Mecanismos de especificação das CGPs

A origem exata da linhagem de células germinativas e o mecanismo de especificação das CGP são ainda indefinidos, especialmente devido à ausência de marcadores específicos que retratem os primeiros processos de especificação destas células (SAITOU; YAMAJI, 2010). Entretanto, sabe-se que as CGP precursoras são formadas sob o controle de sinais oriundos das células vizinhas, tais como as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), -2, -4, e -8 (Figura 3) (HUMMITZSCH et al., 2015). A análise da expressão gênica da população de CGP fundadoras com E7,25 identificou dois genes, F ragilis e Stella, que são altamente e especificamente expressos em CGP, respectivamente (SAITOU; BARTON; SURANI, 2002). F ragilis (Mouse interferon-induced protein like gene-1, mil-1 ou ainda conhecido como interferon-induced transmembrane protein 3, Ifitm3) (TANAKA; MATSUI, 2002) é um membro das proteínas transmembranares induzíveis pelo interferon. Enquanto que Stella (também conhecido como

primordial germ cell 7, Pgc7, ou ainda conhecido como Developmental pluripotency-associated 3, Dppa3) (SATO et al., 2002) é uma pequena proteína que se transloca do citoplasma ao núcleo e ainda na direção oposta. F ragilis começa a ser expresso nas células no epiblasto proximal, com ~E6,25-E6,5, e sua expressão se intensifica no mesoderma extra-embrionário posterior. Já a expressão de Stella começa especificamente nas células que já estão expressando Fragilis no mesoderma extra-embrionário (~E7,0-E7,25), e continua a ser expressa na migração das CGP. Em aproximadamente E7, pequenos grupos de CGP, que são estabilizados por E-caderina, foram localizados posterior à linha primitiva no mesoderma extra-embrionário (HUMMITZSCH et al., 2015).

As células Stella-positivas mostram uma elevada expressão de fosfatase alcalina tecido não específica (Tnap), um gene para a atividade AP em CGP (MACGREGOR; ZAMBROWICZ; SORIANO,1995). As células com expressão positiva para Stella e altos níveis de RNAm para Fragilis reprimem a expressão de genes Homeobox tais como Hoxb1, Hoxa1, Evx1 e VL1, enquanto que as células Fragilis-positivas, mas Stella-negativas mantém a expressão de genes Hox (SAITOU; BARTON; SURANI, 2002). Saitou et al. (2002) propuseram que as células Stella-positivas e Homeobox-negativas são importantes para o estabelecimento das CGP. Além disso, estudos revelaram que nem Fragilis e nem Stella são genes essenciais para a especificação das CGP (PAYER et al., 2003; LANGE et al., 2008).

Essa variação na expressão dos genes Homeobox é importante, uma vez que o papel desses genes é especificar a identidade das células ao longo do eixo do corpo ou induzir a diferenciação das células para linhagens celulares somáticas específicas. Isto sugere que as células germinativas fundadoras adquirem a capacidade de evitar a especificação somática, prevenindo ou suprimindo a expressão dos genes Homeobox. Esta poderia ser uma das principais características que as células germinativas de mamíferos possuem e lhes permite manter ou recuperar a totipotência (NIKOLIC et al., 2016). Este conceito é apoiado pela expressão continuada de Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4, também conhecido por Pou5f1), e outros genes de pluripotência em células germinativas (YEOM et al., 1996). O gene Oct4 é considerado um gene chave para pluripotência (NIWA, 2007), além de ser usado como um marcador específico para a linhagem de células germinativas, apenas após ~E7,75 (YEOM et al., 1996).

A análise do transcriptoma das CGP levou à identificação de dois genes reguladores chave para a especificação das CGP, Blimp1 (B lymphocyte-induced maturation protein-1, também conhecido como PR domain zinc finger protein 1 ou ainda PR domain containing 1, [Prdm1]) e Prdm14 (PR domain zinc finger protein 14 ou ainda PR domain containing 14) (OHINATA et al., 2005; VINCENT et al., 2005; YABUTA et al., 2006; KURIMOTO et al., 2008; YAMAJI et al., 2008). Ainda para a especificação de CGP em mamíferos, a expressão do gene Tcfap2c (também conhecido como AP2g) é necessária (WEBER et al., 2010). Todos os precursores de CGP Blimp1-positivas inicialmente expressam os genes Hox e reprimem Sox2 (YABUTA et al., 2006; KURIMOTO et al., 2008). No entanto, a partir E6.75, as células Blimp1- positivas começam a reprimir os genes Hox e expressam Sox2, Stella, e Nanog (YAMAGUCHI et al., 2005; KURIMOTO et al., 2008). As células Blimp1-positivas continuam a expressar Oct4, que regula o aumento da expressão de cerca de 500 genes de “especificação de células germinativas” e reduz a expressão de cerca de 330 genes “somáticos” (KURIMOTO et al., 2008).

Figura 3 - Especificação da linhagem germinativa e eventos moleculares.

Durante o desenvolvimento embrionário in vivo, como resultado da estimulação por BMP-4, BMP-2 e BMP-8b, um subconjunto de células do epiblasto começa a expressar os genes Fragilis e Blimp1 e tornam-se CGP que migram em

direção ao cume gonadal, onde proliferam. Durante a migração destas células, há a expressão de genes como Stella e

c-Kit e iniciam a colonização do cume gonadal. Neste momento, as CGP expressam os marcadores pré-meióticos

Dazl e Vasa. As proteínas SCP1, SCP2 e SCP3 são específicas de células germinativas em meiose, assim como o gene Dmc1. Nas fêmeas, as células germinativas entram em meiose e param na prófase I. As células germinativas masculinas não entram em meiose, apenas após o nascimento. Os marcadores pós-meióticos GDF -9 e TEKT1 são específicos de gametas haplóides maduros. Fonte: adaptado de Marques-Mari (2009).

2.2.1.1 Sinalização da especificação das CGPs

Por volta de 5,5 dias de desenvolvimento embrionário em camundongos, as células do epiblasto adquirem competência para responder a BMP-4 pelas atividades de NODAL e WNT3. Por outro lado, a sinalização NODAL mediada por SMAD2/FOXH1 específica de células da endoderme visceral distal, começam a fornecer sinais agonistas. Sinais do ectoderma extraembrionário, incluindo BMP8b, aparentemente previne o endoderma visceral proximal de diferenciar-se em endoderme visceral distal, restringindo assim, a atividade anti-agonista. Por volta dos dias 6,0-6,25, a endoderme visceral distal move-se para formar endoderme visceral anterior, e um subconjunto de células do epiblasto recebem altos níveis de sinais da BMP-4 a partir do ectoderma extraembrionário, os quais são especificados e iniciam a síntese de PRDM1 e PRDM14, que são marcadores positivos de CGPs (Figura 4). Desta forma, estes dois fatores têm sido utilizados para induzir a especificação de CGPs a partir de células-tronco embrionárias.

As BMP-4 e BMP-8b induzem a formação de CGPs na região do epiblasto do disco embrionário (Figura 4, YING; ZHAO, 2001; GÜNESDOGAN; MAGNÚSDÓTTIR; SURANI, 2014). As CGP parecem requerer as proteínas BMP4 ou BMP8b sozinhas ou em combinação. A proteína BMP-4 secretada a partir do ectoderma extra-embrionário (ExE) ativa a a expressão de Blimp1 e Prdm14 de maneira dose-dependente. BMP-2 expresso no endoderma visceral proximal aumenta a via de sinalização, assegurando níveis mais elevados de sinalização de BMP no epiblasto mais proximal (LAWSON et al., 1999; OHINATA et al., 2005; VINCENT et al., 2005). Nesse contexto, foi observado que individuos mutantes para os genes Bmp4, Bmp8b, Bmp2, Smad1, Smad4, Smad5, e Alk2 apresentaram uma redução ou ausência de CGPs AP- positivas (ZHAO, 2003; SAITOU; YAMAJI, 2010). Ainda não se sabe se as Smads ativam a transcrição de Blimp1 e Prdm14 direta ou indiretamente (OHINATA et al., 2009). Baseados nesses achados foi proposta uma via de sinalização para a especificação das CGPs, com base na influência da expressão de Blimp1 e Prdm14 no epiblasto (Figura 5) (OHINATA et al., 2009).

Figura 4 – Representação esquemática do papel da sinalização das BMPs e WNT durante a formação das células germinativas primordiais (CGPs) em embriões.

A BMP-4 produzida no ectoderma extraembrionário e BMP-2 produzida a partir do endoderma visceral induz a fosforilação de SMAD1 e SMAD5, que formam um complexo com SMAD4. Este complexo transloca-se para o núcleo e liga-se, presumivelmente, a reguladores e promotores de genes que são necessários para estabelecimento do destino das CGP. Além disso, a sinalização das BMPs resulta na ativação direta ou indireta da WNT3, que também é necessária para induzir o destino das CGP. DVE, endoderme visceral distal; ectoderma extraembrionário (ExE), endoderme visceral (VE); endoderme visceral distal (DVE); endoderme visceral anterior (AVE). Fonte: adaptado de YING; ZHAO, 2001; GÜNESDOGAN; MAGNÚSDÓTTIR; SURANI, 2014.

Figura 5 – Regulação da transcrição da especificação das CGPs.

Esquema das vias genéticas para a especificação das CGPs. Setas e linhas com barras de terminais as indicam vias de ativação e vias de repressão, respectivamente, conforme demonstrado por experimentos in vivo (KURIMOTO et al., 2008; YAMAJI et al., 2008); Setas e linhas pontilhadas com barras de terminais indicam vias de ativação e repressão, respectivamente, como proposto com base em experimentos in vitro (COVELLO et al., 2006; WEST et al., 2009; WEBER et al., 2010). Fonte: Adaptado de SAITOU; YAMAJI, (2012).

A sinalização WNT também é essencial para o destino das CGP (Figura 4), possívelmente através de interações pós-transcricionais, sugerindo que a expressão dos membros do sistema WNT podem atuar na sinalização das BMPs de maneira pós-transcricional (OHINATA et al., 2009). Em ~E9,5, as CGP migram para o intestino primitivo, e mais tarde através do mesentério dorsal, para os cumes genitais em desenvolvimento. Durante o processo de migração, CGPs ainda expressam Tnap, mas também Oct3/4, o proto-oncogene c-Kit, e SSEA (antígeno específico da fase embrionária) 1 e 3.