Fator 1 Induzível por Hipóxia HIF-

O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um regulador central da resposta à mudanças na concentração de O2 e tem um papel importante nos processos fisiológicos

e patológicos em humanos, incluindo a regulação do metabolismo energético, homeostasia do ferro, viabilidade e proliferação celular, angiogênese, invasão e metástase, isquemia cerebral e do miocárdio, o retardo do crescimento fetal e a hipertensão arterial (SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008; UEHARA, et al., 2009; LIANG et al., 2011).

O HIF-1 é um fator de transcrição nuclear que funciona na forma de heterodímero, pertencente a família de fatores de trascrição basic-helix-loop-helix-PAS (bHLH-PAS), sendo composto pelas subunidades HIF-1α e HIF-1 (conhecida como translocador nuclear receptor aril hidrocarbono, ARNT). Cada subunidade tem dois domínios PAS, designados PAS-A e PAS-B. O domínio PAS foi designado como uma região comum encontrado no gene per de drosophila, um gene componente do ciclo circadiano, arnt humano e no sim de drosophila, um gene da regulação do sistema nervoso central (FILLIES et al., 2005; PATIAR; HARRIS, 2006; SEMENZA, 2006; SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008).

Além do HlF-1α, existem dois membros adicionais da superfamília bHLH-PAS, HIF-βα, referido como o domínio PAS da proteína endotelial 1 (EPAS1) e HIF-γα. Essas isoformas têm similaridade estrutural e são classificadas como família bHLH- PAS (TIAN; MCKNIGHT; RUSSEL, 1997).

O gene hif-a humano que codifica a proteína HIF-1α possui β.478 pares de base e a proteína consiste de 826 aminoácidos, com uma massa molecular que varia de 104 a 116 kDa. O hif-a encontra-se no cromossomo 14 e consiste de 15 exons interrompidos por 14 introns. O exon 2 codifica o domínio bHLH, essencial para dimerização e ligação da proteína com DNA, enquanto a região que vai dos exons 3 ao 8 codifica o domínio PAS. A região carboxi-terminal, que compreende os domínios responsáveis pela ativação e estabilidade da proteína, é codificada nos exons 9 a 15. O HIF-1α contém dois domínios de transativação, um N-terminal (TAD-N) que sobrepõe com o domínio de degradação dependente de oxigênio (ODD) e outro na região C-terminal (TAD-C) da proteína que é capaz de interagir com coativadores transcricionais tais como CBP/p300.

Ambos os domínios estão conectados um ao outro por um domínio inibitório (SEMENZA, 2006; FERREIRA et al., 2007) (Figura 1).

O gene arnt humano localiza-se na região q21 do cromossomo 1 e possui 22 exons. O gene processado que codifica para o ARNT possui 2.367 pares de base e a proteína consiste de 789 aminoácidos com uma massa molecualr de 94 kDa. O arnt possui duas formas variantes de processamento do RNA. O exon 5, o qual possui 45 nucleotídeos é um exon alternativo e pode ser processado, resultando assim em um transcrito com 2.322 pares de base o qual codifica para uma proteína de 774 aminoácidos. Esse processamento acontece em cerca de 50% dos arnt transcritos e essa proporção não parece variar muito entre os diferentes tecidos. Apesar do ARNT possuir duas formas variantes, nenhum efeito diferenciado nas células foi observado na forma onde o exon 5 foi omitido (FERREIRA et al., 2007). O ARNT é uma proteína nuclear constitutivamente expressa que também participa na resposta transcricional a agentes xenobióticos. O ARNT é capaz de formar outro complexo com o receptor de aril hidrocarbono (Ahr). Este complexo se liga ao elemento responsivo a xenobióticos (XRE), encontrado em muitos genes, tais como o gene CYAP1A1 que codifica o citocromo P450 com atividade hidrocarbono hidroxilase e NADP(H):oxiredutase. A ativação desses genes depende primariamente da ligação do Ahr a ligantes xenobióticos, incluindo 2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina (dioxina) e benzo(a)pireno. Enquanto o ARNT contém um domínio de ativacão transcricional, HIF-1α têm dois domínios de transativação, TAD-N e TAD-C (JIANG et al., 1996; GIACCIA et al., 2003; SEMENZA, 2006) (Figura 1).

O mecanismo de transativação pelo HIF-1 envolve a ligação do complexo HIF- 1α/ARNT aos motivos HREs (elementos responsivos à hipóxia) localizados nos promotores e enhancers dos genes alvos. Para a ativação dos genes alvos, vários coativadores são recrutados se ligando ao complexo do HIF-1, tais como o complexo CBP (proteína ligante ao CREB)/p300. Em adição ao CBP/p300, HIF-1 interage com o coativador SRC-1 (coativador 1 do receptor de esteróide) e com o Tie-2 (fator intermediário 2 da transcrição). Essa interação aumenta o potencial transcricional do HIF-1 de uma maneira dependente de O2 e produz um efeito sinérgico com CBP. Esse

efeito é fortemente potencializado pela proteína regulatória do estado redox Ref-1 (fator redox 1), uma proteína que tem atividade redutora de cisteína (GIACCIA et al., 2003; FERREIRA et al., 2007). Ref-1 interage fisicamente com ambos os domínios TAD-C e TAD-N, levando a uma transativação mais potente. Adicionalmente, a ligação do HIF-1 aos HREs não é suficiente para indução de muitos genes pela hipóxia. Tem-se verificado cooperações sinérgicas entre HIF-1α e outros fatores de transcrição, tais como Smad-3, fator 4 nuclear de hepatócito (HNF4), ATF1/CREB1, proteína 1 ativadora (AP1) e Ets-1 (BRACKEN et al., 2003).

Figura 1. Representação esquemática das proteínas que constituem as duas subunidades do HIF-1 humano. Os domínios de

importância funcional das subunidades HIF-1α e ARNT estão indicados da seguinte forma: bHLH, domínio helix-loop-helix básico; NLS-N e NLS-C, sinais de localização nuclear amino e carboxi-terminal; PAS, domínio de homologia Per-ARNT-Sim com repetições A e B; PSTD, domínio de estabilidade da proteína rico em prolina-serina-treonina; TAD-N e TAD-C, domínios de transativação amino e caborxi-terminal; ODD, domínio de degradação dependente de oxigênio; ID, domínio inibitório; REF-1, TRX, p300/CBP, indicam as regiões do HIF-1α onde o fator 1 redox, a tioredoxina e os coativadores p300/CBP se ligam. Os números indicam os resíduos de aminoácidos que delimitam as regiões funcionais das duas subunidades do HIF-1 humano. Fonte: Semenza (2000).

A estabilidade e a atividade do HIF-1α são reguladas por modificações pós- traducionais, tais como fosforilação, hidroxilação, nitrosilação e acetilação (SEMENZA, 2003; FEREIRA et al., 2007). O óxido nítrico promove a estabilização do HIF-1α, ligação ao DNA e a sua transativação sob condições de normóxia o que favorece o acúmulo HIF-1α; já sob condições de hipóxia, o óxido nítrico desfavorece o acúmulo de HIF-1α (FEREIRA et al., 2007).

Em relação à fosforilação, vários genes/oncogenes supressores de tumor influenciam ou são constituintes de cascatas de fosforilação e assim afetam os níveis de expressão do HIF-1α independente do O2. Essas cascatas podem ser iniciadas após a ligação dos

fatores de crescimento aos receptores de tirosina quinases que, por sua vez, ativam os alvos posteriores da via. Existem duas vias principais de fosforilação envolvidas na ativação do HIF-1, vias da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) (FERREIRA et al., 2007).

As três grandes sub-famílias das vias das MAPK, denominadas c-Jun NH2-terminal

quinases (JNKs), p38 MAPKs e as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs) mostraram ser reguladoras do HIF-1α (ALFRANCA et al., 2002). Sugere-se que a via de MAPK estaria envolvida somente na atividade de transativação através da fosforilação, não influenciando a estabilização ou habilidade de ligação do HIF-1 ao DNA (HUR et al., 2001). Entretanto, foi verificado que inibidores de MEK1(quinase 1 ativadora de MAPK) ou p38 MAPK bloqueiam a expressão gênica mediada por HIF-1, demostrando assim a importância da via da MAPK na funcionalidade do HIF-1α (RICHARD et al., 1999).

A cascata de sinalização pela PI3K representa outra via de fosforilação do HlF-1α. A proteína quinase que é ativada posteriormente à ativação de PI3K, conhecida como AKT, tem alguns alvos envolvidos na apoptose, no ciclo celular e no crescimento celular (VIVANCO; SAWYERS, 2002). Um dos alvos é a proteína associada a rapamicina/FKBP (FRAP; também conhecida como mTOR). FRAP fosforila a proteína regulatória da tradução 4E-BP que, por sua vez, aumenta os níveis transcricionais (GINGRAS et al., 2001). Essa via é também regulada por PTEN, uma proteína supressora de tumor; pelo glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3); envolvida na estabilização do HIF-1α em condições de hipóxia por mecanismos ainda desconhecidos

(MOTTET et al., 2003); e pela proteína Ras um oncogene multifuncional que pode estimular ambas as vias da MAPK e do PI3K (POUYSSEGUR; LENORMAND, 2003).

Sob condições de normóxia, o HIF-1α é constitutivamente expresso e subsequentemente hidroxilado por uma HIF prolil-hidroxilase (HPH), levando-o a uma rápida degradação mediada pelo proteassoma. Essa degradação envolve a ação de um complexo ubiquitina-ligase contendo o fator Von Hippel Lindau, uma proteína supressora de tumor (pVHL) que faz parte de um complexo de proteínas, constituído pela elonguina B e C e culina 2 (SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008). A pVHL reconhece os resíduos de prolina hidroxilados (Pro402 and Pro564) presentes no domínio ODD do HIF-1α (BRUICK; MCKNIGHT, 2001). A prolil-hidroxilase é uma dioxigenase que usa O2 e 2-oxoglutarato como substratos. Essa enzima transfere um

átomo de O2 para os resíduos de prolina e o segundo átomo de O2 reage com o 2-

oxoglutarato gerando o succinato. Ela também requer ferro como cofator, o qual se liga ao O2 quando mantido no estado ferroso pelo ácido ascórbico. Sua atividade é

suprimida pelo decréscimo na tensão de O2. Quando HPH é inibida, a via de degradação

do HIF-1α é bloqueada, levando assim ao acúmulo dessa proteína e sua migração para o núcleo, onde ela ativa genes responsivos à hipóxia. (Figura 2) (BRUICK; MCKNIGHT, 2001).

Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de regulação da expressão gênica do HIF-1α. Sob condições de normóxia

o HIF-1α é hidroxilado pelas hidroxilases nos resíduos de asparagina e prolina, as quais usam como substratos o O2 e 2-

oxoglutarato. O reconhecimento dos resíduos de prolina hidroxilados da subunidade HIF-1α sob condições de normóxia se dá pela proteína supressora de tumor Von Hippel Lindau (VHL). O HIF-1α é ubiquitinado e em seguida degradado pelo proteassoma. Fonte: Höpfl; Ogunshola; Gassmann (2004).

2-oxoglutarato Succinato Fe+2

Ácido ascórbico

Existem três HPH, 1, 2 e 3, conhecidas também como proteínas contendo o domínio de prolil-hidroxilase (PHD) 3, 2 e 1, respectivamente. As PHDs hidroxilam prolinas específicas dentro de um domínio altamente conservado com a seguinte sequência de aminoácido: LXXLAP (onde X indica qualquer aminoácido; P, indica a prolina receptora do grupo hidroxila, L, leucina e A, alanina) (BRUICK; MCKNIGHT, 2001). Quanto à localização celular, a PHD1 encontra-se exclusivamente no núcleo, PHD2 no citoplasma e PHD3 é encontrada em ambos os citoplasma e núcleo, com predominância no citoplasma. Somente os níveis dos mRNA de PHD2 e PHD3 são induzíveis por hipóxia, enquanto os níveis de expressão do mRNA de PHD1 independem da hipóxia (METZEN et al., 2003).

A interação do complexo CBP/p300 com o HIF-1α é sensível aos níveis de O2,

sendo inibida após a hidroxilação de um resíduo de asparagina (As803) no domínio TAD-C do HIF-1α por uma asparagil hidroxilase, também conhecida como fator inibidor de HIF-1 (FIH). Similar às prolil-hidroxilases, FIH pertence à superfamília das dioxigenases dependentes de 2-oxoglutarato cuja atividade requer O2 como substrato

(Figura 2). A hidroxilação do resíduo de asparagina não leva à degradação do HIF-1α e, portanto não está diretamente envolvida no mecanismo sensor de O2. Assim, a inibição

da hidroxilação do resíduo de aminoácido Asn803 permite que o TAD-C interaja com o domínio rico em cisteína e histidina dos cofatores de transcrição, CBP/p300 (LANDO et al., 2002; SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008).

Em condições de hipóxia, há o recrutamento do coativador CPB/p300, em seguida, HIF-1α transloca-se para o núcleo, formando o heterodímero com o ARNT, onde se ligam ao motivo HRE dos genes alvos. Chilov et al. (1999) mostraram que o acúmulo de HIF-1 α no núcleo em células submetidas à hipóxia é uma característica intrínsica desse fator de transcrição, já que ele é independente da presença do ARNT. Sob condição de hipóxia, HIF-1α não é degradada e assim seus genes alvos são expressos e uma resposta fisiológica à concentração de O2 é ativada (Figura 3).

Em relação ao mecanismo da acetilação, foi verificado que o resíduo do aminoácido lisina 532 (K532) localizado no domínio ODD do HIF-1α é acetilado por uma acetiltransferase chamada arrest-defective-1 (ARD1). A acetilação da K532 favorece a interação do HIF-1α com o pVHL e assim desestabiliza o HIF-1α. A atividade das acetiltransferases não é alterada pelos níveis de O2, mas os níveis do mRNA do ARD1

(e conseqüentemente da proteína) diminuem sob condições de hipóxia, levando a um menor nível de acetilação do HIF-1α do que sob normóxia (JEONG et al., 2002).

Cerca de 70 genes alvos do HIF-1 são conhecidos, incluindo genes envolvidos com o suprimento de O2, genes do metabolismo celular, genes que regulam a proliferação e

sobrevivência celular, motilidade e estrutura do citoesqueleto, tônus vascular, adipogênese, desenvolvimento dos linfócitos B e resistência a drogas (FERREIRA et al., 2007).

A identificação de genes alvos do HIF-1 tem sido realizada usando-se várias estratégias, incluindo: identificação de genes que contem os motivos de ligação do HlF (HREs); comparação dos padrões de expressão gênica entre células tipo-selvagem para a expressão do HIF-1α com células que não expressam essa proteína ou ainda através de técnicas de RNA de interferência; varredura dos níveis aumentados de expressão gênica

Figura 3. Representação esquemática do mecanismo de regulação da expressão gênica do HIF-1α. Sob

condições de hipóxia: ocorre a heterodimerização das subunidades HIF-1α fosforilada e HIF-1 (ARNT) que se ligam à uma sequência de consenso de DNA que está contida dentro da sequência conhecida como HRE, exixtente nos genes alvos. Fonte: Höpfl; Ogunshola; Gassmann (2004).

usando células que não expressam VHL ou células transfectadas com vetores que expressam a subunidade HIF-1α. Os genes transcricionalmente ativados pelo HIF-1 participam de diversos processos celulares e codificam proteínas que residem em diferentes compartimentos celulares, por exemplo, fatores transcricionais nucleares, proteínas ligadas à membrana, proteínas citosólicas e fatores de crescimento (SEMENZA, 2003).

Sob condições severas de hipóxia, a geração de ATP a partir da fosforilação oxidativa é substituída pela geração menos eficiente de ATP através da glicólise anaeróbica. Dessa forma, o fornecimento de ATP para a síntese de proteínas pode cair até 7% em relação às células expostas a condições de normóxia. Para compensar o decréscimo de ATP normalmente fornecido pela fosforilação oxidativa, HIF-1 ativa genes-chaves envolvidos no mecanismo da glicólise e no transporte da glicose, tais como o GLUT-1 e 3, fosfofrutoquinase L (PFK), fosfoglicerato quinase 1 (PGK1) e lactato desidrogenase-A (LDHA) (SEMENZA, 2003). Muitos fatores pró-angiogênicos como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator transformador de crescimento- β (TGF- 2), receptor do VEGF, fator de crescimento básico de fibroblasto (FGFb) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) são induzidos por HIF-1 para promover a angiogênese (SEMENZA, 2003; SEMENZA, 2006; FERREIRA et al., 2007).

Adicionalmente, Wenger et al. (2005) estimam que existam pelo menos 200 genes de mamíferos regulados por HIF-1, embora aparentemene nem todos eles sejam regulados diretamente pelo motivo HRE em suas regiões promotoras. Nesse caso, outros fatores de transcrição regulados por O2 e que sejam dependentes ou

independentes do HIF podem ser responsáveis pela indução da transcrição pela hipóxia.

O HIF-1 se liga aos genes alvos em sítios contendo o centro de reconhecimento 5'- RCGTG-3' (onde R indica adenina ou guanina; C, citosina; G, guanina; T, tiamina) (SEMENZA, 2006). A presença dos sítios de ligação do HIF-1 (HBS) é necessária, mas não suficiente para a expressão dos genes em resposta à hipóxia, indicando que o HIF-1 deve interagir com outros fatores de transcrição ligados a sítios adjacentes (FERREIRA et al., 2007).

Embora o HIF-1 tenha sido inicialmente descrito como o fator de transcrição regulado pela hipóxia, existem crescentes evidências de que essa molécula é também responsiva a uma variedade de estímulos não hipóxicos. Entre esses estímulos podemos citar a insulina, PDGF, fator transformador de crescimento- 3 (TGF- 3), fator 1 de crescimento de insulina (IGF-1), trombina, peptideos vasoativos tais como angiotensina II, citocinas pró-inflamatórias, carbacol que ativa os receptores de acetilcolina muscarínicos. Além disso, foi mostrado que essa proteína é ativada por metais tais como, cobalto, cromo, níquel e arsênio, como também por estresse mecânico. No entanto, os mecanismos pelos quais esses estímulos não hipóxicos induzem esse fator de trascrição não são completamente conhecidos, embora algumas evidências apontam para o papel dos EROs (espécies reativas de oxigênio) como mensageiros regulando a atividade do HIF-1 (FERREIRA et al., 2007).

Portanto, com relação ao estudo da carcinogênese, considerando a necessidade atual do descobrimento de novos parâmetros clínicos e patológicos e/ou ferramentas diagnósticas que possam agilizar o reconhecimento precoce do câncer oral e melhorar o prognóstico dos pacientes, a alteração e a superexpressão do HIF-1α vem sendo detectada em uma variedade de tumores sólidos, incluindo mama, rim, fígado, endométrio, ovário, pulmão e tumores de cabeça e pescoço (BEASLEY et al., 2001; UEHARA, et al., 2009), os quais tem sidos correlacionados com a gradação histológica, metástase linfonodal, espessura tumoral, aspectos clínicos, taxa de sobrevida e prognóstico (LIN et al., 2008; CHEN et al., 2009). Além disso, pôde-se ainda verificar a forte expressão dessa molécula em uma série de casos de condições pré-malignas como, por exemplo, na fibrose submucosa oral (TILAKARATNE et al., 2008).

Kyzas et al. (2005) investigando a correlação do VEGF e o HIF-1α com os parâmetros clínico-patológicos e prognóstico em 81 casos de CE de cabeça e pescoço, constataram uma associação estatisticamente significativa entre a expressão do VEGF e do HIF-1α nos tumores localizados no lábio inferior e na laringe. Entretanto, a expressão do HIF-1α não foi significativamente correlacionada com a taxa de sobrevida, enquanto a expressão do VEGF esteve correlacionada ao pior prognóstico. Os autores suportam que a angiogênese tumoral poderia estar relacionada, mas não estritamente dependente do ambiente hipóxico tumoral.

Chen et al. (2009) observaram em 54 casos de CE esofágico que 46% dos espécimes imunomarcados intensamente pelo do HIF-1α estavam correlacionados com a profundidade da invasão, metástase linfonodal e estágio clínico.

Burrows et al. (2010), buscando perspectivas para determinação prognóstica e para a terapêutica tumoral em carcinoma de tireóide, verificaram que uma intensa expressão do HIF-1α, principalmente nas lesões desdiferenciadas, estava relacionada com pior taxa de sobrevida. Outrosim, ressaltaram que umas das principais vias de fosforilação envolvidas na ativação do HIF-1 seria pela sinalização da via PI3K, a qual poderia ser um alvo promissor para o tratamento das lesões de cabeça e pescoço, devido a uma forte associação do HIF-1α com o fenótipo da agressividade e resistência à terapêutica.

Sasabe et al. (2005) analisando os mecanismos de sobrevivência de linhagens de células de CEO em condições de hipóxia, descreveram que a superexpressão do HIF-1α inibia a apoptose por impedir a liberação do citocromo c pelas mitocôndrias, acarretar a não formação de EROs e por diminuir a concentração de íons de cálcio no meio intracelular, resultando, dessa forma, na inativação das caspases 9 e 3. Além disso, moléculas antiapoptóticas (Bcl-2 e Bcl-xL) e pró-apoptóticas (Bax e Bak) estariam em níveis aumentados e diminuídos, respectivamente pela superexpressão desse marcador de hipóxia. Os autores ressaltam, ainda, que o HIF-1α estaria associado, em virtude desse mecanismo, a um pior prognóstico, menor taxa de sobrevida e resistência à quimioterapia.

Na pesquisa conduzida por Fillies et al. (2005), com 85 casos de CE de assoalho oral, observou-se que a superexpressão do HIF-1α estava correlacionada significantemente com a taxa sobrevida de cinco anos livre de doença, independente do tamanho do tumor e envolvimento dos linfonodos cervicais, sendo assim, um fator favorável para prognóstico em pacientes com o estadiamento clínico T1/T2.

Conforme o estudo realizado por Lin et al. (2008), em 57 casos de CEO, 41 espécimes de displasia epitelial oral (12 leves, 17 moderadas e 12 severas) e 14 amostras de mucosa oral normal, verificou-se que a imunoexpressão nuclear do HIF-1α era mais fortemente evidenciada nas neoplasias orais, principalmente próximo a regiões necróticas, áreas de ceratinização e de infiltração tumoral quando comparadas com a

mucosa oral normal e displasias epiteliais. Constatou-se, ainda, que a imunomarcação dessa proteína nos casos CEO apresentou uma relação estatisticamente significativa de acordo com o tamanho do tumor, metástase para linfonodos cervicais e estadiamento clínico da lesão, sugerindo, assim, que a expressão do HIF-1α exerce um papel importante na carcinogênese oral, podendo ser utilizado como um recurso adjuvante na predição da taxa de sobrevida e da progressão tumoral.

Uehara et al. (2009), demonstraram, em 57 casos de CEO, que a intensa imunoexpressão do HIF-1α estava associada com a metástase linfonodal, quando comparado com pacientes sem metástase, interferindo, assim com o pior prognóstico.

Avaliando a expressão do HIF-1α em 8β casos de CEO, Erket et al. (2010a) relataram que nos pacientes com tumores ausentes de marcação ou que foram fracamente imunomarcados, a taxa de sobrevida foi 80% superior a 5 anos, quando comparada com as lesões que apresentaram moderada a forte marcação, cuja sobrevivência diminuiu para 33,6%. Evidenciaram, ainda, que o risco de óbitos foi 3,5 vezes maior nas lesões fortemente imunomarcadas (p = 0,016) por essa molécula.

Ryu et al. (2010) analisando culturas de células de CEO, demonstraram que a hipóxia aumentava a concentração do HIF-1α, quando comparado com o estado de normóxia, alterando a expressão da integrina α5 e fibronectina as quais encontram-se

envolvidas no mecanismo de crescimento e invasão tumoral.

Adionalmente, com objetivo de avaliar o mecanismo funcional do HIF-1α, HIF- βα, GLUT-1 e CA-IX em CEO, Zhu et al. (2010) avaliaram a imunoexpressão dessas