INÊS DOS SANTOS MARQUES
POLIMORFISMOS FUNCIONAIS EM GENES MODULADORES DA
APOPTOSE NO CARCINOMA DE CÉLULAS RENAIS:
INFLUÊNCIA NA SUSCEPTIBILIDADE, AGRESSIVIDADE E DESENVOLVIMENTO DE DOENÇA METASTÁTICA
Dissertação de Candidatura ao grau de
Mestre em Oncologia submetida ao Instituto
de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da
Universidade do Porto.
Orientador – Professor Doutor Rui Manuel de
Medeiros Melo Silva.
Categoria – Professor Associado com
Agregação
Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas
de Abel Salazar da Universidade do Porto de
Abel Salazar.
TÍTULO:
Polimorfismos funcionais em genes moduladores da apoptose no carcinoma de células renais: influência na susceptibilidade, agressividade e desenvolvimento de doença metastática
Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre em Oncologia submetida ao Instituto de Ciência Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto
AUTOR:
Inês dos Santos Marques
DATA: Setembro, 2011
EDITOR: Inês dos Santos Marques MORADA: Estrada Nacional109, n.º38 LOCALIDADE: Marinha da Guia CÓDIGO POSTAL: 3105-068 Carriço
CORREIO ELECTRÓNICO: ines.santosmarques@gmail.com TELEMÓVEL: +351 968 064 274
VII
Agradecimentos
Chegando ao fim desta etapa do meu percurso académico, não posso deixar de agradecer a todo um conjunto de pessoas que, directa ou indirectamente, contribuíram para o êxito deste projecto.
Gostaria de agradecer à Comissão de Coordenação do Mestrado em Oncologia, sob a pessoa do Professor Doutor Carlos Lopes, pela oportunidade de ingressar neste mestrado, que me permitiu aumentar os meus conhecimentos em Oncologia essenciais para o meu crescimento científico.
À Liga Portuguesa Contra o Cancro – Núcleo Regional do Norte, pelo apoio concedido para divulgação científica do presente trabalho.
Ao Professor Doutor Rui Medeiros, meu orientador, por me ter recebido e acolhido no Grupo de Oncologia Molecular e por me acompanhar nestes meus primeiros passos na área da Investigação. Agradeço a compreensão, a força e as palavras sábias em momentos determinantes deste percurso.
À Dra. Marta Ferreira, pelo apoio na parte clínica deste trabalho.
Ao Rui Lobo, pelo apoio na parte gráfica deste trabalho.
A todos os elementos do Grupo de Oncologia Molecular que tornaram estes dois anos de trabalho mais alegres e motivadores e que me fizerem sentir integrada numa verdadeira família. Em especial à Dra. Ana Luísa Teixeira, pela partilha diária de conhecimento, pelo apoio constante e fundamental na elaboração deste projecto e, sobretudo, pela paciência e amizade. Agradeço também à Dra. Joana Assis, pela amizade e cumplicidade que construímos desde o primeiro dia em que chegámos ao grupo de Oncologia Molecular e por me apoiar incessantemente em todas as minhas pequenas grandes batalhas. À Dra. Mónica Gomes, ao Dr. Augusto Nogueira e à Dra. Andreia Azevedo que, à conta da minha ingenuidade, me fizeram rir todos os dias!
VIII
Aos meus pais, pelo apoio incondicional em todas as minhas decisões e por estimularem, desde que me lembro, a minha vontade de querer saber mais e mais. Obrigado por partilharem comigo, sempre com muito orgulho, todas as minhas conquistas. Este trabalho é uma pequena retribuição a todos estes anos de dedicação…
Aos meus irmãos, Catarina e Tomé, por tornarem a minha “síndrome do filho do meio” mais doce e alegre.
À Joaninha e ao Diogo, que apesar de tudo, já fazem parte da família.
Às três famílias Costa, pela alegria e positivismo contagiante que me transmitem. Vocês são a prova viva de que não são necessários laços de sangue para se construir uma verdadeira família…
À Professora Guida Monteiro, por ser a mentora deste contínuo processo de aprendizagem. Devo-lhe cada letra, cada palavra, cada frase...
À Ki, que esteve incondicionalmente presente nas derrotas e nas vitórias destas minhas longas caminhadas. À Ritinha, à Nina e à Andreia que, apesar dos quilómetros que nos separam, continuam sempre presentes.
Ao meu primo Pedro e ao meu padrinho Avelino, vítimas desta doença, que são o motivo pelo qual faz sentido continuar a fazer Investigação.
Abreviaturas
XI
A
A Adenina
AVC Acidente vascular cerebral
Apaf1 Apoptotic protease-activating factor 1 ATP Adenosina trifosfato
B
BIR Baculovirus IAP repeat
BIRC5 baculoviral IAP repeat containing 5
C
C Citosina
0C Graus Celsius
CCR Carcinoma de células renais CCRcc Carcinoma renal de células claras CARD Caspase recruitment domain
CASP9 Caspase-9
CDE Cell cycle-dependent element CHR Cell cycle gene homology region CPC Chromosomal Passenger Complex
D
DD Death domain
DISC Death-inducing signaling complex DRCA Doença renal cística adquirida DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP Desoxirribonucleosídeo trifosfato
E
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ELISA Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
Abreviaturas
XII
G
G Guanina
Glut1 Glucose transporter 1
H
HIF hypoxia-inducible factor
HTA Hipertensão arterial
HXIB Hepatitis B X-interacting protein
I
IAP Inhibitors of Apoptosis Proteins
IARC International Agency for Research on Cancer IC Intervalo de confiança
IGF-1 Factor de crescimento insulin like-1
K
kDa KiloDalton
M
M Concentração molar
mg/mL Miligrama por mililitro
mL Mililitro
mM Concentração milimolar
mTOR Mammalian target of rapamycin
N
ng Nanograma
ng/mL Nanograma por mililitro
O
Abreviaturas
XIII
P
P Probabilidade
Pb Pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction PGDF Platelet-derived growth factor
pVHL Produto do gene VHL
p/v Peso por volume
R
Real Time PCR Real-Time Polymerase Chain Reaction RLFP Restriction Fragment Length Polymorphism
RPM Rotações por minuto
rSNP SNP regulador
S
SD Standard Deviation
Smac Second mitochondrial activatior of caspases SNP Single Nucleotide Polymorphism
T
T Timina
TBE Tris-borate EDTA buffer
TGFβ Transforming growth factor beta
U
U Unidade
µg/µL Micrograma por microlitro
µL Microlitro
µM Micromolar
V
VEGF Vascular endothelial growth factor
Abreviaturas
XIV
X
X2 Qui-Quadrado
Índice Geral
XV
Resumo XXI
Abstract XXV
1. Introdução 1
1.1. Cancro: considerações gerais 3
1.2. Biologia molecular do cancro 4
1.2.1. Carcinogénese 4
1.2.2. Variabilidade genética individual 6
1.3. Carcinoma de células renais 9
1.3.1. Epidemiologia 9
1.3.2. Factores de risco associados ao carcinoma de células renais 10
1.3.3. História natural da doença 12
1.4. A apoptose 15
1.5. A survivina 18
1.6. A caspase-9 20
1.7. Polimorfismos funcionais nos genes BIRC5 e CASP9 22
2. Objectivos 25 2.1. Objectivo geral 27 2.2. Objectivos específicos 27 3. Material e métodos 29 3.1. População 31 3.2. Procedimentos laboratoriais 32
3.2.1. Extracção do DNA genómico 32
3.2.2. Genotipagem do polimorfismo BIRC5-31G/C 32 3.2.3. Genotipagem do polimorfismo CASP9+83C/T 34
Índice Geral
XVI
4. Resultados 37
4.1. Associação dos polimorfismos BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T na
susceptibilidade de carcinoma de células renais 39 4.2. Análise multivariada da influência soa polimorfismos BIRC5-31G/C
e CASP9+83C/T na susceptibilidade de carcinoma de células
renais 41
4.3. Associação dos polimorfismos BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T com características clínico-patológicas dos doentes com carcinoma de
células renais 42
4.4. Influência dos polimorfismos BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T no
desenvolvimento de doença metastática 44
4.5. Distribuição das frequências genotípicas dos polimorfismos
BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T em populações controlo 46
5. Discussão 49
5.1. Distribuição das frequências genotípicas dos polimorfismos
BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T em populações controlo 53 5.2. Associação dos polimorfismos funcionais BIRC5-31G/C e
CASP9+83C/T na susceptibilidade e agressividade de carcinoma
de células renais e no desenvolvimento de doença metastática 56
6. Conclusões e perspectivas futuras 61
7. Referências bibliográficas 65
Índice de Figuras
XVII
Figura 1. Representação esquemática do processo de carcinogénese. 4
Figura 2. Representação esquemática das alterações adquiridas pelas
células neoplásicas. 6
Figura 3. Localizações de SNP’s e respectivo efeito biológico. 8 Figura 4. Taxas de incidência padronizadas de cancro renal por 100.000
habitantes, em ambos os géneros. 10
Figura 5. Papel do pVHL no desenvolvimento de CCRcc. 14
Figura 6. Inibição da caspase-9 através da survivina e seus co-factores. 18
Figura 7. Localização do gene BIRC5 no cromossoma 17. 19
Figura 8. Localização do gene CASP9 no cromossoma 1. 21
Figura 9. Gel de agarose a 1,5 % (p/v), mostrando banda de 151 pb que
corresponde à região do gene BIRC5 amplificada por PCR. 33 Figura 10. Gel de agarose a 2 % (p/v), após PCR- RFLP, observando-se
os três genótipos possíveis do polimorfismo BIRC5-31G/C. 34 Figura 11. Representação de um Real-Time PCR para o polimorfismo
CASP9+83C/T. 35
Figura 12. Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e teste Log Rank, evidenciando associação entre incidência cumulativa de doença metastática e o polimorfismo BIRC5-31G/C.
44
Figura 13. Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e teste Log Rank, evidenciando associação entre incidência cumulativa de doença metastática e o polimorfismo CASP9+83C/T.
45
Figura 14. Estudo comparativo das frequências genotípicas do
polimorfismo BIRC5-31G/C em populações controlo mundiais. 46 Figura 15. Estudo comparativo das frequências genotípicas do
Índice de Figuras
XVIII
Figura 16. Estudo comparativo das frequências genotípicas do
Índice de Quadros
XIX
Quadro I. Características clínicas e patológicas do grupo de casos e
características gerais do grupo controlo. 31
Quadro II. Frequências genotípicas do polimorfismo BIRC5-31G/C no grupo
controlo e no grupo de casos. 39
Quadro III. Frequências genotípicas do polimorfismo CASP9+83C/T no grupo
controlo e no grupo de casos. 40
Quadro IV. Análise multivariada da influência dos polimorfismos
BIRC5-31G/C e CASP9-83C/T, ajustada para as variáveis idade e género. 41
Quadro V. OR relativos ao risco para os portadores do genótipo CC, do polimorfismo BIRC5-31G/C, apresentarem ao diagnóstico doença mais agressiva.
42
Quadro VI. OR relativos ao risco para os portadores dos genótipos CT/TT, do polimorfismo CASP9+83C/T, apresentarem ao diagnóstico doença mais agressiva.
Resumo
XXIII
O carcinoma de células renais (CCR) representa uma das neoplasias urológicas mais importantes em consequência da sua elevada letalidade e crescente incidência nos países mais desenvolvidos. O aumento das taxas de incidência desta neoplasia deve-se ao aumento da prevalência dos factores de risco para este tipo de tumores e ao uso recorrente de técnicas imagiológicas mais avançadas que permitem a identificação de um maior número de tumores de forma acidental.
Entre as etapas necessárias ao crescimento e sobrevivência das células tumorais estão a amplificação de sinais de crescimento e a interrupção de sinais que promovem a apoptose. A apoptose é um mecanismo altamente regulado que visa a eliminação de células lesadas, durante a homeostasia tecidual. Uma das principais etapas da via intrínseca da apoptose é a activação da caspase-9, que activa posteriormente as caspases efectoras, responsáveis pelo desmantelamento celular. A survivina é uma proteína com função anti-apoptótica que está envolvida na inactivação da caspase-9 participando, deste modo, na regulação da via intrínseca da apoptose.
Nos últimos anos tem vindo a tornar-se clara a importância do estudo de genes envolvidos na apoptose. Uma vez que a survivina e a caspase-9 condicionam o processo de apoptose, por proporcionarem potencialmente diferentes intensidade e funcionalidade do processo, é necessário compreender de que forma variantes genéticas funcionais nos genes que codificam estas proteínas condicionam a susceptibilidade para CCR e o desenvolvimento de tumores agressivos.
No presente trabalho foi realizado um estudo do tipo caso-controlo, com o intuito de analisar a influência dos polimorfismos funcionais BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T no desenvolvimento de CCR e a sua influência para o desenvolvimento de doença metastática.
Foram analisadas amostras de DNA de quatrocentos e oitenta e três (483) indivíduos, dos quais cento e setenta e oito (178) apresentavam diagnóstico histopatológico de CCR e trezentos e cinco (305) indivíduos sem doença oncológica. A análise dos polimorfismos funcionais BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T foi efectuada por PCR-RFLP e Real-Time PCR, respectivamente.
Relativamente ao polimorfismo BIRC5-31G/C, os indivíduos portadores do genótipo CC, com idade igual ou inferior a 62 anos, apresentam uma tendência para um risco aumentado de desenvolvimento de CCR (OR = 1,74; P = 0,094) comparativamente com os indivíduos portadores dos genótipos GG/GC. A análise multivariada, ajustada à idade e ao género, mostra que o genótipo CC é um factor de risco independente para o desenvolvimento de CCR (OR = 2,10; P = 0,023). No que diz respeito ao polimorfismo
Resumo
XXIV
CASP9+83C/T, não foram observadas associações estatisticamente significativas entre este e a susceptibilidade para CCR.
Verificamos também que os indivíduos portadores do genótipo CC quanto ao polimorfismo BIRC5-31G/C apresentam risco aumentado, para no momento do diagnóstico, apresentarem doença metastática (OR = 7,69; P = 0,004). Relativamente ao polimorfismo CASP9+83C/T não se encontrou associação estatisticamente significativa entre este e a presença de doença de fenótipo agressivo, no momento do diagnóstico.
A análise de Kaplan-Meier permitiu verificar que nos doentes com CCR, os portadores do genótipo CC, relativamente ao polimorfismo estudado no gene BIRC5, apresentavam um intervalo de tempo entre o início da exposição ao factor de risco (BIRC5-31G/C) e o desenvolvimento de doença metastática menor (P = 0,018), comparativamente aos indivíduos portadores dos genótipos GG/GC. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as curvas do intervalo de entre o início da exposição ao factor de risco e o desenvolvimento de doença metastática dos homozigóticos CC versus portadores do alelo T, relativamente ao polimorfismo CASP9+83C/T.
A avaliação do perfil genético individual relativamente aos polimorfismos funcionais BIRC5-31G/C e CASP9+83C/T poderá contribuir para a compreensão de eventuais mecanismos de regulação e desenvolvimento tumoral de CCR e o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de metastização. O estabelecimento do perfil genético individual poderá ser uma estratégia promissora na definição de grupos de risco para o desenvolvimento de CCR, na selecção e direccionamento dos doentes para uma terapêutica mais efectiva e dirigida, atendendo às potenciais vias celulares que se encontram alteradas.
Abstract
XXVII
Renal cell carcinoma (RCC) represents one of the most important urologic tumor as a result of its high lethality and increasing incidence in more developed countries. The increased incidence rates of RCC is due to the increased prevalence of risk factors of this tumor and the recurrent use of advanced imaging techniques that identifies a greater number of tumors accidentally.
Among necessary steps for growth and survival of tumor cells is the amplification of growth signals and interruption of signals that promote apoptosis. Apoptosis is a highly organized mechanism of cell death used to eliminate injured cells from the body, during tissue homeostasis. One of the main steps of intrinsic pathway of apoptosis is activation of caspase-9, which subsequently activates effector caspases, responsible for cellular dismantling. Survivin is a protein with anti-apoptotic function involved in caspase-9 inactivation, participating in regulation of intrinsic pathway of apoptosis.
Last years, it was become clear the importance of the study of genes involved in apoptosis. Since survivin and caspase-9 influences apoptotic process by providing different intensity and functionality of this process, it essential understand how functional genetic variants in genes encoding these proteins may affect the susceptibility to RCC and the development of aggressive tumors.
We conducted a case-control study with the aim to analyze the influence of BIRC5-31G/C and CASP9+83C/T functional polymorphisms in the susceptibility to RCC and development of metastatic disease.
We analyzed DNA samples from four hundred and eighty three subjects. One hundred and seventy eight (178) subjects with histopathological diagnose of RCC and three hundred and five (305) subjects without neoplasic disease. The BIRC5-31G/C and CASP9+83C/T polymorphisms were detected through PCR-RFLP and Real-Time PCR, respectively.
Concerning the BIRC5-31G/C polymorphism, carriers of CC genotype, with 62 years or less,have a tendency to present increased risk for RCC (OR = 1,74; P = 0,094) when compared with GG/GC genotype carriers. Multivariate logistic regression analysis that included age at diagnosis and gender, reveal the CC genotype was defined as an independent risk factor for RCC development (OR = 2,10; P = 0,023). For the CASP9+83C/T polymorphism, no statistically significant association was found between its genotypes and RCC susceptibility.
We show that CC genotype carriers concerning BIRC5-31G/C polymorphism, have an increased, at diagnosis, present metastatic disease (OR = 8,37; P = 0,003). With
Abstract
XXVIII
respect to CASP9+83C/T, no statistical association was found between polymorphism and disease with phenotype more aggressive, at diagnosis.
Kaplan-Meier methodology shows that in patients carriers of CC genotype, for the BIRC5-31G/C polymorphism, the waiting time to onset of metastatic disease is lower (P = 0,018) than carriers of the GC or GG genotypes. No statistical association was found between waiting time to onset of metastatic disease curves of CC genotype carriers versus T allele carriers, for the CASP9+83C/T polymorphism.
The evaluation of individual genetic profile according to BIRC5-31G/C and CASP9+83C/T functional polymorphisms could elucidate us about mechanisms involved in tumoral regulation and development as well as the molecular mechanisms involved in metastization. The establishment of individual genetic profile could be a promising tool in definition of risk groups to RCC development, in selection and direction of patients to a more effective and directed therapeutic, considering potential cellular pathways that are changed.
1. Introdução
3 1.1. Cancro: considerações gerais
Ao longo dos anos, o cancro tem-se revelado um problema crescente de Saúde Pública em todo o Mundo, constituindo uma das principais causas de morte em vários países 1. Estima-se que, actualmente, ocorram cerca de 12,7 milhões de novos casos de
cancro e 7,6 milhões de mortes por esta doença, em todo Mundo 2,3. Nas mulheres, o
cancro da mama é a neoplasia mais frequente, representando 23% das neoplasias diagnosticadas e a principal causa de morte por cancro, responsável por 14% das mortes por cancro 2,3. Nos homens, o cancro do pulmão é o mais frequente, representando 17%
dos tumores malignos diagnosticados e 23% das mortes por cancro 2,3.
Até à década de 70 do século passado, o cancro era uma doença enigmática. As teorias que procuravam decifrar a sua causa eram abundantes e na ausência de fortes evidências científicas para confirmar ou refutar qualquer uma delas, seria difícil considerar que esta patologia pudesse vir a ser compreendida. Este cenário acabou por sofrer mudanças drásticas fruto de uma forte pesquisa no âmbito da Oncologia, nas últimas décadas. Esta revolução pode ser, por conseguinte, resumida numa simples e única premissa “o cancro é, essencialmente, uma doença genética” 4, premissa que
contrasta com a complexidade desta doença.
A doença habitualmente denominada por “Cancro” é, na verdade, um conjunto de mais de duzentas doenças diferentes que podem afectar qualquer parte do corpo 5, cujo
principal factor de risco para o seu desenvolvimento é a idade 1,6. O processo de
carcinogénese não consiste exclusivamente num evento, mas sim num processo contínuo de alterações celulares discretas que se vão verificando ao longo do tempo, sob acção de múltiplos factores exógenos e endógenos 7, sendo considerado um processo
multifactorial e multifásico 8. No decurso da carcinogénese verifica-se um crescimento
celular desregulado que pode dar origem a uma massa identificável formada por células alteradas com capacidade de invadir e metastizar para tecidos adjacentes ou à distância
7,9.
A compreensão das bases moleculares do cancro tem-se revelado determinante para o estudo da história natural da doença e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Todavia, apesar de nas últimas décadas se ter assistido a um forte investimento no estudo das doenças oncológicas, muitas dúvidas e questões continuam por esclarecer. Por esse motivo, a Oncologia continua a ser um desafio aliciante para todos os que se entregam ao estudo dos seus mecanismos moleculares e respectivos tratamentos.
1. Introdução
4 1.2. Biologia molecular do cancro
1.2.1. Carcinogénese
Actualmente, o cancro não pode ser encarado apenas como sendo uma patologia altamente heterogénea, no que diz respeito ao tipo de células e origem do tecido 10. Na
verdade, este é, sobretudo, uma doença que envolve a desregulação de múltiplas vias que dirigem processos celulares fundamentais, nomeadamente a morte, proliferação, diferenciação e migração celulares 10.
A carcinogénese é um processo complexo e multifactorial que envolve a aquisição sequencial de várias alterações genéticas e/ou epigenéticas 8, que pode ser dividido em
três etapas principais: iniciação, promoção e progressão 1, esquematizadas na Figura 1.
Célula Normal Dano no DNA Falta de capacidade de reparação do DNA Mutações em células somáticas Inactivação dos genes supressores tumorais Activação de oncogenes Alterações nos genes reguladores da apoptose Proliferação celular
desregulada Diminuição da apoptose
Carcinogénios: -Químicos; -Radiações; -Vírus. Invasão e metastização Neoplasia Maligna Progressão tumoral Expansão clonal
Mutações herdadas em: -Genes de reparação do DNA; -Genes reguladores do crescimento e apoptose. Reparação do DNA Iniciação Promoção Progressão - Mutações adicionais; - Escape à imunidade; - Angiogénese.
Figura 1. Representação esquemática do processo de carcinogénese (adaptado de Kumar et al., 2007 1).
A iniciação consiste na aquisição de danos genéticos não letais que podem ocorrer nas células somáticas por acção de agentes carcinogénicos ou, por outro lado, que podem ser herdadas em células de linhagem germinativa 1. Se a célula iniciada não
possuir capacidade de reparar o dano sofrido, poderá acumular alterações genéticas sucessivas, o que conferindo-lhe vantagem selectiva sobre outras células normais –
1. Introdução
5
promoção 1. A acumulação sequencial de alterações genéticas em genes responsáveis
pelo controlo da proliferação celular, da morte celular programada e da manutenção da integridade do genoma, culmina na expansão clonal da célula “iniciada” 1. Por fim, a fase
de progressão consiste na expressão do fenótipo maligno e na aquisição de características de maior agressividade por parte das células neoplásicas 1. Durante a fase
de progressão, que é uma fase irreversível, outras alterações genéticas e epigenéticas poder-se-ão verificar, levando à activação de proto-oncogenes e à inactivação de genes supressores tumorais 1. As células tornam-se independentes das restantes células do
organismo, deixando de estar dependentes de estímulos externos para o seu crescimento e proliferação 11. Frequentemente, após a fase de progressão, as células
tumorais adquirem capacidade de invasão e de metastização 12. A metastização é um
processo complexo e também multifásico, através do qual células tumorais formam colónias em locais distantes do tumor primário 12. Este processo inicia-se quando as
células do tumor primário adquirem a capacidade de invadir os tecidos adjacentes – invasão 13. Posteriormente, estas células entram no sistema sanguíneo e linfático e
viajam através destes até outras partes do corpo – transporte 13. Quando as células
tumorais abandonam os vasos por onde circulam para tecidos vizinhos – extravasamento -, podem estabelecer pequenas colónias de células tumorais nesse local 13.
Ocasionalmente, essas células tumorais que constituem a micrometástase adquirem capacidade proliferativa, resultando no desenvolvimento de uma metástase macroscópica
13. As várias etapas que constituem o processo de metastização são executadas de
forma relativamente ineficiente dado que, de um vasto número de células que disseminam, só uma pequena parte delas originam, eventualmente, uma metástase 13.
Fruto do processo de carcinogénese, segundo Hanahan e Weinberg, seis características celulares essenciais são alteradas e adquiridas pelas células malignas: auto-suficiência em factores de crescimento; evasão à apoptose; insensibilidade a sinais inibidores de crescimento; angiogénese sustentada; potencial replicativo ilimitado; capacidade de invasão tecidual e metastização 8. Estas alterações podem ser adquiridas
de forma variável no que diz respeito ao seu mecanismo e cronologia 14. Posteriormente,
Mantovani propôs a inclusão da inflamação associada a cancro como o sétimo hallmark
15 (Figura 2), dada a sua importante contribuição na angiogénese, proliferação e
capacidade de metastização das células neoplásicas, bem como na subversão da imunidade adaptativa e redução da resposta a hormonas e agentes terapêuticos 16.
1. Introdução
6
Figura 2. Representação esquemática das alterações adquiridas pelas células neoplásicas (adaptado de
Hanahan and Weinberg et al., 2000 8 e Mantovani et al., 2009 15).
De indivíduo para indivíduo verifica-se que tanto as causas como os mecanismos envolvidos no processo de carcinogénese podem ser variáveis, o que realça a importância que os estudos na área da genética têm no âmbito da investigação. Deste modo, a identificação de genes envolvidos no desenvolvimento neoplásico é crucial na compreensão da Biologia do cancro, desenvolvimento de novas estratégicas terapêuticas e de métodos de prevenção e diagnóstico precoce. O uso de marcadores genéticos parece ser, por conseguinte, uma ferramenta promissora na análise do genoma humano e na identificação de genes e regiões do genoma que contribuem para o desenvolvimento de um fenótipo tumoral maligno 17.
1.2.2. Variabilidade genética individual
A sequenciação do genoma Humano permitiu clarificar a ideia de que a extensão da variabilidade genética era deveras superior à que tinha sido outrora estimada 18.
Enquanto algumas destas variações apresentam baixo impacto na saúde humana, existem outras que conduzem a alterações no fenótipo que, num contexto em particular, podem exercer um forte influência na susceptibilidade para o desenvolvimento de doenças e na resposta a estímulos ambientais 19,20 .
O tipo de polimorfismo mais comum no genoma humano designa-se de single nucleotide polymorphism (SNP) 18, consistindo na substituição estável de uma única
1. Introdução
7
população normal 17. Os SNP’s representam cerca de 90% das variações nucleotídicas
conhecidas, estimando-se que ocorram a cada 100 a 300 pares de bases 21. Sendo
assim, calcula-se que existam cerca de 165.000 SNP’s dentro dos estimados 20.000 a 25.000 genes cujas regiões codificadoras cobrem cerca de 1,5% do genoma humano 22.
Os SNP’s que podem afectar a expressão genética, podendo surgir em qualquer região do genoma (Figura 3). Aqueles que se localizam em regiões exónicas podem ser não sinónimos, levando a uma mudança de aminoácido e, consequentemente, a uma modificação da proteína ao nível da sua estrutura, polaridade, fosforilação inadequada, entre outras consequências funcionais 21; ou silenciosos, que não conduzem a variações
na proteína 23 e que constituem o tipo de SNP mais frequente 18. Por outro lado, os SNP´s
em regiões intrónicas podem conduzir a alterações na sequência de aminoácidos que constituem a proteína se estiverem localizados num local de splicing ou podem alterar, por outro lado, a expressão do gene se estiverem localizados numa região codificadora de microRNA’s 23. Menos previsíveis são os SNP’s em regiões não codificantes do
genoma, também denominados SNP’s reguladores (rSNP’s), que podem ter impacto nas sequências reguladoras de genes 24. Os rSNP’s mais estudados são os que se localizam
em locais de ligação de factores de transcrição dadas as suas múltiplas consequências
21. Na maioria dos casos, os rSNP’s não contribuem para o aparecimento de alterações
na interacção entre o factor de transcrição e o seu local de ligação, uma vez que um factor de transcrição reconhece um número considerável de locais de ligação 21. Contudo,
em alguns casos, os rSNP’s podem aumentar ou diminuir a ligação do factor de transcrição 21. Esporadicamente, o rSNP pode eliminar o local de ligação ou gerar um
novo local de ligação, fazendo com que o gene não seja regulado pelo factor de transcrição original 21.
1. Introdução
8
E2
SNP na região promotora SNP na região exónica SNP na região intrónica
SNP no local de ligação de factores de transcrição
SNP no local de ligação de factores de transcrição
SNP no local de ligação de factores de transcrição
mRNA
Sem alteração na expressão
Diminuição da expressão mRNA Aumento da expressão E2 Alteração da proteína Alteração da proteína
SNP em região intrónica codificadora de microRNA microRNA Sem ligação a mRNA Proteína Proteína Proteína
Ala Arg Asp
Ala Lys Asp
Ala Arg Asp
GCA AGA GAT
GCA AAA GAT
GCC AGA GAT
SNP não sinónimo
Alteração da proteína
Sem alteração da proteína SNP silencioso Sequência original
SNP em região de splicing
Figura 3. Localizações de SNP’s e respectivo efeito biológico (adaptado de Monzo et al., 2008 23).
O risco de desenvolvimento de doença neoplásica é determinado por complexas interacções entre factores ambientais e as características genéticas do indivíduo, onde se incluem os SNP’s 13, podendo estes condicionar a susceptibilidade de cada indivíduo
para o desenvolvimento de uma doença 25,26. Os SNP’s contribuem também para uma
vasta variação inter-individual na resposta à terapêutica, uma vez que qualquer alteração genética nas enzimas envolvidas na absorção, metabolismo, excreção e ligação a moléculas-alvo podem afectar a eficácia de uma fármaco 23. Assim, o objectivo principal
da Farmacogenómica passa pela identificação de polimorfismos que possam modelar a resposta a um tratamento, de forma a individualizar a terapia com base no perfil genético de cada doente 23.
Deste modo, torna-se importante a caracterização genética individual com base no estudo de SNP’s de modo a estabelecer perfis genéticos de risco para o desenvolvimento tumoral, estratificar grupos com significado prognóstico, caracterizar indivíduos de acordo com a resposta à terapia e optimização de terapias dirigidas a alvos moleculares.
1. Introdução
9 1.3. Carcinoma de células renais
1.3.1. Epidemiologia
O cancro renal representa um grupo heterogéneo de tumores que surgem no rim
27, exibindo uma extensa variabilidade de padrões morfológicos, à qual se associa igual
variabilidade de apresentação clínica, de comportamento biológico, resposta à terapia assim como diferente padrão de alterações genéticas 28.
O cancro renal representa uma das neoplasias urológicas mais importantes devido à sua elevada letalidade e crescente incidência nos países mais desenvolvidos 29,
representando cerca de 2,1% dos tumores malignos do adulto e 1,5% das mortes por cancro em todo o mundo 2. As taxas de incidência de cancro renal têm aumentado
durante as últimas décadas, em parte devido ao aumento da prevalência dos factores de risco 30 e também devido ao uso recorrente de técnicas imagiológicas mais avançadas na
avaliação de patologia abdominal que permitem a identificação de um maior número de tumores de forma acidental 31. Actualmente, verifica-se que as taxas de incidência de
cancro renal variam de acordo com a região geográfica: na Europa e na América do Norte as taxas de incidência são elevadas comparativamente às baixas taxas, verificadas na Ásia e na América do Sul 32 (Figura 4). No continente Europeu verifica-se, igualmente,
variações nas taxas de incidência entre os vários países, sendo superiores nos países da Europa Central e Oriental e inferiores nos países da região mediterrânica 31. Em 2006, na
região Norte de Portugal, a taxa de incidência padronizada de cancro renal em ambos os géneros foi de 4,9/100.000 habitantes, tendo sido a décima neoplasia mais prevalente 33.
Na Europa, a taxa de mortalidade por cancro renal sofreu um aumento progressivo até ao início da década de 90 31. Contudo, a partir da década de 90 verificou-se uma tendência
para a estabilização ou diminuição da mesma, o que poderá ter sido devido aos recentes avanços no diagnóstico e tratamento desta doença 31. Esta diminuição da mortalidade
verifica-se fundamentalmente em indivíduos de meia-idade, no género masculino e na Europa Ocidental 31.
Aproximadamente 80% dos tumores do rim são carcinomas de células renais (CCR) 34. Considerando apenas as neoplasias urológicas, o CCR é o tumor mais
frequente, depois do carcinoma da próstata e da bexiga 35. O CCR apresenta um pico de
incidência na sexta década de vida, sendo os 62 anos, a idade média de aparecimento desta neoplasia 36. O CCR é mais comum em indivíduos do género masculino, com uma
1. Introdução
10
Figura 4. Taxas de incidência padronizadas de cancro renal por 100.000 habitantes, em ambos os géneros
(GLOBOCAN 2008, IARC).
1.3.2. Factores de risco associados ao carcinoma de células renais
Estudos epidemiológicos realizados nos últimos anos têm demonstrado que alguns estilos de vida parecem estar envolvidos na etiologia e desenvolvimento de CCR
30. O tabagismo, a obesidade, a doença renal cística adquirida (DRCA) e a história
familiar da doença, encontram-se bem estabelecidos como factores de risco 34. No
entanto, existem outros, como os factores nutricionais, a hipertensão arterial (HTA) e os factores ocupacionais, que parecem também modular o desenvolvimento de CCR, apesar de serem necessários mais estudos para comprovar a sua associação 34.
O tabagismo é considerado um factor de risco para o desenvolvimento de CCR pela International Agency for Research on Cancer (IARC) 37. Este acarreta um aumento
de 1,2 a 2,3 vezes no risco de desenvolvimento desta neoplasia, comparativamente aos não fumadores, aumentando este risco com o aumento do número de cigarros fumados por dia 35. O risco induzido pelo fumo dos cigarros parece diminuir com o tempo de
cessação de fumar, mas apenas em indivíduos que tenham deixado de fumar há dez anos ou mais anos 32. Para além dos efeitos dos carcinogénios contidos no tabaco, o
fumo do cigarro pode aumentar o risco para CCR através da hipóxia crónica tecidual 30.
Estima-se que a obesidade, também considerada um factor de risco para o desenvolvimento de CCR, contribui para mais de 40% dos casos de CCR nos Estados Unidos e para mais de 30% dos casos de CCR registados na Europa, nas duas últimas
1. Introdução
11
décadas do século XX 38. A hipoxia crónica dos tecidos, a resistência à insulina, a
resposta inflamatória induzida pela obesidade, a peroxidação de lípidos e o stress oxidativo são alguns dos mecanismos que podem explicar o aumento do risco para CCR em pessoas obesas 38.
A HTA ou os fármacos utilizados no seu tratamento têm sido também associados a um aumento do risco de desenvolvimento de CCR 30,32. No entanto, a contribuição
independente de cada um destes factores é difícil de distinguir, dado que o consumo de diuréticos e de outros anti-hipertensores está frequentemente ligado a indivíduos com história de HTA 30. Apesar da forte relação entre o CCR, a obesidade e a HTA, estas
patologias parecem estar associadas de forma independente ao risco de desenvolvimento desta neoplasia. O risco para CCR é maior em indivíduos simultaneamente obesos e hipertensos do que naqueles que apenas apresentam exposição a um destes factores 32. Também a Diabetes mellitus parece estar associada a
um aumento de risco para CCR, no entanto, o seu efeito é difícil de separar da contribuição que a HTA e a obesidade têm para o desenvolvimento desta neoplasia 32.
Uma dieta equilibrada rica em frutas e vegetais, bem como a prática regular de exercício físico parecem contribuir de forma indirecta para a diminuição do risco de desenvolvimento de várias neoplasias, onde se inclui o CCR, uma vez que contribuem para a diminuição do risco de obesidade e HTA. Por outro lado, o contributo do consumo de álcool, café e chá para o desenvolvimento de cancro renal não é unânime 35.
Algumas doenças renais em fases avançadas, nomeadamente a DRCA, parecem estar associadas a um aumento do risco de desenvolvimento de CCR. Verifica-se que a incidência de CCR parece ser muito mais elevada em pacientes com DRCA do que na população em geral 39.
À semelhança do que acontece com outras neoplasias, o CCR ocorre tanto na forma esporádica como na familiar 40. A história familiar de doença tem sido associada a
um risco acrescido para o desenvolvimento de CCR. Tendencialmente, os doentes com CCR familiar apresentam tumores múltiplos e bilaterais e em idades mais precoces 41.
1. Introdução
12 1.3.3. História natural da doença
O rim é um dos órgãos mais diferenciados do corpo apresentando aproximadamente trinta tipos diferentes de células 7. Esta panóplia de células é
responsável por modular vários processos fisiológicos complexos, cruciais para o funcionamento adequado e para a homeostasia do organismo 7. As funções que os rins
desempenham podem ser sintetizadas em três funções principais: excretora, homeostática e endócrina 42,43.
Durante o século XX, persistiu a noção de que o rim albergaria um número limitado de doenças 44. No entanto, essa corrente de pensamento foi sendo
progressivamente substituída pela ideia de que o rim, de facto, apresentaria um elevado número de patologias distintas com diferentes prognósticos e alterações genéticas particulares 44.
O principal factor de divisão das neoplasias do rim é a idade. Nas crianças, os tumores nefroblásticos são os mais frequentes, onde se destaca o nefroblastoma que abarca cerca de 80% da totalidade das neoplasias no rim até aos dez anos de idade 41.
Por outro lado, nos adultos, predominam as neoplasias com origem nos túbulos renais e são constituídos pelos diferentes tipos histológicos de CCR 41. Os restantes tipos de
tumores, metanefréticos, mesenquimatosos, mistos epiteliais, entre outros, são muito raros 41.
Descrito pela primeira vez em 1826 por Konig 45, o CCR é, por sua vez, um grupo
heterogéneo de tumores 41. A Organização Mundial de Saúde, na classificação de 2004,
reconhece vários subtipos histológicos de CCR: células claras (RCCcc) (75%), papilar tipos I e II (10%), cromófomo (5%), familiar (4%), dos ductos colectores de Bellini, medular, associado à translocação Xp11.2/TFE3, associado ao neuroblastoma, tubular mucinoso e células fusiformes (todos inferiores a 1%) e inclassificáveis (4-6%) 46.
Muitas neoplasias renais permanecem assintomáticas e não palpáveis até ao final do curso natural da doença 47 devido, sobretudo, à localização anatómica dos rins no
retroperitoneu que permite que o crescimento local de um tumor renal passe despercebido até atingir dimensões consideráveis. O exame físico tem um papel limitado no diagnóstico de CCR, mas pode ser valioso em alguns pacientes, sobretudo naqueles em que a doença apresenta sintomatologia 47. A hematúria é o sintoma de apresentação
mais frequente (60% dos casos), seguida da dor lombar (40% dos casos) e da palpação de massa renal (30 a 40% dos casos) 47. A tríade clássica de Guyon (dor no flanco,
hematúria e massa palpável abdominal) não é habitual, sendo apenas encontrada em cerca de 6 a 10% dos doentes, denotando no entanto doença avançada, dado que está presente em 50% dos pacientes com doença metastizada 48. Aproximadamente 30% dos
1. Introdução
13
doentes com CCR, durante a evolução da sua doença, desenvolvem uma síndrome paraneoplásica, como resultado da produção de substâncias biologicamente activas pelo tumor ou por tecidos normais em resposta ao tumor 47,48.
O CCR apresenta uma grande variabilidade quanto ao seu comportamento biológico. Todavia, os tumores possuem características que ajudam a prever a agressividade da doença, nomeadamente, a dimensão do tumor inicial e o grau histológico (Grau de Fuhrman). O Grau de Fuhrman é habitualmente usado na classificação dos tumores renais dado que permite relacionar a agressividade da neoplasia com as características histológicas dos tumores, nomeadamente a dimensão do núcleo, irregularidade da membrana nuclear e proeminência dos nucléolos 49. De
acordo com este esquema, nas células tumorais classificadas de G1 e G2 os núcleos são pequenos e uniformes ou com alguma irregularidade, apresentando de baixo grau de malignidade 49. Por sua vez, as células tumorais classificadas de G3 e G4 exibem
contornos claramente irregulares, pleomórficos e bizarros, denotando alto grau de malignidade 49.
A par do diagnóstico histopatológico, o estadiamento clínico estabelecido aquando do diagnóstico constitui um dos passos mais importantes para orientar a terapêutica e inferir acerca do prognóstico da doença 50. O estadiamento clínico consiste
no agrupamento dos casos em categorias, tendo por base a extensão da doença, sendo esta uma descrição detalhada do grau de disseminiação da doença a partir do órgão de origem. O sistema de estadiamento TNM é, actualmente, o mais usado para avaliar a extensão do tumor primário (T), envolvimento dos gânglios linfáticos regionais (N) e presença de metástases à distância (M) 51.
Para indivíduos diagnosticados em estadios iniciais de desenvolvimento de CCR a excisão cirúrgica (nefrectomia) completa ou parcial é a única opção terapêutica curativa
47. Em indivíduos com tumores de estadios mais avançados a cirurgia é efectuada
apenas nos doentes seleccionados, frequentemente acompanhada de outras intervenções terapêuticas, nomeadamente o uso de imunoterapia, com recurso a citocinas 47. Aproximadamente um terço dos doentes apresenta doença metastática no
momento do diagnóstico 52e 25% dos doentes submetidos a cirurgia curativa irão
progredir e desenvolver doença metastática 53. As tradicionais terapêuticas sistémicas
baseadas nas citocinas, com baixa actividade anti-tumoral, deram lugar a novas terapias dirigidas, com melhores taxas de resposta, que têm como alvo vias envolvidas na angiogénese e metabolismo celular do tumor 54. Dentro das terapêuticas dirigidas
destacam-se os inibidores do vascular endothelial growth factor (VEGF) (Bevacizumab), os inibidores dos receptores cínase de resíduos de tirosina (Sunitinib, Sorafenib, Pazopanib) e os inibidores mammalian target of rapamycin (mTOR) (Temsirolimus) 53,55.
1. Introdução
14
Vários estudos revelaram que o CCR esporádico, sobretudo o CCRcc, apresenta características genéticas semelhantes à Síndrome Von Hippel-Lindau, uma síndrome hereditária que aumenta o risco de desenvolvimento de vários tipos de tumores incluindo o CCR 56. De facto, aproximadamente 50% dos CCRcc esporádicos apresentam
mutações somáticas no gene supressor tumoral VHL e cerca de 10 a 20% apresentam hipermetilação desse mesmo gene 57.
Em condições normais, o produto do gene VHL (pVHL) marca o factor de trascrição hypoxia-inducible factor-α (HIF-α) para ubiquitinação e subsequente degradação proteossomal 28,58. Quando se verificam alterações no gene VHL que
originem um pVHL não funcional ou em condições de hipóxia, não ocorre a ligação do pVHL ao HIH-α, conduzindo à acumulação de proteína HIF-α. A HIF- α activa a transcrição de vários genes envolvidos na angiogénese VEGF, no aporte de glucose (Glucose transporter 1- Glut1) e no crescimento celular (platelet-derived growth factor - PGDF - e Transforming growth factor beta - TGFβ) (Figura 5), cuja expressão aumentada gera um microambiente favorável à proliferação celular e angiogénese 28,58.
Em condições normais, o produto do gene VHL (pVHL), como parte de um complexo ubiquitina-ligase, promove a ubiquitinação (adição de ubiquitina, Ub) e degradação do factor HIF-α através da via do proteossomal. O HIF-α é um activador da transcrição de genes de resposta à hipóxia.
CÉLULA NORMAL Degradação proteossomal CÉLULA TUMORAL Pericito vascular CÉLULA TUMORAL Célula Endotelial Angiogénese Tumoral Proliferação de células tumorais e progressão do RCC CÉLULA TUMORAL
No carcinoma de células claras, a presença de anomalias no gene VHL resultam na perda de função do pVHL e na perda de expressão do gene VHL
Aumento de HIF-α
O VEGF e o PDGF ligam-se e activam os seus receptores, o VEGFR e o PDGFR, presentes na superfície das células. A activação destes receptores desencadeia vias de sinalização intracelular que promovem a proliferação e a angiogénese tumoral. Vias de sinalização intracelular Vias de sinalização intracelular NÚCLEO Aumento da expressão de VEGF e PDGF
A perda de função do pVHL e da expressão do gene VHL comprometem a degradação do HIF-α, originando níveis mais elevados deste factor que, por sua vez, promovem uma maior expressão do VEGF e do PDGF
1. Introdução
15
O pVHL está igualmente envolvido na regulação de outras moléculas, onde se inclui a p53. Em condições normais, o pVHL forma um complexo multimérico com a p53 e outras moléculas que promovem a estabilização e activação desta 60,61. Na ausência do
pVHL, os níveis da proteína p53 e a transcrição do respectivo gene são reduzidas, ficando comprometida a resposta a danos no DNA, proporcionando a progressão da célula maligna ao longo do ciclo celular sem ser iniciado o processo de apoptose 60,61. A
p53, por sua vez, é responsável por reprimir a actividade de um vasto número de genes implicados em múltiplos mecanismos celulares, onde se inclui a apoptose 62.
A carcinogénese renal é um processo complexo e multifásico determinado por factores genéticos e ambientais 63. A complexidade das doenças oncológicas, suportada
pela multiplicidade de moléculas e vias celulares que podem estar comprometidas na carcinogénese, permite-nos inferir que, no desenvolvimento de CCR poderão estar presentes alterações genéticas em moléculas envolvidas não só nas vias de proliferação celular mas também na apoptose.
1.4. A apoptose
O estudo da apoptose é uma das áreas da investigação em Oncologia que tem apresentado maior crescimento científico 13,64. Actualmente, sabe-se que o
desenvolvimento de mecanismos altamente conservados nas espécies 65, que controlam
o número de células de um organismo foi um marco essencial e determinante na evolução dos seres multicelulares 66. O número de células num organismo é
minuciosamente controlado pelo balanço entre proliferação, diferenciação e morte celular
13,67.
Para a sobrevivência dos organismos é essencial a manutenção da estabilidade genómica que é assegurada através de checkpoints que interrompem a progressão do ciclo celular quando são detectados danos no genoma. Nos organismos multicelulares a apoptose funciona como um checkpoint adicional de forma a eliminar as células com danos irreparáveis do DNA que caso contrário tornar-se-ia perniciosa 68. Assim, quando a
célula é confrontada com alguma perturbação que condicione a sua estrutura e/ou função, esta sofre alterações adaptativas que permitem a sua sobrevivência e a manutenção da sua função. No entanto, quando a perturbação é acentuada ou a adaptação não é efectiva a morte celular programada é desencadeada 69. Este processo
meticulosamente controlado visa, então, a eliminação de células que se encontram lesadas, durante a homeostasia tecidual dos organismos multicelulares, no desenvolvimento embrionário 70 e no funcionamento adequando do sistema imunitário 66.
1. Introdução
16
Isto ocorre sob condições fisiológicas normais podendo, no entanto, ser desencadeada por diversas patologias 71. Os organismos multicelulares adoptam sobretudo dois
mecanismos de morte celular programada para eliminar células alteradas, a necrose e a apoptose 69,72.
De uma forma sucinta, o processo de apoptose, descrito pela primeira vez por Kerr e colaboradores em 1972 73, consiste num tipo de morte celular limpa,
meticulosamente regulado 74 e dependente de energia 71. Neste processo, a cromatina é
condensada e o DNA fragmentado, sendo posteriormente incluídos em vesículas formando-se os corpos apoptóticos que são rapidamente fagocitados por macrófagos, resultando no desaparecimento da célula sem qualquer fenómeno inflamatório 72.
Nos mamíferos, a apoptose pode ser iniciada através de três vias diferentes: a via da granzima B, a via extrínseca ou dos receptores da morte e a via intrínseca ou mitocondrial. Na via da granzima B verifica-se, em primeiro lugar, a libertação de grânulos citotóxicos por parte de células T citotóxicas e natural killer, quando confrontadas com células transformadas ou infectadas por vírus. Esses grânulos citotóxicos contêm perforina (proteína capaz de criar poros na superfície das células que facilita a entrada de outras moléculas para o interior da célula) e granzima B 75 (protease serinica que cliva
após resíduos de ácido aspártico de forma semelhante às caspases). A granzima B induz a apoptose através da activação da caspase efectora caspase-3 76. No que diz respeito à
via extrínseca, esta é iniciada pela ligação de ligandos de morte (por exemplo o FasL ou o TNFα) aos respectivos receptores de morte (por exemplo o Fas ou o TNFR-1) localizados à superfície das células 75. Estes receptores de morte apresentam um
domínio transmembranar, o death domain (DD) que é essencial para o recrutamento de moléculas a jusante 71. Após a ligação do ligando ao respectivo receptor, verifica-se a
oligomerização do receptor e recrutamento de proteínas adaptadoras e de procaspase-8, formando um complexo death-inducing signaling complex (DISC). A autoclivagem da procaspase-8 no DISC é seguida pela activação de caspases efectoras que continuarão o processo de apoptose 77. A via intrínseca da apoptose é, por sua vez, mediada pela
mitocôndria. Vários estímulos pró-apoptóticos, nomeadamente choque térmico, danos no DNA, stress citotóxico e oxidativo podem proporcionar, directa ou indirectamente, alterações na permeabilidade da membrana externa da mitocôndria 71,76. Esta perda de
integridade da membrana leva à libertação para o citosol de vários factores pró-apoptóticos, onde se incluem a Second mitochondrial activator of caspases (Smac) e o citocromo c 78. No citosol, o citocromo c liga-se à Apoptotic protease-activating factor 1
(Apaf1) onde se liga posteriormente ATP ou dATP, originando um complexo oligomérico denominado apoptossoma 79. A formação do apoptossoma marca, então, a activação da
1. Introdução
17
posteriormente as caspases efectoras procaspases-3 e -7 que, por sua vez, clivam muitos substratos intracelulares importantes, levando a alterações morfológicas, características da apoptose (condensação da cromatina, fragmentação do DNA nucleosomal, quebra do invólucro nuclear, externalização da fosfatidilserina e formação de corpos apoptóticos) 80.
A apoptose é um mecanismo altamente regulado, onde cada etapa da cascata é monitorizada e controlada por um sinal anti-apoptótico 77. As proteínas inibidoras da
apoptose (Inhibitors of Apoptosis Proteins - IAP) são algumas das moléculas com função anti-apoptótica responsáveis pela regulação do processo apoptótico. A survivina é uma proteína que pertence a esta família que, através da inactivação da caspase-9, regula a via intrínseca da apoptose. Contudo, apesar de ser consensual o seu papel na inibição da apoptose, o mecanismo pelo qual essa inibição é feita é ainda bastante controverso 81.
Postula-se que o pool de survivina localizado na mitocôndria, enriquecido de forma dinâmica em resposta ao stress celular, seja libertado no citosol após estímulos apoptóticos 82, associando-se à X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) através do seu
domínio Baculovirus IAP Repeat (BIR) (semelhante ao domínio BIR3 da XIAP), aumentado a estabilidade desta última IAP 83. Dados estruturais e bioquímicos revelam
que durante o processamento da procaspase-9, é gerado um neo-epitopo N-terminal na pequena subunidade, ao qual se liga o domínio BIR3 da XIAP. Forma-se um complexo entre estas duas moléculas que impede, deste modo, a oligomerizar da procaspase-9 com a Apaf1 no apoptossoma 84. A survivina pode ainda, durante a Interfase, associar-se
à hepatitis B X-interacting protein (HBXIP), uma proteína que inibe a actividade da proteína X do vírus Hepatite B, formando um complexo. O complexo survivina - HBXIP liga-se à procaspase-9, impedindo-a de ser recrutada para oligomerizar com a Apaf1, suprimindo a activação desta caspase 85. A actividade anti-apoptótica da survivina é, por
sua vez, modelada por proteínas pró-apoptóticas, em particular a Smac, que impede a sua complexação com os seus co-factores 86.
1. Introdução
18 Survivina Survivina Survivina Porcaspase-9 XIAP HBXIP Survivina Smac Caspase-9 Apoptose Quimioterapia Danos no DNA Sinais pró-apoptóticos Agentespró-apoptóticos apoptoseVias da Membrana celular
Mitocôndria
Figura 6. Inibição da caspase-9 através da survivina e seus co-factores (adaptado de Mita et al., 2008 87).
Uma das principais alterações adquiridas pelas células neoplásicas é a capacidade de resistir à apoptose 8. Nas células tumorais, o balanço do crescimento
celular, determinado através do ratio entre a taxa de proliferação celular e a apoptose, encontra-se descontrolado 88. Verifica-se, igualmente, uma remoção ineficiente de células
alteradas que resulta num aumento da probabilidade de preservação e propagação de mutações e outras alterações genéticas que podem levar a instabilidade genómica em grande escala 88. A resistência à morte celular pelas células tumorais não é completa,
mas reforça-lhes a capacidade de sobrevivência num microambiente tumoral, muitas vezes hipóxico e com reduzida disponibilidade de nutrientes 13.
1.5. A survivina
A survivina é uma proteína intracelular de 16.5-kDa formada por 142 aminoácidos
89 que pertence à família das IAP´s 90. Quando comparada com os restantes elementos
desta família, a survivina é estruturalmente única 91 dado que é a IAP mais pequena,
contendo apenas um domínio BIR e uma longa hélice α na região C-terminal 91.
A survivina é codificada pelo gene BIRC5 localizado na região telomérica do cromossoma 17q25 (Figura 7) 92. O gene BIRC5 apresenta quatro exões principais (1, 2,
1. Introdução
19
Figura 7. Localização do gene BIRC5 no cromossoma 17 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
O gene BIRC5 apresenta um promotor TATA-less rico em GC 93 que possui duas
sequências específicas, a Cell Cycle-Dependent Element (CDE) e a Cell Cycle Gene Homology Region (CHR) 94. Através da ligação de proteínas aos elementos CDE/CHR, os
promotores dos genes com estas sequências sofrem repressão nas fases G0 e G1, que começa a ser diminuída a partir da fase S, deixando praticamente de existir na fase G2 e Mitose 95,96. O gene BIRC5 é, portanto, um gene “mitótico” dado o controlo meticuloso da
sua expressão que origina diferentes níveis de expressão de survivina de acordo com a fase do ciclo celular 94.
Nos últimos anos, diversos estudos deram ênfase ao carácter multifuncional da survivina 97. Esta está envolvida em vários mecanismos celulares 98, sendo a única IAP
envolvida simultaneamente na regulação do ciclo celular e na apoptose 99.
Durante a mitose, a survivina associa-se à Aurora cinase B, à Inner Centromere Protein (INCENP) e à Borealina que, em conjunto, formam o Chromosomal Passenger Complex (CPC) 100,101, responsável pela regulação da condensação dos cromossomas,
formação do fuso acromático e interação cinetócoro e microtúbulo 102. A survivina dirige o
movimento deste complexo para diferentes localizações e participa na organização do fuso acromático durante a polimerização dos microtúbulos 101. Paralelamente à formação
do fuso acromático, a survivina actua como sensor do ancoramento dos cinetocoros aos microtúbulos, um componente do checkpoint de ligação dos cinetocoros que é activado na ausência de tensão nos microtúbulos 98.
Na maioria dos tecidos adultos saudáveis a survivina parece estar ausente, excepto no timo, placenta e células basais do epitélio intestinal 87. Por outro lado, esta é a
única IAP normalmente expressa em tecidos embrionários e em tumores localizados nos mais diversos órgãos 103. Por conseguinte, o gene BRIC5 pertence ao “top 4”, de entre
mais de cem genes, que estão selectivamente expressos em células neoplásicas e não em células normais 104.
O papel da survivina na biologia tumoral excede a inibição da apoptose, já descrita anteriormente, que permite às células sobreviverem e crescerem num microambiente deficiente em oxigénio e factores de crescimento, condições estas que são hostis às células normais 101. O aumento da sua expressão, em tumores, pode
1. Introdução
20
progredirem no ciclo celular. Para além do seu papel directo na carcinogénese, a survivina pode ter também uma função importante na angiogénese devido ao facto de ser bastante expressa nas células endoteliais durante as fases de remodelação e proliferação 87.
A capacidade das IAP’s de agirem como inibidores tanto da via intrínseca com da via extrínseca da apoptose bem como a sua expressão proeminente nos tumores, fazem delas interessantes alvos terapêuticos 105. Para além disso, e apesar de ainda não se
entender o motivo, a inibição das IAP’s parece ser preferencialmente tóxica apenas para as células neoplásicas 106. Deste modo, prevê-se que na próxima década existirão
avanços significativos no desenvolvimento de terapêuticas contra estes alvos 107.
No que diz respeito à survivina, uma vez que esta pode ser facilmente detectada em amostras biológicas 103 e interfere com várias via moleculares associadas ao cancro 108, moléculas que tenham como alvo a survivina, poderão interferir com essas mesmas
vias, em vez de uma só, e fornecer melhores resultados do que outras terapêuticas dirigidas já existentes. Actualmente, encontram-se a ser desenvolvidas moléculas antagonistas da survivina que poderão vir a ser usadas, futuramente, no tratamento de neoplasias 66.
1.6. A caspase-9
A caspase-9 é uma proteína que pertence à família das caspases (cysteine-dependent aspartate specific protease), uma família de quinze proteases 76 intracelulares
de cisteína aspartato-dependentes, cuja catálise é orientada por uma cadeia de resíduos de cisteína altamente conservada e que apresentam elevada especificidade para clivar substratos proteicos que contenham resíduos de aspartato 109. Todos os elementos desta
família apresentam elevada similaridade no que diz respeito à especificidade para substratos, estrutura primária e quaternária.
As caspases estão organizadas de acordo com características estruturais e as funções que desempenham. Deste modo, definem-se dois grandes grupos: caspases inflamatórias e caspases apoptóticas 77. Por sua vez, o grupo das caspases apoptóticas
subdivide-se em caspases iniciadoras e caspases efectoras 75.
A caspase-9 é uma caspase iniciadora e, tal como as outras caspases desse grupo, activa as caspases efectoras, iniciando a propagação de sinais apoptótoticos.
A caspase-9 é codificada pelo gene CASP9, localizado no cromossoma 1p36.21
