Proteínas morfogenéticas ósseas e seu papel durante a formação das CGPs

Os membros da superfamília Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-β), especialmente as BMPs, regulam uma grande variedade de funções celulares nas células-tronco pluripotentes (MISHRA; DERYNCK; MISHRA, 2005; ZHANG; LI, 2005). Os membros destas famílias se ligam especificamente aos seus respectivos complexos receptores, consistindo em subunidades do tipo I e tipo II. Após a ligação do ligante ao receptor do tipo II, este induz a fosforilação do receptor do tipo I, o qual por sua vez, transmite o sinal para moléculas de transdução de sinal intracelular, chamadas receptores ativados ou R-Smads. As BMPs

tipicamente utilizam como transdutores de sinal as R-Smads 1/5/8. A fosforilação mediada por receptores desencadeia a associação dessas R-Smads com um mediador comum ou co-Smad-4, e a subsequente translocação deste complexo fator de transcrição para o núcleo. Adicionalmente, os receptores ativados podem influenciar vias Smad-independente, tais como a via MAPK (Proteína cinase ativada por mitógenos) (TERADA et al., 1999). Para confirmar se as BMPs atuam no processo de diferenciação, Park; Woods; Tilly, (2013) demonstraram que a BMP-4 regula diretamente a diferenciação de células-tronco oogoniais de mamíferos através da via de sinalização das SMADs 1/5/8.

Em camundongos, a formação e a proliferação dos precursores das CGP são dependentes de BMP-2, BMP-4, BMP-8b (LAWSON et al., 1999; DE SOUSA LOPES et al., 2004; YING et al., 2000; YING; ZHAO, 2001). Camundongos mutantes para BMP-4 apresentaram defeitos graves no desenvolvimento das células germinativas, com uma quase completa ausência de CGP, enquanto camundongos knockouts para BMP-7 e BMP-8b demonstraram uma grave redução no número de células germinativas (ZHAO et al., 1996; 2001; YING et al., 2000; ZHAO, 2003). Lawson et al. (1999) utilizando camundongos mutantes para BMP -4 demonstraram que esses animais eram desprovidos de CGP e alantóide. Já em mutantes para Bmp8b foi observada uma redução acentuada no número de células germinativas. Estudos in vitro estabeleceram que as vias de sinalização da BMP-4 e BMP8b atuam sinergicamente (YING; QI; ZHAO, 2001).

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um membro da superfamília BMP, que desempenha um papel crucial na produção de CGPs (PERA; TROUNSON, 2004). Em ratos, esta proteína é produzida pelo endoderma visceral e exerce um importante papel na formação de células germinativas primoridiais positivas para fosfatase alcalina (SAITOU; YAMAJI, 2010). A BMP-2 também é responsável por estimular a expressão de Prdm1 e Prdm14 no epiblasto durante a formação das CGPs (SAITOU; YAMAJI, 2010).

Já foi demonstrado que a BMP-4 aumenta o número de CGP migratórias em culturas de embrião (DUDLEY et al., 2007). Em um trabalho com células-tronco embrionárias, McLaren (1999) mostrou que a BMP-4 foi requerida no ectoderma extraembrionário, mais do que nas células epiblásticas (MCLAREN, 2003). O papel da sinalização das BMP na regulação do comportamento pós-migratório das CGP é menos claro, pois o cultivo de ovários fetais de camundongos com BMP-2 ou BMP-4 reduziu o número de células germinativas em meiose

(ROSS et al., 2003). Além disso, a BMP-4 pode promover a proliferação de CGP pós-migratórias isoladas de camadas alimentadoras cultivadas in vitro (PESCE et al., 2002). Childs et al. (2010) identificaram que a sinalização das BMPs está associada ao desenvolvimento do ovário fetal humano, além disso, a BMP-4 apresenta um papel pró-apoptótico na regulação das CGP pós- migratórias em humanos. A combinação de LIF e BMP-4 ou LIF e BMP-2 induzem um aumento na auto-renovação das células-tronco embrionárias, resultando em populações altamente puras e não diferenciadas após 2 ou 3 passagens (YING et al., 2003).

A BMP-4 atua pela via de sinalização de mensageiros intracelulares (SMADs 1/5) que se ligam a domínios específicos nas células, chamados de Prdm14 e Prdm1. Este mecanismo de ação mostra os caminhos genéticos para a ativação e inibição gênica. Prdm1 é essencial para inibir todos os genes somáticos, podendo também ser importante para a criação de um estado epigenético para a expressão de genes específicos de CGPs. O Pdm14 é também um regulador crítico para a especificação CGPs (YAMAJI et al., 2008). É importante ressaltar que a expressão inicial de Prdm14 em CGPs é independente de Prdm1, mas a sua manutenção e/ou regulação positiva subsequente é estritamente dependente Prdm1. Assim, Prdm1 e Prdm14 são os dois principais reguladores transcricionais para o desenvolvimento da linhagem de células germinativas em ratos.

As BMPs promovem uma melhoria na derivação das CGPs a partir de células-tronco embrionárias de humanos (KEE et al., 2006) e camundongos (YOUNG; DIAS; LOVELAND, 2010). Childs et al. (2010) relataram que a BMP-4 aumenta a expressão de marcadores pré- migratórios (Oct4, Nanog e c-Kit) e pós-migratórios (Dazl e Vasa) em CGPs na diferenciação de células-tronco embrionárias. Por outro lado, o tratamento com BMP-4 diminuiu a expressão Vasa em células-tronco embrionárias humanas após um cultivo longo (21 dias) em culturas em monocamada (TILGNER et al., 2008). VASA é expresso apenas por células germinativas em diferenciação, assim a BMP-4 tem um efeito negativo sobre a derivação de células germinativas derivadas a partir de células-tronco embrionárias humanas, resultando em perda de CGP pós- migratórias em ovários tratados com BMP. A exposição contínua a BMPs pode ser prejudicial para a sobrevivência de células germinativas derivadas de células-tronco embrionárias (CHILDS et al., 2010).

Estudos em murinos e humanos demonstram que as BMPs promovem a diferenciação de células germinativas a partir de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células-

tronco pluripotentes induzidas (iPS) in vitro (KEE et al., 2009; PANULA et al., 2011; WEI et al., 2008). Para determinar se proteínas morfogenéticas ósseas recombinantes humanas (rhBMPs) podem induzir a diferenciação de células germinativas a partir de células-tronco embrionárias, Kee et al. (2006) ao utilizarem a de BMP-4 recombinante humana verificaram que ela aumentou a expressão de marcadores específicos de células germinativas tais como: Vasa, Sycp3. Além disso, BMP-7 e BMP8b associada à BMP-4 demonstraram efeitos sinérgicos na indução de células germinativas. Deste modo, a adição de BMPs na diferenciação de células-tronco embrionárias humanas tem aumentado o percentual de células marcadas positivamente para VASA, bem como a diferenciação de células germinativas humanas (KEE et al., 2006). Shah et al. (2015a,b) demonstraram que a BMP-4 induz a diferenciação de células-tronco embrionárias de búfalos em células germinativas.

O papel das BMPs na especificação de células germinativas foi demonstrado in vitro, Ying et al. (2001) adicionaram BMP-4 e BMP-8b em culturas de epiblastos e foi observada a indução da formação das CGP. Toyooka et al. (2003) ao promoverem o co-cultivo de células produtoras de BMP-4 com células-tronco embrionárias de camundongos, aumentou o número de CGP formadas. Nesse contexto, foi sugerido que as BMPs recombinantes podem induzir diferenciação de células germinativas in vitro, especialmente células-tronco embrionárias de murinos. Xu et al. (2002) indicaram que quando as células-tronco embrionárias humanas foram incubadas com BMP4 recombinante, houve a indução na transcrição de diversos genes relacionados com o desenvolvimento do trofoblasto.