mite o estudo de propriedades eletrost´aticas em prote´ınas
6.1.5 Ferramentas auxiliares desenvolvidas (Tools)
Al´em das ferramentas dispon´ıveis neste portal web, foram desenvolvidas v´arias ou- tras auxiliares que permitem expandir as an´alises realizadas e auxiliar os usu´arios durante a manipulac¸˜ao de estruturas de prote´ınas, como por exemplo, verificar erros de inconsistˆencia nos arquivos PDB, separar um complexo prot´eico em prote´ınas independentes a partir de um arquivo no formato PDB, etc. Isso proporciona que outros estudos (folding, predic¸˜ao de estrutu- ras, mutac¸˜oes na prote´ına, etc.) sejam realizados, al´em dos j´a providos por este portal. A seguir apresentamos a descric¸˜ao e exemplos de utilizac¸˜ao de cada uma das ferramentas auxiliares de- senvolvidas neste trabalho.
6.1.5.1 Criar um arquivo no formato PQR (Create PQR file)
Esta ´e uma interface para ferramentas desenvolvidas por outros grupos e que permite a criac¸˜ao de arquivo no formato PQR a partir de um arquivo PDB. O usu´ario informa ao sistema a prote´ına atrav´es do c´odigo PDB da mesma ou enviando ao sistema (upload) o arquivo no for- mato PDB que cont´em a estrutura da prote´ına. Em seguida, ´e necess´ario selecionar o campo de forc¸a que ser´a utilizado para atribuic¸˜ao das cargas e raios dos ´atomos de cada amino´acido. O sis- tema exibe, como resposta, o arquivo no formato PQR da prote´ına informada pelo usu´ario. Es- tamos utilizando o programa PDB2PQR v.1.3.0 para a realizac¸˜ao desta tarefa, quando o usu´ario seleciona os seguintes campos de forc¸a: AMBER99, CHARMM27, PARSE, TYL06. Quando o campo de forc¸a escolhido for o GROMOS96 v.53A6, utilizamos o pacote GROMACS v.4.0.5 para criar o arquivo no formato PQR. A Figura 33 exibe a tela para configurac¸˜ao dos parˆametros utilizados na criac¸˜ao de um arquivo no formato PQR a partir de um arquivo no formato PDB.
Figura 33: Tela da ferramenta que permite criar um arquivo no formato PQR a partir de um arquivo PDB.
6.1.5.2 Criar os arquivos utilizados pelo pacote MEAD (Create MEAD files)
O pacote MEAD necessita de diversos arquivos de configurac¸˜ao, como por exemplo, uma lista dos res´ıduos ioniz´aveis que est˜ao presentes na estrutura da prote´ına, configurac¸˜ao das cargas (no estado protonado e deprotonado) de cada ´atomo contido nos amino´acidos presentes na estrutura da prote´ına, criac¸˜ao do arquivo no formato PQR, etc. A criac¸˜ao de tais arquivos nem sempre ocorre de maneira trivial, assim visando ampliar as possibilidades providas pelo portal e ao mesmo tempo proporcionar a criac¸˜ao de tais arquivos por usu´arios n˜ao familiarizados com as t´ecnicas empregadas para este fim, desenvolvemos uma ferramenta capaz de criar todos os arquivos de configurac¸˜ao, utilizados pelo MEAD, de forma autom´atica. Como parˆametros, o usu´ario dever´a informar apenas o c´odigo PDB da prote´ına e o campo de forc¸a que ser´a utilizado. A Figura 34 exibe a tela para entrada dos parˆamentros utilizados pela ferramenta “Create MEAD
Figura 34: Ferramenta “Create MEAD files”.
Ap´os a execuc¸˜ao desta ferramenta, todos os arquivos de configurac¸˜ao podem ser ob- tidos (download) diretamente do portal. Esta ferramenta extende as funcionalidades do portal assim como as possibilidades para o usu´ario, uma vez que estes arquivos de configurac¸˜ao podem ser utilizados em diversas novas an´alises, atrav´es da utilizac¸˜ao de outros programas pertencen- tes ao pacote MEAD, como por exemplo, o c´alculo do potencial eletrost´atico na superf´ıcie do soluto, realizado pelo programa potential.
6.1.5.3 Separar prote´ınas (Split proteins)
Esta ferramenta ´e utilizada quando se deseja analisar, individualmente, prote´ınas que est˜ao complexadas. A partir de um arquivo no formato PDB, de um complexo prot´eico, a fer- ramenta separa em arquivos individuais, no formato PDB, cada prote´ına presente no complexo. Tal recurso permite que v´arias an´alises sejam feitas, por exemplo: I) avaliar o comportamento de um complexo formado por trˆes prote´ınas, quando apenas duas delas est˜ao complexadas; II) combinar prote´ınas que est˜ao presentes em diferentes complexos, em um novo complexo, e avaliar seu comportamento; III) calcular as propriedades eletrost´aticas das prote´ınas presentes
Figura 35: Tela para aquisic¸˜ao dos parˆametros experimentais, utilizados pela ferramenta “Split proteins”.
no complexo, de forma individual, etc. Para utilizar essa ferramenta o usu´ario dever´a informar os c´odigos PDB’s dos complexos de prote´ınas as quais deseja analisar e escolher a tabela de referˆencia que ser´a utilizada para prover os valores de pKa’s experimentais que ser˜ao utilizados nos c´alculos das propriedades eletrost´aticas das prote´ınas. Nesta ferramenta os c´alculos s˜ao realizados no n´ıvel de predic¸˜ao ideal. A Figura 35 ilustra a tela onde o usu´ario insere os c´odigos PDB’s das prote´ınas e/ou complexos de prote´ınas que ser˜ao processados.
A Figura 36 exibe os complexos de prote´ınas separados em prote´ınas independentes, onde ´e poss´ıvel combin´a-las, duas a duas, para prever a complexac¸˜ao entre as mesmas. Clicando nos links Titration e Capacitance, ´e poss´ıvel ver as propriedades de cada prote´ına individual- mente, assim como os arquivos no formato PDB, gerados pelo PROMETHEUS, de cada uma delas, atrav´es do link que informa o c´odigo PDB do complexo/cadeia.
As Figuras 37 e 38 apresentam, respectivamente, as curvas de titulac¸˜ao e capacitˆancia, no n´ıvel de predic¸˜ao ideal, do complexo proteinase-inibidor (PDB: 2PTC), composto por duas
Figura 36: Complexos de prote´ınas separados em prote´ınas independentes pela ferramenta “Split proteins”.
prote´ınas6.
6Todo arquivo PBD que possui mais de uma cadeia ´e considerado um complexo prot´eico. Assim, as prote´ınas
que formam o complexo s˜ao identificadas por tais cadeias. Por exemplo, o complexo proteinase-inibidor (PDB: 2PTC), ´e identificado por duas cadeias distintas, E e I, no arquivo PDB.
Figura 37: Curvas de titulac¸˜ao ideal de cada prote´ına individual, presente no complexo proteinase-inibidor (PDB: 2PTC).
Figura 38: Curvas de capacitˆancia ideal em func¸˜ao do pH de cada prote´ına individual, presente no complexo proteinase-inibidor (PDB: 2PTC).
6.1.5.4 Classificac¸˜ao de prote´ınas (Find best case)
Esta ferramenta gera uma classificac¸˜ao entre as prote´ınas e/ou complexos de prote´ınas, escolhidos pelo usu´ario ou entre todas as prote´ınas e complexos de prote´ınas presentes no nosso banco de dados, quanto `as suas propriedades eletrost´aticas: titulac¸˜ao e capacitˆancia. Como parˆametros, o usu´ario dever´a indicar: I) em qual pH as prote´ınas dever˜ao ser classificadas; II) qual o crit´erio de classificac¸˜ao (titulac¸˜ao ou capacitˆancia) e III) o modo de ordenac¸˜ao do re- sultado (crescente ou decrescente). A Figura 39 exibe a tela de aquisic¸˜ao de parˆametros para a execuc¸˜ao da ferramenta “Find best fit”. Ap´os selecionar os parˆametros, o usu´ario dever´a clicar em “Send parameters” e em seguida, em “Process”. Na Figura 40, um exemplo ´e apresentado. Nesta an´alise, configuramos o pH em 7,5 e, como modo de ordenac¸˜ao, a titulac¸˜ao em ordem decrescente. Clicando no link “properties” da coluna “Single protein properties”, o usu´ario po- der´a visualizar a curva de titulac¸˜ao e capacitˆancia da prote´ına escolhida, assim como o arquivo no formato PDB gerado pelo PROMETHEUS, clicando no seu respectivo c´odigo PDB. Nesta ferramenta todos os c´alculos s˜ao realizados utilizando o n´ıvel de predic¸˜ao ideal. Futuramente estas an´alises ser˜ao estendidas para o n´ıvel de predic¸˜ao Poisson-Boltzmann, proporcionando uma melhor precis˜ao dos resultados.
Figura 40: Tela para apresentac¸˜ao do resultado obtido pela ferramenta “Find best case”, para um conjunto de prote´ınas, no pH 7,5.
6.1.5.5 Limpar PDB (Clean PDB)
O arquivo PDB cont´em v´arias informac¸˜oes a respeito da estrutura de uma prote´ına: m´etodo utilizado para obtenc¸˜ao da estrutura, fonte de origem da prote´ına, informac¸˜oes sobre os pesquisadores que elucidaram tal estrutura, hetero´atomos, ligantes presentes na estrutura, etc. Muitas vezes esse vasto conjunto de informac¸˜ao n˜ao ´e relevante para c´alculos em particular. Visando simplicar, foi desenvolvida uma ferramenta que efetua a preparac¸˜ao inicial do arquivo no formato PDB, tal processo consiste em duas etapas:
1. Remoc¸˜ao de campos “desnecess´arios”: Todos campos do arquivo no formato PDB s˜ao exclu´ıdos, exceto os campos SEQRES (informac¸˜oes sobre a seq¨uˆencia prim´aria da prote´ına), ATOM (informac¸˜oes sobre a estrutura tridimensional da prote´ına) e SSBONDS (informac¸˜oes sobre as pontes dissulf´ıdicas presentes na estrutura). Para a maioria das an´alises e operac¸˜oes realizadas com as estruturas de prote´ınas, essas s˜ao as informac¸˜oes mais relevantes.
2. Checagem da consistˆencia da estrutura da prote´ına: Ap´os a “limpeza” do arquivo, ´e realizada uma verificac¸˜ao de consistˆencia da estrutura da prote´ına. Tal checagem consiste em:
a. Validac¸˜ao da estrutura: Esta ´e uma fase cr´ıtica para confiabilidade n˜ao s´o do c´alculo dos potenciais estat´ısticos, mas para todas as an´alises providas pelos portais. A classe base respons´avel pela validac¸˜ao das estruturas ´e chamada FcrpValidation, a qual realiza os seguintes procedimentos:
b. Verificac¸˜ao por res´ıduos faltantes: A aplicac¸˜ao verifica se todos os res´ıduos pre- sentes na seq¨uˆencia prim´aria da prote´ına, providos pelo campo SEQRES do arquivo PDB, est˜ao presentes na resoluc¸˜ao da estrutura tridimensional da prote´ına, provida pelos campos ATOM do arquivo PDB;
c. Verificac¸˜ao por ´atomos faltantes: Para cada res´ıduo presente na estrutura prim´aria da prote´ına ´e verificado se este possui todos os ´atomos que o comp˜oem, com excec¸˜ao dos ´atomos de hidrogˆenios quando a estrutura ´e resolvida por cristalografia de raios X;
d. Verificac¸˜ao por res´ıduos desconhecidos: Efetua-se uma busca por res´ıduos des- conhecidos tanto no campo SEQRES quanto no campo ATOM do arquivo PDB. Qualquer res´ıduo diferente daqueles encontrados na Figura 4 ´e assumido ser um res´ıduo desconhecido.
e. Verificac¸˜ao por ´atomos duplicados: Durante a determinac¸˜ao da estrutura 3D das prote´ınas podem surgir d´uvidas em relac¸˜ao `a posic¸˜ao de alguns ´atomos. Neste caso, um mesmo ´atomo ´e inserido mais de uma vez no arquivo PDB. Apenas a primeira ocorrˆencia de um ´atomo duplicado ´e considerada para a realizac¸˜ao dos c´alculos. f. Relat´orio de erros ou mensagens de avisos para o usu´ario: Durante todos os
processos descritos acima, a aplicac¸˜ao registra os erros encontrados na estrutura, os quais s˜ao exibidos ao usu´ario na forma de aviso (warning found) ou erro (error
found). Posteriormente os resultados da checagem s˜ao armazenados no banco de dados evitando dessa forma que a mesma estrutura seja checada v´arias vezes. Tal relat´orio ´e fornecido ao usu´ario.
Tais an´alises visam permitir o controle da qualidade das contas posteriores com essa estrutura. A Figura 41 mostra a tela da ferramenta “Clean PDB”, onde o usu´ario informa o c´odigo PDB da prote´ına que ser´a analisada.
A Figura 42 exibe um exemplo de um arquivo no formato PDB, ap´os ser processado pela ferramenta Clean PDB. Note que foram inseridos novos campos REMARK (no in´ıcio do arquivo), onde s˜ao informados ao usu´ario os detalhes sobre a checagem de consistˆencia da estrutura por ele escolhida.
Figura 42: Exemplo de um arquivo no formato PDB ap´os ser processado pela ferramenta “Clean PDB”.
6.1.5.6 Ordenac¸˜ao de prote´ınas (Protein ranking)
Nesta ferramenta o usu´ario poder´a classificar um conjunto de prote´ınas de acordo com o pI (ponto isoel´etrico) de cada uma. O usu´ario dever´a submeter ao sistema (upload) um arquivo texto com os c´odigos PDB’s das prote´ınas e/ou complexos de prote´ınas que ele gostaria de ordenar. A ordenac¸˜ao ´e realizada utilizando o n´ıvel de predic¸˜ao ideal e, portanto, o usu´ario dever´a informar ao sistema qual tabela para valores de pKa’s experimentais dever´a ser utilizada para a realizac¸˜ao dos c´alculos. Como resposta, o sistema exibe para o usu´ario, as prote´ınas solicitadas ordenadas pelo seu pI. A Figura 43 exemplifica uma tela de classificac¸˜ao.
O usu´ario tem a opc¸˜ao de analisar as curvas de titulac¸˜ao e capacitˆancia, no n´ıvel de predic¸˜ao ideal, de cada prote´ına (clicando nos links correspondentes), assim como salvar o ar- quivo no formato PDB gerado pelo PROMETHEUS (clicando no c´odigo PDB da prote´ına). Al´em da classificac¸˜ao das prote´ınas, o sistema permite calcular a predic¸˜ao (no n´ıvel ideal) do complexo prot´eico entre duas prote´ınas. Para tal, o usu´ario dever´a selecionar duas prote´ınas e escolher em quais condic¸˜oes experimentais os c´alculos ser˜ao realizados. A Figura 44 mos- tra a tela onde o usu´ario poder´a selecionar as prote´ınas e definir as condic¸˜oes experimentais (pH, concentrac¸˜ao de sal na soluc¸˜ao, etc.) para a predic¸˜ao da complexac¸˜ao. Clicando em “Build protein-protein interaction” o sistema realiza a predic¸˜ao entre as prote´ınas escolhidas pelo usu´ario. Se o usu´ario desejar fazer uma combinac¸˜ao entre todas as prote´ınas, para poder analisar dentre as prote´ınas escolhidas, quais s˜ao as mais favor´aveis para a formac¸˜ao de um complexo prot´eico, ele poder´a clicar na opc¸˜ao “All-all protein interaction”.
Figura 43: Tela inicial para ordenac¸˜ao de prote´ınas e/ou complexos de prote´ınas pelo pI.
A Figura 45 apresenta as curvas do ∆Gele e B
23, entre todas as prote´ınas informadas pelo usu´ario para execuc¸˜ao da ferramenta “All-all protein interaction”7. Os gr´aficos de cada interac¸˜ao podem ser ampliados, conforme exibidos pelas Figuras 46 e 47, as quais mostram, respectivamente, os gr´aficos ampliados do ∆Gelee B2(anal´ıtico) entre duas prote´ınas calbindi- nas (PDB: 3ICB).
7Neste exemplo, informamos `a ferramenta as prote´ınas calbindina (3ICB), β -lactoglobulina (1BEB) e o
Figura 44: Tela para entrada dos parˆametros f´ısico-qu´ımicos utilizados para a predic¸˜ao da complexac¸˜ao entre duas prote´ınas.
Figura 46: ∆Geleentre duas prote´ınas calbindinas (PDB: 3ICB).