Interac¸˜ao Prote´ına-Prote´ına (Protein-protein interaction)

Essa ´e a ferramenta totalmente desenvolvida por n´os. Aqui, o usu´ario tem acesso aos estudos de formac¸˜ao de complexos entre duas prote´ınas, atrav´es da an´alise do ∆Gele e B23.

Inicialmente, ´e necess´ario definir quais prote´ınas ser˜ao investigadas. Assim, como na ferramenta Single protein properties, o usu´ario tem as opc¸˜oes de informar ao sistema, as prote´ınas que ele deseja analisar (predizer a formac¸˜ao do complexo), de trˆes diferentes manei- ras: I) atrav´es dos c´odigos PDB’s das prote´ınas; II) enviando ao sistema (upload) um arquivo no formato PDB que cont´em a estrutura da prote´ına (neste caso dever´a ser informado um arquivo para cada prote´ına) e III) enviando ao sistema (upload) o arquivo de cada prote´ına no formato FASTA. Os c´alculos s˜ao realizados utilizando os n´ıveis de predic¸˜ao ideal e Poisson-Boltzmann (conforme a escolha do usu´ario), exceto quando usu´ario enviar um ou os dois arquivos no for- mato FASTA. Neste caso, como somente as informac¸˜oes sobre a seq¨uˆencia prim´aria da prote´ına est˜ao presentes, ´e poss´ıvel realizar as an´alises apenas no n´ıvel ideal. A seguir ser˜ao apresen- tadas as diferenc¸as entre os parˆametros de entrada que est˜ao dispon´ıveis ao usu´ario de acordo com o n´ıvel de predic¸˜ao escolhido. A Figura 22 exibe a tela onde o usu´ario informa as prote´ınas para serem analisadas assim como o n´ıvel de predic¸˜ao que ser´a empregado nos c´alculos.

Figura 22: Tela para entrada dos parˆametros iniciais para a realizac¸˜ao dos c´alculos da predic¸˜ao de complexac¸˜ao entre prote´ınas.

6.1.4.1 N´ıvel de predic¸˜ao ideal (anal´ıtico)

Neste n´ıvel de predic¸˜ao o usu´ario dever´a informar, al´em dos c´odigos PDB’s das prote´ınas (ou arquivos no formato PDB/FASTA), o pH, a tabela de referˆencia para os valo- res experimentais dos pKa’s dos amino´acidos isolados, a concentrac¸˜ao de sal, o peso molecular, o raio, a valˆencia dos ´ıons presentes na soluc¸˜ao, e por fim, dever´a informar se o mecanismo de regulac¸˜ao de cargas ser´a utilizado ou n˜ao. Com base na seq¨uˆencia prim´aria de amino´acidos, o sistema calcula e sugere o raio e o peso molecular de cada prote´ına, os quais podem ser alte- rados a crit´erio do usu´ario. Os resultados s˜ao gerados diretamente atrav´es da atribuic¸˜ao destes valores nas express˜oes descritas na Sec¸˜ao 5.1.4.

A Figura 23 exibe a tela para configurac¸˜ao dos parˆametros que ser˜ao utilizados para realizac¸˜ao dos c´alculos envolvidos na predic¸˜ao de complexos prot´eicos, no n´ıvel de predic¸˜ao ideal.

O sistema exibe como resposta o gr´afico do ∆Gele(em kBT) em func¸˜ao da distˆancia de separac¸˜ao (em ˚Angstr¨om) entre as duas prote´ınas e o gr´afico do B23em func¸˜ao do pH. A Figura 24 exemplifica o processamento para as prote´ınas tirosina kinase (PDB: 1LCJ) e lisozima (PDB: 2LZT) no pH 10,4 com o mecanismo de regulac¸˜ao de cargas e forc¸a iˆonica nula. Clicando em cada gr´afico, o usu´ario tem a opc¸˜ao de ampli´a-los, assim como salvar os arquivos que contˆem as coordenadas utilizadas para a construc¸˜ao dos mesmos.

A Figuras 25 e 26 apresentam, respectivamente, os gr´aficos ampliados, do ∆Gele em func¸˜ao da distˆancia de separac¸˜ao entre as duas prote´ınas e do B23 em func¸˜ao do pH, para as prote´ınas tirosina kinase (PDB: 1LCJ) e lisozima (PDB: 2LZT), nas mesmas condic¸˜oes do exemplo anterior. Clicando no c´odigo PDB de cada prote´ına, o usu´ario tem acesso ao arquivo da estrutura da prote´ına no formato PDB, gerados pelo PROMETHEUS, acrescido de informac¸˜oes a respeito do teste de consistˆencia.

Figura 23: Tela para entrada dos parˆametros f´ısico-qu´ımicos para predic¸˜ao de complexos prot´eicos, no n´ıvel de predic¸˜ao ideal (anal´ıtico).

Figura 24: Tela para apresentac¸˜ao dos c´alculos anal´ıticos de ∆Gele_{(em unidades de k}

BT) em func¸˜ao da distˆancia

de separac¸˜ao (em ˚Angstr¨om) no pH 10,4 e do B23em func¸˜ao do pH, em forc¸a iˆonica nula, para a complexac¸˜ao

Figura 25: ∆Gele_{(anal´ıtico), no pH 10,4 e forc¸a iˆonica nula, para a complexac¸˜ao entre as prote´ınas lisozima}

(PDB: 2LZT) e tirosina kinase (PDB: 1LCJ).

Figura 26: B23(anal´ıtico) em func¸˜ao do pH, em forc¸a iˆonica nula, para a complexac¸˜ao entre as prote´ınas

6.1.4.2 N´ıvel de predic¸˜ao baseado na estrutura 3D da prote´ına atrav´es de soluc¸˜oes da EPBL

Neste n´ıvel de predic¸˜ao, ao inv´es de se empregar os valores de pKa’s experimentais dos amino´acidos “isolados” (Tabela 1), calculamos os pKa’s de cada amino´acido ioniz´avel, de acordo com a posic¸˜ao de cada um deles na estrutura tridimensional da prote´ına. Uma vez que o valor do pKade cada amino´acido ´e influenciado pela vizinhanc¸a, ou seja, n˜ao s˜ao os mesmos para todos os amino´acidos de um determinado grupo, este c´alculo proporciona uma melhor precis˜ao ao preditor. O c´alculo dos pKa’s ´e realizado atrav´es da soluc¸˜ao da EPBL pelo pacote MEAD v.2.2.7.

Para utilizar a ferramenta neste n´ıvel de predic¸˜ao, o usu´ario dever´a informar ao sistema, inicialmente, as prote´ınas que ele deseja avaliar. Depois, ´e necess´ario informar os parˆametros para a criac¸˜ao dos arquivos de configurac¸˜ao que ser˜ao utilizados pelo pacote MEAD para o c´alculo dos valores dos pKa’s de cada amino´acido ioniz´avel. A Figura 27 ilustra uma tela t´ıpica para a realizac¸˜ao desta tarefa.

Figura 27: Tela para entrada dos parˆametros que ser˜ao utilizados para a construc¸˜ao dos arquivos de configurac¸˜ao utilizados pelo pacote MEAD para o c´alculo dos pKa’s dos amino´acidos ioniz´aveis.

Figura 28: Tela para definic¸˜ao das condic¸˜oes experimentais das simulac¸˜oes com as estruturas tridimensionais.

Para a criac¸˜ao dos arquivos no formato PQR5, o usu´ario pode utilizar o campo de forc¸a GROMOS96 v.53A6 ou o AMBER99. Na seq¨uˆencia, ´e necess´ario definir as condic¸˜oes experimentais. A Figura 28 ilustra a tela onde o usu´ario define as constantes diel´etricas das prote´ınas e solvente, a concentrac¸˜ao de sal presente na soluc¸˜ao e a temperatura do sistema. Note que a constante diel´etrica de cada prote´ına ´e apenas considerada nos c´alculos dos pKa’s para o fornecimento das valˆencias das prote´ınas isoladas. Na interac¸˜ao prote´ına-prote´ına, empregamos a Equac¸˜ao 5.12, onde o efeito de duas interfaces diel´etricas n˜ao ´e considerado.

Ap´os escolha destes parˆametros ´e necess´ario definir o pH no qual ser˜ao realizados os c´alculos para a predic¸˜ao da complexac¸˜ao. A Figura 29 exibe a tela onde o usu´ario pode

5_{Muitas estruturas prot´eicas dispon´ıveis no PDB n˜ao possuem os ´atomos de hidrogˆenio presentes no arquivo}

no formato PDB. Os campos de forc¸a s˜ao utilizados como referˆencia na tentativa de inserir tais ´atomos na estrutura da prote´ına, dessa forma, a posic¸˜ao de cada ´atomo de hidrogˆenio ´e dependente do campo de forc¸a. Alterac¸˜oes adicionais podem ser realizadas na estrutura da prote´ına no intuito de otimizar as ligac¸˜oes de hidrogˆenio, veja alguns exemplos nas referˆencias (20, 68).

configurar tais parˆametros para a predic¸˜ao da complexac¸˜ao. Nesta mesma tela ´e poss´ıvel salvar todos os arquivos de configurac¸˜ao utilizados pelo pacote MEAD v.2.2.7, assim como o arquivo que cont´em os valores dos pKa’s dos amino´acidos em relac¸˜ao a suas respectivas posic¸˜oes na estrutura da prote´ına.

A Figura 30 apresenta o resultado dos c´alculos para a predic¸˜ao da formac¸˜ao de um complexo prot´eico, no n´ıvel de predic¸˜ao utilizando Poisson-Boltzmann, entre as prote´ınas li- sozima (PDB: 2LZT) e calbindina (PDB: 3ICB). Para o c´alculo da variac¸˜ao da energia livre eletrost´atica, fixamos o pH em 11,1 e concentrac¸˜ao de sal igual a 0,01M. ´E poss´ıvel ampliar cada um dos gr´aficos clicando sobre eles. Os mesmos gr´aficos, j´a ampliados, s˜ao mostrados nas Figuras 31 e 32.

Figura 30: Tela para apresentac¸˜ao do ∆Gele_{, no pH 11,1 em forc¸a iˆonica igual a 0,01M, e do B}

23, para a

Figura 31: ∆Gele_{entre as prote´ınas calbindina (PDB: 3ICB) e lisozima (PDB: 2LZT), em forc¸a iˆonica igual a}

0,01M.