.
Em condições normais, o produto do gene VHL (pVHL) marca o factor de trascrição hypoxia-inducible factor-α (HIF-α) para ubiquitinação e subsequente degradação proteossomal 28,58. Quando se verificam alterações no gene VHL que
originem um pVHL não funcional ou em condições de hipóxia, não ocorre a ligação do pVHL ao HIH-α, conduzindo à acumulação de proteína HIF-α. A HIF- α activa a transcrição de vários genes envolvidos na angiogénese VEGF, no aporte de glucose (Glucose transporter 1- Glut1) e no crescimento celular (platelet-derived growth factor - PGDF - e Transforming growth factor beta - TGFβ) (Figura 5), cuja expressão aumentada gera um microambiente favorável à proliferação celular e angiogénese 28,58.
Em condições normais, o produto do gene VHL (pVHL), como parte de um complexo ubiquitina-ligase, promove a ubiquitinação (adição de ubiquitina, Ub) e degradação do factor HIF-α através da via do proteossomal. O HIF-α é um activador da transcrição de genes de resposta à hipóxia.
CÉLULA NORMAL Degradação proteossomal CÉLULA TUMORAL Pericito vascular CÉLULA TUMORAL Célula Endotelial Angiogénese Tumoral Proliferação de células tumorais e progressão do RCC CÉLULA TUMORAL
No carcinoma de células claras, a presença de anomalias no gene VHL resultam na perda de função do pVHL e na perda de expressão do gene VHL
Aumento de HIF-α
O VEGF e o PDGF ligam-se e activam os seus receptores, o VEGFR e o PDGFR, presentes na superfície das células. A activação destes receptores desencadeia vias de sinalização intracelular que promovem a proliferação e a angiogénese tumoral. Vias de sinalização intracelular Vias de sinalização intracelular NÚCLEO Aumento da expressão de VEGF e PDGF
A perda de função do pVHL e da expressão do gene VHL comprometem a degradação do HIF-α, originando níveis mais elevados deste factor que, por sua vez, promovem uma maior expressão do VEGF e do PDGF
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O pVHL está igualmente envolvido na regulação de outras moléculas, onde se inclui a p53. Em condições normais, o pVHL forma um complexo multimérico com a p53 e outras moléculas que promovem a estabilização e activação desta 60,61. Na ausência do
pVHL, os níveis da proteína p53 e a transcrição do respectivo gene são reduzidas, ficando comprometida a resposta a danos no DNA, proporcionando a progressão da célula maligna ao longo do ciclo celular sem ser iniciado o processo de apoptose 60,61. A
p53, por sua vez, é responsável por reprimir a actividade de um vasto número de genes implicados em múltiplos mecanismos celulares, onde se inclui a apoptose 62.
A carcinogénese renal é um processo complexo e multifásico determinado por factores genéticos e ambientais 63. A complexidade das doenças oncológicas, suportada
pela multiplicidade de moléculas e vias celulares que podem estar comprometidas na carcinogénese, permite-nos inferir que, no desenvolvimento de CCR poderão estar presentes alterações genéticas em moléculas envolvidas não só nas vias de proliferação celular mas também na apoptose.
1.4. A apoptose
O estudo da apoptose é uma das áreas da investigação em Oncologia que tem apresentado maior crescimento científico 13,64. Actualmente, sabe-se que o
desenvolvimento de mecanismos altamente conservados nas espécies 65, que controlam
o número de células de um organismo foi um marco essencial e determinante na evolução dos seres multicelulares 66. O número de células num organismo é
minuciosamente controlado pelo balanço entre proliferação, diferenciação e morte celular
13,67.
Para a sobrevivência dos organismos é essencial a manutenção da estabilidade genómica que é assegurada através de checkpoints que interrompem a progressão do ciclo celular quando são detectados danos no genoma. Nos organismos multicelulares a apoptose funciona como um checkpoint adicional de forma a eliminar as células com danos irreparáveis do DNA que caso contrário tornar-se-ia perniciosa 68. Assim, quando a
célula é confrontada com alguma perturbação que condicione a sua estrutura e/ou função, esta sofre alterações adaptativas que permitem a sua sobrevivência e a manutenção da sua função. No entanto, quando a perturbação é acentuada ou a adaptação não é efectiva a morte celular programada é desencadeada 69. Este processo
meticulosamente controlado visa, então, a eliminação de células que se encontram lesadas, durante a homeostasia tecidual dos organismos multicelulares, no desenvolvimento embrionário 70 e no funcionamento adequando do sistema imunitário 66.
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Isto ocorre sob condições fisiológicas normais podendo, no entanto, ser desencadeada por diversas patologias 71. Os organismos multicelulares adoptam sobretudo dois
mecanismos de morte celular programada para eliminar células alteradas, a necrose e a apoptose 69,72.
De uma forma sucinta, o processo de apoptose, descrito pela primeira vez por Kerr e colaboradores em 1972 73, consiste num tipo de morte celular limpa,
meticulosamente regulado 74 e dependente de energia 71. Neste processo, a cromatina é
condensada e o DNA fragmentado, sendo posteriormente incluídos em vesículas formando-se os corpos apoptóticos que são rapidamente fagocitados por macrófagos, resultando no desaparecimento da célula sem qualquer fenómeno inflamatório 72.
Nos mamíferos, a apoptose pode ser iniciada através de três vias diferentes: a via da granzima B, a via extrínseca ou dos receptores da morte e a via intrínseca ou mitocondrial. Na via da granzima B verifica-se, em primeiro lugar, a libertação de grânulos citotóxicos por parte de células T citotóxicas e natural killer, quando confrontadas com células transformadas ou infectadas por vírus. Esses grânulos citotóxicos contêm perforina (proteína capaz de criar poros na superfície das células que facilita a entrada de outras moléculas para o interior da célula) e granzima B 75 (protease serinica que cliva
após resíduos de ácido aspártico de forma semelhante às caspases). A granzima B induz a apoptose através da activação da caspase efectora caspase-3 76. No que diz respeito à
via extrínseca, esta é iniciada pela ligação de ligandos de morte (por exemplo o FasL ou o TNFα) aos respectivos receptores de morte (por exemplo o Fas ou o TNFR-1) localizados à superfície das células 75. Estes receptores de morte apresentam um
domínio transmembranar, o death domain (DD) que é essencial para o recrutamento de moléculas a jusante 71. Após a ligação do ligando ao respectivo receptor, verifica-se a
oligomerização do receptor e recrutamento de proteínas adaptadoras e de procaspase-8, formando um complexo death-inducing signaling complex (DISC). A autoclivagem da procaspase-8 no DISC é seguida pela activação de caspases efectoras que continuarão o processo de apoptose 77. A via intrínseca da apoptose é, por sua vez, mediada pela
mitocôndria. Vários estímulos pró-apoptóticos, nomeadamente choque térmico, danos no DNA, stress citotóxico e oxidativo podem proporcionar, directa ou indirectamente, alterações na permeabilidade da membrana externa da mitocôndria 71,76. Esta perda de
integridade da membrana leva à libertação para o citosol de vários factores pró- apoptóticos, onde se incluem a Second mitochondrial activator of caspases (Smac) e o citocromo c 78. No citosol, o citocromo c liga-se à Apoptotic protease-activating factor 1
(Apaf1) onde se liga posteriormente ATP ou dATP, originando um complexo oligomérico denominado apoptossoma 79. A formação do apoptossoma marca, então, a activação da
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posteriormente as caspases efectoras procaspases-3 e -7 que, por sua vez, clivam muitos substratos intracelulares importantes, levando a alterações morfológicas, características da apoptose (condensação da cromatina, fragmentação do DNA nucleosomal, quebra do invólucro nuclear, externalização da fosfatidilserina e formação de corpos apoptóticos) 80.
A apoptose é um mecanismo altamente regulado, onde cada etapa da cascata é monitorizada e controlada por um sinal anti-apoptótico 77. As proteínas inibidoras da
apoptose (Inhibitors of Apoptosis Proteins - IAP) são algumas das moléculas com função anti-apoptótica responsáveis pela regulação do processo apoptótico. A survivina é uma proteína que pertence a esta família que, através da inactivação da caspase-9, regula a via intrínseca da apoptose. Contudo, apesar de ser consensual o seu papel na inibição da apoptose, o mecanismo pelo qual essa inibição é feita é ainda bastante controverso 81.
Postula-se que o pool de survivina localizado na mitocôndria, enriquecido de forma dinâmica em resposta ao stress celular, seja libertado no citosol após estímulos apoptóticos 82, associando-se à X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) através do seu
domínio Baculovirus IAP Repeat (BIR) (semelhante ao domínio BIR3 da XIAP), aumentado a estabilidade desta última IAP 83. Dados estruturais e bioquímicos revelam
que durante o processamento da procaspase-9, é gerado um neo-epitopo N-terminal na pequena subunidade, ao qual se liga o domínio BIR3 da XIAP. Forma-se um complexo entre estas duas moléculas que impede, deste modo, a oligomerizar da procaspase-9 com a Apaf1 no apoptossoma 84. A survivina pode ainda, durante a Interfase, associar-se
à hepatitis B X-interacting protein (HBXIP), uma proteína que inibe a actividade da proteína X do vírus Hepatite B, formando um complexo. O complexo survivina - HBXIP liga-se à procaspase-9, impedindo-a de ser recrutada para oligomerizar com a Apaf1, suprimindo a activação desta caspase 85. A actividade anti-apoptótica da survivina é, por
sua vez, modelada por proteínas pró-apoptóticas, em particular a Smac, que impede a sua complexação com os seus co-factores 86.
1. Introdução
18 Survivina Survivina Survivina Porcaspase-9 XIAP HBXIP Survivina Smac Caspase-9 Apoptose Quimioterapia Danos no DNA Sinais pró- apoptóticos Agentes pró-apoptóticos apoptoseVias da Membrana celular
Mitocôndria
Figura 6. Inibição da caspase-9 através da survivina e seus co-factores (adaptado de Mita et al., 2008 87).
Uma das principais alterações adquiridas pelas células neoplásicas é a capacidade de resistir à apoptose 8. Nas células tumorais, o balanço do crescimento
celular, determinado através do ratio entre a taxa de proliferação celular e a apoptose, encontra-se descontrolado 88. Verifica-se, igualmente, uma remoção ineficiente de células
alteradas que resulta num aumento da probabilidade de preservação e propagação de mutações e outras alterações genéticas que podem levar a instabilidade genómica em grande escala 88. A resistência à morte celular pelas células tumorais não é completa,
mas reforça-lhes a capacidade de sobrevivência num microambiente tumoral, muitas vezes hipóxico e com reduzida disponibilidade de nutrientes 13.
1.5. A survivina
A survivina é uma proteína intracelular de 16.5-kDa formada por 142 aminoácidos
89 que pertence à família das IAP´s 90. Quando comparada com os restantes elementos
desta família, a survivina é estruturalmente única 91 dado que é a IAP mais pequena,
contendo apenas um domínio BIR e uma longa hélice α na região C-terminal 91.
A survivina é codificada pelo gene BIRC5 localizado na região telomérica do cromossoma 17q25 (Figura 7) 92. O gene BIRC5 apresenta quatro exões principais (1, 2,
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Figura 7. Localização do gene BIRC5 no cromossoma 17 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
O gene BIRC5 apresenta um promotor TATA-less rico em GC 93 que possui duas
sequências específicas, a Cell Cycle-Dependent Element (CDE) e a Cell Cycle Gene Homology Region (CHR) 94. Através da ligação de proteínas aos elementos CDE/CHR, os
promotores dos genes com estas sequências sofrem repressão nas fases G0 e G1, que começa a ser diminuída a partir da fase S, deixando praticamente de existir na fase G2 e Mitose 95,96. O gene BIRC5 é, portanto, um gene “mitótico” dado o controlo meticuloso da
sua expressão que origina diferentes níveis de expressão de survivina de acordo com a fase do ciclo celular 94.
Nos últimos anos, diversos estudos deram ênfase ao carácter multifuncional da survivina 97. Esta está envolvida em vários mecanismos celulares 98, sendo a única IAP
envolvida simultaneamente na regulação do ciclo celular e na apoptose 99.
Durante a mitose, a survivina associa-se à Aurora cinase B, à Inner Centromere Protein (INCENP) e à Borealina que, em conjunto, formam o Chromosomal Passenger Complex (CPC) 100,101, responsável pela regulação da condensação dos cromossomas,
formação do fuso acromático e interação cinetócoro e microtúbulo 102. A survivina dirige o
movimento deste complexo para diferentes localizações e participa na organização do fuso acromático durante a polimerização dos microtúbulos 101. Paralelamente à formação
do fuso acromático, a survivina actua como sensor do ancoramento dos cinetocoros aos microtúbulos, um componente do checkpoint de ligação dos cinetocoros que é activado na ausência de tensão nos microtúbulos 98.