Fluido folicular e seu papel durante a formação das CGPs e oócitos

O fluido folicular serve como uma importante fonte de substâncias regulatórias ou moduladoras derivadas do sangue ou das secreções de células foliculares (BARNETT et al., 2006). Atualmente, a principal hipótese sobre o mecanismo de formação do antro folicular, sugere que as células da granulosa geram um gradiente osmótico ao produzir substâncias de alto peso molecular, como os glicosaminoglicanos e os proteoglicanos, acumulando líquido entre as células (SCHOENFELDER; EINSPANIER, 2003; CLARKE et al., 2006). O gradiente formado atrai fluido derivado dos vasos presentes na teca e induz um relativo movimento das células da granulosa para permitir que o fluido se acumule. Este movimento envolve a remodelação das

junções gap entre as células, ou mesmo a morte de algumas células da granulosa (RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010). Em adição, estudos têm demonstrado que a expressão de proteínas, como as aquaporinas, nas células da granulosa facilitam o transporte de água através das células (McCONNELL et al., 2002; SKOWRONSKI; KWON; NIELSEN, 2009).

O fluido folicular humano contém uma variedade de substâncias bioquímicas transferidas a partir do plasma sanguíneo e segregadas a partir de células da teca e da granulosa (FORTUNE, 1994). Como os oócitos secretam fatores de crescimento parácrinos que regulam o desenvolvimento de células da granulosa, as células da granulosa, por sua vez regulam o crescimento de oócitos durante a formação folicular (GILCHRIST et al., 2004). Desta forma, é evidente que as substâncias bioquímicas das células da granulosa podem desempenhar um papel- chave na formação de células germinativas e desenvolvimento do oócito. Estudos mostram que o fluido folicular contém diversos fatores biativos tais como: GDF-9 (PROCHAZKA et al., 2004; WANG; ROY, 2004), BMP-15 (BERTOLDO et al., 2013) e gonadotrofinas (WANG; ROY, 2004). Vários estudos têm relatado que o fluido folicular suíno promove efetivamente a formação de células germinativas a partir de células-tronco (DYCE; WEN; LI, 2006; CHENG et al., 2012; DYCE et al., 2011). Vários trabalhos (DYCE et al., 2004; DYCE; WEN; LI, 2006; LINHER; DYCE; LI, 2009) mostraram que células-tronco isoladas a partir da pele de fetos suínos tiveram a capacidade de se diferenciar em células semelhantes a oócitos após cultivo em meio contendo fluido folicular. Estas células expressaram marcadores de células germinativas (Dazl e Vasa), e marcadores de oócitos e meiose (Gdf-9 e Oct4) (DYCE; WEN, 2006).

Em suínos, para a indução da diferenciação, as células-tronco isoladas a partir da pele de fetos suínos foram cultivadas por até 42 dias na presença de fluido folicular e, em seguida, observou-se a presença de marcadores específicos de células germinativas, tais como Oct4, Bmp- 15, Dazl e Vasa, comprovando a formação de células germinativas. Logo, estas células formaram estruturas semelhantes a folículos ovarianos secretando estradiol e progesterona, e respondiam ao estímulo de gonadotrofinas (DYCE et al., 2011), e expressavam marcadores de oócitos, como por exemplo, proteínas da zona pelúcida e Scp3 (DYCE et al., 2011).

Um estudo mais detalhado sobre os mecanismos de indução da diferenciação de células germinativas primordiais e estruturas semelhantes a oócitos a partir de células-tronco deu origem ao artigo de revisão que será mostrado a seguir.

3 ARTIGO I

In vitro differentiation of primordial germ cells and oocytes-likes cells from stem cells

(Diferenciação in vitro de celulas germinativas primordiais e células semelhantes à oócitos a partir de células-tronco)

Artigo submetido ao periódico Histology and Histopathology (Qualis B1 – Biotecnologia)

In vitro differentiation of primordial germ cells and oocytes-likes cells from stem cells

José J.N.Costa1; Glaucinete B. Souza1; Maria A.A Soares1; Regislane P. Ribeiro1; Robert van den Hurk2, José R.V. Silva1

1_{Biotechnology Nucleus of Sobral} – NUBIS, Federal University of Ceara, CEP 62042-280, Sobral, CE, Brazil. 2Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht

University, Utrecht, The Netherlands.

*Corresponding address (J. R. V. Silva): Biotechnology Nucleus of Sobral - NUBIS, Federal University of Ceara, Av. Comandante Maurocélio Rocha Ponte 100, CEP: 62.041-040, Sobral,

CE, Brazil. [roberto_viana@yahoo.com]

Abstract

Infertility is the result of failure due to an organic disorder of the reproductive organs, especially their gametes. Recently, much progress has been made on generating germ cells, including oocytes, from various types of stem cells. This review focuses on advances in female germ cell differentiation from different kinds of stem cells, with emphasis on embryonic stem cells, adult stem cells, and induced pluripotent stem cells. The advantages and disadvantages of the derivation of female germ cells from several types of stem cells are also highlighted, as well as the ability of stem cells to generate mature and functional female gametes. This review shows that stem cell therapies have opened new frontiers in medicine, especially in the reproductive area, with the possibility of regenerating fertility.

Keywords: Adult stem cells. Embryonic stem cells. Induced pluripotent stem cells. Primordial germ cells. Oocytes-likes cells

1. Introduction

It has been estimated that human infertility affects approximately 14% of couples (Boivin et al., 2007) and thus, in recent years, new reproductive medicine technologies have been developed to help to reduce this problem. Women are born with a finite complement of eggs and

an ovulated oocyte in a woman has the same age as she. It is known that cellular DNA is not completely invulnerable to the passage of years, the impact of age on oocytes being consistent with its effect on the risk of congenital abnormalities (Balen, 2011). Recently, it was demonstrated that the ovaries contain cells which can be isolated and propagated, and have the characteristics of oogonial stem cells. After reintroduction into the ovary, or in reaggregation models, these primitive cells can form new oocytes and follicles, that can generate healthy offspring (Johnson et al., 2004; White et al., 2012). Stem cell-based strategies for ovarian regeneration and oocyte production have been proposed as future clinical therapies for treating infertility in women (Volarevic et al., 2014). Stem cells are undifferentiated cells that are present in embryonic, fetal, and adult stages of life and give rise to differentiated cells that make up tissues and organs (Volarevic et al., 2014). From literature, it is known that oocyte-like cells expressing different oocyte-specific genes can be developed in vitro from mouse embryonic stem cells (mESCs) (Psathaki et al., 2011) or human embryonic stem cells (hESCs) (Richards et al., 2010; Medrano et al., 2012). In addition, stem cells from human amniotic fluid (Cheng et al., 2012) and from porcine fetal skin (Dyce et al., 2011) were also found to differentiate into oocyte- like structures. Furthermore, human primordial germ cells have been differentiated from induced pluripotent stem cells (iPS) (Panula et al., 2011; Eguizabal et al., 2011). Hayashi et al. (2012) recently proposed that hiPS can potentially be utilized to give rise to de novo oocytes for use in in-vitro fertilization (IVF) clinics, thus allowing sterile women to conceive a child.

In this review, we discuss the advances in our knowledge about the derivation of female differentiated germ cells from several types of stem cells, including ES cells and iPS cells, as well as, the mechanisms of reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells.