Interação prote´ına–prote´ına - propriedades eletrostáticas das prote´ınas

propriedades eletrost´aticas das prote´ınas

7.2 Interac¸˜ao prote´ına–prote´ına

O estudo do fenômeno da complexação protéica foi efetuado com base na análise da variação da energia livre eletrostática - ∆Gele e do segundo coeficiente cruzado de virial - B23. Quando ∆Gele é menor que zero, o processo é expontâneo, indicando assim que a reação é favorável à formação de complexos protéicos. Por outro lado, valores positivos para ∆Gele não favorecem a formação de complexos protéicos e, quando ∆Gele= 0, o sistema está em equil´ıbrio. O ∆Gele é uma medida que depende das condições f´ısico-qu´ımicas do meio e das propriedades das prote´ınas, as quais destacamos a valência e capacitância. A importância da capacitância está demonstrada na Subseção - 7.2.1.

O B23 é um critério termodinâmico utilizado para quantificar as interações que ocorrem entre duas moléculas, assim, quando B23 é negativo há atração entre as prote´ınas, se positivo, repulsão.

As Figuras 73 e 74 exibem, respectivamente, o ∆Gele_{(em k}

BT) em função da distância de separação r (em ˚Angström) e o B23 (em mol.ml/g2) em função do pH, do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC). Nestes exemplos, comparamos o efeito da incorporação do mecanismo de regulação de cargas na predição do complexo protéico. O pH foi fixado em 8,0 e força iônica igual a 0,01M.

Figura 73: Comparac¸˜ao do ∆Gele_{do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), com e sem o mecanismo de}

Figura 74: Comparac¸˜ao do B23, do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), com e sem o mecanismo de

regulação de cargas em força iônica igual a 0,01M.

∆Gele (Figura 73) apresenta valores negativos, os quais indicam que o processo é fa- vorável à formação do complexo prote´ıco. Note que, a incorporação do mecanismo de regulação de cargas, aumenta a atração entre as prote´ınas. O mesmo comportamento pode ser observado no B23 (Figura 74), o qual apresenta valores negativos entre os pH’s 4,5 e 7,5, indicando assim atração entre as prote´ınas nesta faixa de pH, também conhecida como janela de complexação ou cristalização. Para efetuar estas análises procedemos da seguinte forma:

1. O complexo hirundina–trombina ´e representado no arquivo no formato PDB por 3 cadeias - L, H e I, onde as cadeias L e H representam a subunidade pequena e grande do po- lipept´ıdeo trombina e a cadeia I representa a hirundina. Utilizando a ferramenta split

protein, apresentada na Subseção 6.1.5 – Ferramentas auxiliares desenvolvidas, separa- mos o complexo 4HTC em dois arquivos distintos, no formato PDB. Um arquivo con- tendo as informações a respeito das estruturas L e H e outro da estrutura I.

2. Em seguida efetuamos a predição das propriedades eletrostáticas das duas moléculas iso- ladas representadas pelos arquivos PDB gerados. As Figuras 75 e 76 exibem a curva de titulação e capacitância para cada subunidade deste complexo. Neste exemplo, os cálculos foram realizados no n´ıvel de predição anal´ıtico, para o qual foi utilizado a tabela com valores de pKa’s de Nozaki and Tanford (2) para obtenção dos valores dos pKa’s.

Note que, na Figura 75, entre os pH’s 4,5 e 8,5 as prote´ınas possuem cargas com sinais opostos, indicando assim atração entre as mesmas, o que possibilita a formação do complexo

Figura 75: Curva de titulação do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), separado em duas prote´ına, em força iônica nula.

Figura 76: Curva da capacitância em função do pH, do complexo hirundina–trombina (PDB: 4HTC), separado em duas prote´ına, em força iônica nula.

Figura 77: Curvas de titulação de cada prote´ına que forma o complexo protético tripsina–inibidor (PDB: 2PTC).

protéico nestas condições f´ısico-qu´ımicas. A atração é intensificada pela incorporação do mecanismo de regulação de cargas, cuja capacitância é apresentada na Figura 76.

O próximo exemplo ilustra a predição da titulação e capacitância, do complexo protéico tripsina–inibidor (PDB: 2PTC), o qual é dado por duas cadeias: E (tripsina) e I (ini- bidor de tripsina). Assim como no exemplo anterior, utilizando a ferramenta “split protein”, separamos cada cadeia presente no arquivo PDB, criando dois novos arquivos no formato PDB, um contendo somente a estrutura referente à cadeia E e outro com a estrutura da cadeia I. As Figuras 77 e 78 exibem a titulação e a capacitância de cada cadeia individualmente.

Observe na Figura 77 que, entre os pH’s 9,3 e 10,2 as prote´ınas possuem cargas com sinais opostos, indicando assim atração eletrostática entre as prote´ınas nesta faixa de pH. Em relação à capacitância, esta possui a maior intensidade no pH 10, o que aumenta a força de atração entre as prote´ınas neste pH.

Após o cálculo das propriedades eletrostáticas, efetuamos a análise da variação da energia livre eletrostática do complexo tripsina–inibidor. A Figura 79 exibe a variação da energia livre eletrostática, a qual apresenta valores negativos, que diminuem em intensidade conforme as prote´ınas são afastadas uma da outra. Tal comportamento (∆Gele< 0) indica que o processo é espontâneo e, portanto a complexação é favorável. Neste exemplo incorporamos o mecanismo de regulação de cargas, fixamos o pH em 10 e força iônica nula.

Analisando o B23, do complexo 2PTC, verificamos que este possui valores negativos entre os pH’s 9,3 e 10,1, ou seja, neste intervalo de pH ocorre a formação de complexos entre as prote´ınas informadas ao sistema. A literatura nos mostra que a formação do complexo

Figura 78: Curvas da capacitˆancia de cada prote´ına que forma o complexo prot´etico tripsina–inibidor (PDB: 2PTC).

Figura 79: ∆Gele_{formando o complexo prot´eico tripsina–inibidor (PDB: 2PTC). O pH foi fixado em 10 e forc¸a}

Figura 80: B23formando o complexo prot´eico tripsina–inibidor (PDB: 2PTC). pH experimental:10 (16, 17).

2PTC ocorre no pH 10,0 (16, 17). Apesar de simplificados, os cálculos realizados no n´ıvel de predição ideal (anal´ıtico) são capazes de prever se haverá ou não a formação de um complexo protéico, inclusive informando ao usuário, em quais condições (pH, força iônica do meio, etc.) a complexação é mais favorável.

O próximo exemplo ilustra a formação de um complexo anticorpo (lisozima) – ant´ıgeno (HyHEL-10 Fab), código PDB: 3HFM. As Figuras 81 e 82 ilustram, respectivamente, o ∆Gele e o B23. Nestes dois cálculos efetuamos a comparação dos resultados com e sem o mecanismo de regulação de cargas. O pH escolhido para a realização desde cálculo foi 10,6, ponto isoelétrico da prote´ına lisozima determinado neste n´ıvel de predição (anal´ıtico) e força iônica igual a 0,01M.

Observamos, na Figura 81, que a incorporação do mecanismo de regulação de cargas, aumenta (em intensidade) a energia de atração entre as prote´ınas particularmente próximo ao

pI. Pelo fato de uma das prote´ınas presentes no complexo possuir carga muito pequena neste pH (10,6)30, ∆Gele aproxima–se de zero. Com o mecanismo de regulação de cargas, ∆Gele, é levemente intensificada, proporcionando a formação do complexo protéico. Considerando apenas a variação da energia livre eletrostática e as condições f´ısico–qu´ımicas apresentadas, a carga das prote´ınas deixa de ser o único fator para a complexação, uma vez que a energia de interação entre elas é muito pequena, e a capacitância das prote´ınas passa a contribuir mais significativamente para a formação do complexo protéico.

Na Figura 82, valores negativos do B23, indicam atrac¸˜ao entre as prote´ınas. Note que, a

Figura 81: Comparac¸˜ao do ∆Gele_{do complexo HyHEL-10 Fab–lisozima (PDB: 3HFM), com e sem o}

mecanismo de regulação de cargas. O pH e a força iônica foram fixados 10,6 e 0,01M, respectivamente.

Figura 82: Comparac¸˜ao do B23, do complexo HyHEL-10 Fab–lisozima (PDB: 3HFM), com e sem o mecanismo

Figura 83: B23do complexo tripsina–inibidor (PDB: 2PTC), com o mecanismo de regulac¸˜ao de cargas, em

vários regimes de força iônica.

incorporação do mecanismo de regulação de cargas aumenta um pouco a atração das prote´ınas. A janela de complexação é expandida de 7,2-10,3 para 7,2-10,5.

Visando demonstrar o efeito da força iônica na predição na predição de complexos protéicos, através das análises do ∆Gele e B23, ilustramos na Figura 83 o cálculo do B23, do complexo tripsina–inibidor (PDB: 2PTC), em vários regimes de força iônica. Conforme au- menta a concentração de sal, B23 aproxima-se de zero, como esperado. Íons de sal dissociados em solução reduzem a energia de interação entre as prote´ınas. Quanto maior a concentração de sal presente na solução maior o efeito da blindagem eletrostática. As interações eletrostáticas que ocorrem entre os aminoácidos que compõem a prote´ına também são afetadas pela força iônica. A blindagem eletrostática produzida pela força iônica leva a uma diminuição da energia livre eletrostática e, conseqüêntemente do B23, uma vez que este é uma função de ∆Gele.

O próximo exemplo ilustra a formação de um complexo constitu´ıdo por duas prote´ınas lisozima (PDB: 2LZT). A Figura 84 exibe a variação da energia livre eletrostática com e sem o mecanismo de regulação de cargas, no n´ıvel de predição anal´ıtico em força iônica nula e 0,01M. Fixamos o pH em 10,6, próximo ao pI da prote´ına, quando utilizando este n´ıvel de predição.

Devido o aumento da força iônica no meio, o efeito da blindagem eletrostática por meio da dissociação de ´ıons na solução, diminui a intensidade das interações eletrostáticas que ocorrem entre as prote´ınas que formam o complexo. Por outro lado, a incorporação do mecanismo de regulação de cargas proporcionou um aumento na atração entre as prote´ınas, uma vez que, ∆Gele< 0.

Figura 84: ∆Gele_{do complexo formado por duas lisozimas (PDB: 2LZT) com e sem o mecanismo de regulac¸˜ao}

de cargas, em força iônica nula e 0,01M. O pH, a temperatura e a constante dielétrica do solvente foram fixados em 10,6, 298,15 K e 78,5, respectivamente.

A Figura 85 mostra a comparação do ∆Gelepara a formação de um complexo protéico constituido por duas lisozimas (PDB: 2LZT), nos n´ıveis de predição anal´ıtico e PB. Neste exemplo, fixamos a concentração de sal em 0,01M, a temperatura em 298K e o pH em 10,6 para os cálculos anal´ıticos e 11,2 para os cálculos utilizando as estruturas 3D das prote´ınas31. A constante dielétrica das prote´ınas e do solvente foi parametrizada em 40 e 80, respectivamente. Utilizamos o campo de força GROMOS96 para calcular os pKa’s dos aminoácidos ionizáveis em função de sua posição na estrutura da prote´ına.

E importante salientar que, como as prote´ınas são iguais, estas possuem a mesma carga em função do pH. Sendo assim, considerando somente as interações Coulombicas as prote´ınas sempre irão apresentar um comportamento repulsivo, independente do pH do meio o qual as prote´ınas estão inseridas. Com a incorporação do mecanismo de regulação de cargas, observa- mos uma poss´ıvel atração entre as prote´ınas, uma vez que, ∆Gele< 0.

O emprego das estruturas 3D das prote´ınas proporcionou uma redução na intensidade das interações, embora seu comportamento seja qualitativamente semelhante ao do cálculo anal´ıtico. Geralmente, nos cálculos anal´ıticos, a predição da titulação e capacitância das prote´ınas é superestimada. Conseqüêntemente, há também uma superestiva das demais grande- zas que são função destas propriedades, como por exemplo, ∆Gele_{e os coeficientes de virial.}

31_{Optamos por efetuar as comparações em dois pHs distintos pois, quando predizemos a curva de titulação da}

lisozima utilizando somente a seqüência primária de aminoácidos, esta tem seu pI em 10,6, enquanto que, nos cálculos utilizando a estrutura 3D, esta prote´ına tem pI em 11,2. Assim podemos demonstrar para os dois n´ıveis de predição (anal´ıtico e PB), a importância do mecanismo de regulação de cargas.

Figura 85: ∆Gele_{, nos n´ıveis de predic¸˜ao anal´ıtico e Poisson-Boltzmann, do complexo formado por duas}

lisozimas (PDB: 2LZT) com e sem o mecanismo de regulação de cargas em força iônica igual a 0,01M. A temperatura, a constante dielétrica da prote´ına e a constante dielétrica do solvente foram fixadas em 298 K, 40 e

80, respectivamente. O pH foi mantido constante em 10,6 para os cálculos anal´ıticos e 11,2 para os cálculos utilizando PB. Campo de força: GROMOS96.

Para avaliar o efeito da força iônica, realizamos o cálculo do B2, no n´ıvel de predição anal´ıtico, em várias concentrações de sal. Esta análise é exibida na Figura 86.

B2diminui, em intensidade, conforme aumenta a concentração de sal na solução, uma vez que o sal blinda as interações eletrostáticas, fazendo com que ∆Gelese aproxime de 0 (zero). Para o pH em torno de 10,6, B2apresenta valores próximos de zero. Isso se deve ao fato de que, pelos cálculos anal´ıticos, 10,6 é o ponto isoelétrico da lisozima. Neste ponto não seria poss´ıvel a complexação, visto que a carga total das duas prote´ınas é nula. Por outro lado, com o mecanismo de regulação de cargas, há uma ligeira atração e B2 é negativo (−2,4x10−3mol.ml/g2) em força iônica nula.

As Figuras 87 e 88 exibem a comparação do B2, provido pelo PROMETHEUS, nos n´ıveis de predição anal´ıtico e PB32, com medidas experimentais33 e outras previsões teóricas34, para a lisozima, em força iônica iguais a 0,005M e 0,1M.

32_{Os critérios definidos para a configuração dos arquivos auxiliares (.sites, .st, etc.) de acordo com cada campo}

de força (GROMOS96 e AMBER99), para a posterior execução dos programas pertencentes ao pacote MEAD estão definidos nos Apêndices C e D.

33_{Dados experimentais obtidos da referˆencia (18).}

Figura 86: B2de complexação entre duas lisozimas (PDB: 2LZT), com o mecanismo de regulação de cargas, em

vários regimes de força iônica.

Figura 87: Comparação do B2de complexação entre duas lisozimas (PDB: 2LZT), nos n´ıveis de predição

anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,005M. Nos cálculos por PB,εpfoi definido como igual a 40. Os campos de força

estão citados nas legendas das curvas do próprio gráfico. Os dados experimentais foram obtidos da referência (18).

Figura 88: Comparação do B2de complexação entre duas lisozimas (PDB: 2LZT), nos n´ıveis de predição

anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,1M. Nos cálculos por PB,εpfoi definido como igual a 40. Os campos de força

estão citados nas legendas das curvas do próprio gráfico. Os dados experimentais foram obtidos da referência (18).

Note que, comparados com os dados experimentais e predições teóricas por simulações Monte Carlo35, em baixa força iônica (Figura 87), a precisão dos resultados aumenta quando passamos do n´ıvel anal´ıtico para o n´ıvel PB, assim como o custo computacional, de N para 2N. Ao redor do pI (10,6 – 11,2), há boas concordâncias entre os dados experimentais e os preditos utilizando os dois n´ıveis de predição (anal´ıtico e Poisson-Boltzmann), proporcionando desta forma a utilização da seqüência primária da prote´ına, como fonte inicial de informação para o estudo das propriedades eletrostáticas de prote´ınas e predição de complexos protéicos com um baixo custo computacional. Para um estudo mais detelhado em outros regimes de pHs, os cálculos com as estruturas 3D das prote´ınas apresentaram resultados equivalentes aos da simulação pelo método Monte Carlo, com a vantagem de possuir um menor custo computacional em relação ao MC. Além disso, é poss´ıvel incorporar outras interações f´ısicas em todos os n´ıveis, tornando as previsões mais realistas.

Com o aumento da força iônica do meio (Figura 88), o B2 predito analiticamente se aproxima do obtido com base nas estruturas 3D das prote´ınas. Este comportamento é devido à blindagem eletrostática ocasionada pelos ´ıons do sal dissociados na solução. Uma vez que, a energia de interação (∆Gele) é calculada com base nas propriedades eletrostáticas das prote´ınas,

35_{Em simulações computacionais utilizando o método Monte Carlo, o sistema teórico aproxima–se do sistema}

experimental, através da incorporação de ´ıons explicitos na solução e mudanças conformacionais nas prote´ınas duante a fase de cálculos. Além disso, outras interações f´ısicas são computadas, como por exemplo, interações de

Figura 89: Comparação do B2de complexação entre dois quimotripsinogênios (PDB: 1CHG), nos n´ıveis de

predição anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,005M. Nos cálculos por PB,εpfoi definido como igual a 40. As cargas

foram definidas de acordo com o campo de forc¸a AMBER99. Os dados experimentais foram obtidos da referˆencia (18).

esta se aproxima de zero em altos regimes de força iônica, independente do n´ıvel de predição (anal´ıtico ou PB). Conseqüêntemente B2se aproxima de zero em altas concentrações de sal, já que este é uma função de ∆Gele.

As Figuras 89 e 90 apresentam a comparação entre o B2predito pelo PROMETHEUS e por outras previsões teóricas36 e medidas experimentais37 de um complexo protéico formado por duas prote´ınas quimotripsinogênio (PDB: 1CHG).

Assim como no exemplo anterior (Figuras 87 e 88) há um aumento da precisão dos resultados quando partimos do n´ıvel anal´ıtico para o n´ıvel PB. Em ambas as comparações, a força iônica foi fixada em 0,005M e 0,01M, as predições realizadas com base nas estruturas 3D das prote´ınas são bastante semelhantes às obtidas por simulação MC. Tal fato demonstra que, apesar da simplificação do modelo, as predições utilizando PB são tão precisas quanto às utilizando MC, além de apresentarem um baixo custo computacional em relação ao MC.

Embora os cálculos realizados com a estrutura 3D da prote´ına melhorem a precisão dos resultados, em relação ao cálculos utilizando somente a seqüência primária da prote´ına, pelas aproximações assumidas em nossos modelos, não é poss´ıvel afirmar que as prote´ınas formarão um complexo protéico, uma vez que B2possui sempre valores maiores ou igual a zero em altas concentrações de sal. Podemos sugerir apenas que, em baixa força iônica, o segundo coeficiente

36_{Dados das simulações computacionais pelo método Monte Carlo, obtidos das referências (15) e (18).} 37_{Dados experimentais obtidos da referência (18).}

Figura 90: Comparação do B2de complexação entre dois quimotripsinogênios (PDB: 1CHG), nos n´ıveis de

predição anal´ıtico e PB, com o mecanismo de regulação de cargas, com medidas experimentais e outras previsões teóricas. A força iônica foi fixada em 0,01M e 0,005. Nos cálculos por PB,εpfoi definido como igual a 40. As

cargas foram definidas de acordo com o campo forc¸a AMBER99. Os dados experimentais foram obtidos da referˆencia (18).

de virial indica a poss´ıvel formação de um complexo protéico, em um intervalo de pH (janela de cristalização ou complexação), geralmente ao redor do pI das prote´ınas.

No futuro, a incorporação de outras interações (por exemplo, van der Waals) melho- rará as previsões aqui apresentadas. Moon et al. (98), exibe a formação de complexos protéicos compostos por duas prote´ınas lisozimas (PDB: 2LZT) em várias condições experimentais. Porém em seu trabalho, outras interações são consideradas, como por exemplo, o potencial de dispersão de Hamaker38. Esta interação não é considerada no preditor PROMETHEUS, pois está fora do escopo desse trabalho. Assim visando apenas demonstrar o efeito deste tipo de interação, exibimos na Figura 91 o B2 com a incorporação da constante de Hamaker, a qual, neste exemplo, foi assumida como igual a 8,0 kT , de acordo com a referência (98), sem parametrização espec´ıfica para o modelo usado pelo PROMETHEUS.

38_{O potencial de dispersão é proporcional à constante de Hamaker, a qual é sempre atrativa entre dois corpos}

similares. A constante de Hamaker é uma função da composição da prote´ına e da natureza qu´ımica do solvente

No documento Análises de propriedades eletrostáticas e estruturais de complexos de proteínas para... (páginas 152-168)