FUNGOS DEGRADADORES DE HIDROCARBONETOS

Os fungos são organismos eucarióticos microscópicos onipresentes, e fazem parte de um grupo diversificado. Desenvolvem-se e sobrevivem em quase todos os habitats, desempenham um papel vital em todos os ecossistemas e são capazes de ajustar o fluxo de nutrientes e energia através de suas redes de micélio (LAWTON; JONES, 1995).

São microrganismos potenciais que podem ser utilizados na recuperação de resíduos, tratamento de efluentes e na recuperação de áreas degradadas por atividades petrolíferas. Estudiosos em todo o mundo tentam resolver os problemas de resíduos e efluentes com a utilização de fungos saprófitas filamentosos onde estes são capazes de degradar compostos presentes em efluentes e, assim,

contribuir para a sua limpeza (SINGH, 2006).

Os fungos são conhecidos por degradar e deteriorar uma grande variedade de materiais e compostos, processos conhecidos como micodegradação e micodeterioração. As atividades de degradação de fungos foram reconhecidas em várias situações em que destroem os diferentes tipos de madeira, papel, têxteis, plásticos, couro e materiais de empacotamento.

Alguns outros fungos possuem capacidade de metabolizar hidrocarbonetos de petróleo, conhecida como micorremediação (CERNIGLIA; PERRY, 1973). Certos fungos contêm enzimas extracelulares que podem auxiliar a degradação inicial de hidrocarbonetos. Os fungos com suas estruturas de hifas, aumentam a área de superfície e permitem uma melhor penetração e acesso aos hidrocarbonetos agregados ao solo.

Estudos fragmentados têm mostrado um aumento na população de fungos após derramamento de óleo. Isso indica que certos fungos desenvolvem um sistema enzimático após um longo contato com hidrocarbonetos. Pinholt et al. (1979) estudaram as mudanças microbianas no solo durante a decomposição do óleo. Eles encontraram um aumento de 60 % a 82 % em fungos, utilizando óleo.

A extensão da biodegradação de hidrocarbonetos por fungos depende do ecossistema e de suas condições locais. Os fungos são os principais biodegradadores em ambientes marinhos. Entretanto, os fungos constituem uma minoria nos ambientes marinhos, com o aumento da população em zona intertidal,

restingas e áreas de mangue (SINGH, 2006).

Em um dos primeiros estudos desenvolvidos por Cerniglia e Perry (1973) sobre os fungos degradadores de hidrocarbonetos, foram isolados fungos provenientes de sedimento estuarino, na costa da Carolina do Norte. Entre os principais fungos selecionados, estavam Arpergillus versicolor, Cephalosporium

acremonium, Penicillium sp. e Cuninghamella elegans (CERNIGLIA; PERRY, 1973).

Segundo esses autores, o tratamento da poluição causada por petróleo em ambientes marinhos pode ocorrer mais eficientemente se organismos degradadores de hidrocarbonetos, incluindo os fungos, forem adicionados ao ambiente em grande quantidade, juntamente com a adição de nitrogênio e fosfato quando, aplicados com controle.

Vários outros fungos filamentosos e leveduras, que apresentaram capacidade de utilizar o petróleo e derivados para o seu crescimento, foram isolados e identificados. De solos contaminados por petróleo foram isolados fungos filamentosos identificados como: Beauveria bassiana, Chrysosporium sp., Mortierella

sp., Paecilomyces sp., Penicillium e Trichoderma viride e Verticilium spp. (DAVIES;

WESTLAKE, 1979). Dentre os principais e mais eficientes em degradar compostos saturados e aromáticos foram Beauveria alba e Penicillium simplicissimum (CHAINEAU et al., 1999).

Experimentos sobre a degradação por fungos filamentosos das diferentes frações de hidrocarbonetos saturados e aromáticos que compõem o petróleo tem demonstrado que esses fungos degradam com mais facilidade e preferencialmente os compostos saturados, degradando com menor eficiência a fração aromática (SILVA; ESPOSITO, 2010). Entretanto, vários outros estudos foram realizados utilizando fungos do gênero Penicillium na degradação de HPAs. Além destes o

Arpergillius niger e algumas leveduras também se mostraram eficientes na

degradação desses compostos mais recalcitrantes (SILVA; ESPOSITO, 2010). Lemos e Araújo (2002), realizaram em seus estudos isolamento e identificação de fungos filamentosos com capacidade de degradação do petróleo. Foram obtidas oitenta linhagens a partir de um solo contaminado com 5% p/p de petróleo, 75% destas linhagens apresentaram capacidade para degradar hidrocarbonetos de petróleo. Os autores agruparam-os em quatro gêneros fúngicos (Aspergillus, Penicillium, Parcilomyces e Fusarium), subdivididos nas seguintes espécies: Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor,

Aspergillus niveus, Aspergillus niger, Penicillium corylophilum, Parcilomyces variotti, Paecilomyces niveus e Fusarium sp.

Uma capacidade de degradar os hidrocarbonetos também foi observada nas espécies de seis ordens de Ascomycetes (APRIL et al., 2000). Todas as espécies degradadaram a fração de hidrocarbonetos de petróleo alifático. Hidrocarbonetos totais de petróleo (TPHs) foram reduzidos consideravelmente por três culturas de fungos após 4 meses, sob condições ricas em nitrogênio. Parcilomyces

chrysosporium degradou todos os componentes do BTEX, individualmente ou em

uma mistura composta (YADAV; REDDY, 1993).

Várias cepas de fungos com capacidade de assimilar hidrocarbonetos foram isoladas de ambientes tropicais do solo de uma floresta, e dos sedimentos de um rio contaminado por petróleo, em um estudo realizado por Oudot et al. (1993). As cepas mais potenciais, que exibiram biodegradação de petróleo total superior a 25% foram

Eupenicillium javanicum, Graphium putredinis, e Aspergillus flavus. Essas cepas

foram mais eficientes na degradação de saturados, com valores superiores a 40%, e para aromáticos foi superior a 30%. Nidulans emericella, Eupenicillium javanicum,

Gliocladium virens, e Aspergillus fumigatus degradaram significativamente as resinas

(15 a 28%). Emericella nidulans, Eupenicillium javanicum, Graphium putredinis, e

A análise multivariada de 22 parâmetros indicou uma tendência à reatividade

nos componentes durante a degradação do óleo da seguinte forma: n–alcanos de

baixo peso molecular > fenantreno > 3,2-metilfenatreno > n-alcanos de cadeia intermediária de comprimento > n-alcanos de cadeia mais longa de comprimento > isoprenóides ≈ 9,1-metilfenatreno. Independentemente da capacidade de degradação, todas as espécies de fungos apresentam essa sequência de degradação (SINGH, 2006).

Hussein (2012) coletou amostras de areia contaminadas com derramamento de óleo da praia Pensacola (Golfo do México), onde foram isolados e investigados os fungos com potecialidade para degradação de petróleo bruto. De dezesseis cepas fúngicas, foram confirmadas quatro cepas para a capacidade de biodegradação de petróleo bruto. Aspergillus niger apresentou maior atividade seguido por Penicillium, Cochliobolus lutanus e Fusarium solani.

Pesquisas nas praias de Omã na Arábia isolaram dez espécies de fungos: onde as especies Aspergillus niger, A. ochraceus e Penicillium chrysogenum foram

capazes de degradar n-alcanos (C13-C18). Além disso, foram encontradas diferenças

significativas na utilização de C15, C16, C17 e C18, com os três fungos. No entanto, o

coeficiente de correlação de biomassa e degradação do óleo não foi significativo para Aspergillus niger e Aspergillus terreus, e foi altamente significativo para P.

chrysogenum (ELSHAFIE A et al., 2007).

Recentemente nove cepas fúngicas nativas foram isoladas de um solo contaminado com petróleo bruto, e selecionadas com base em sua capacidade de crescer e degradar petróleo e incluindo vários hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs) como fonte de carbono. Os resultados mostraram que os fungos selecionados fazem parte dos gêneros Fusarium, Neurospora, Aspergillus,

Scedosporium, Penicillium, Neosartorya e Talaromyces. Foram feitas duas seleções,

onde Aspergillus terreus, Talaromyces spectabilis, e Fusarium sp., foram selecionados com base na tolerância para 2.000mg de uma mistura de fenatreno e pireno com 1kg de solo, durante 2 semanas. A percentagem de remoção de HPA obtida pelas três cepas é de cerca de 21% (REYES-CÉZAR et al., 2013).

No entanto, as resinas de petróleo e asfaltenos são consideradas como resistentes ou refratários à biodegradação. A cultura mista das cepas do solo é tão

fungos inoculados têm demonstrado uma capacidade para degradar compostos orgânicos voláteis (VOCs), como fontes de carbono e energia (QI et al., 2002).

Os cientistas defendem a hipótese de que uma única espécie de microrganismos não conseguirá degradar completamente nenhum tipo de óleo, sendo necessário um consórcio de microrganismos.

III.3.3. BIORREMEDIAÇÃO

A sociedade vem se tornando mais crítica e participativa em relação à qualidade ambiental, exigindo atuação cada vez maior das autoridades. Desta forma, em função da crescente demanda em relação ao gerenciamento de áreas contaminadas, avanços significativos ocorreram nas últimas décadas nos estudos que visavam à recuperação ambiental (MARIANO, 2006). Uma alternativa para a descontaminação ambiental é a biorremediação. Esta técnica de limpeza é barata, podendo ser aplicada em grandes áreas para atenuação de um grande número de poluentes, como os hidrocarbonetos de petróleo.

Biorremediação é uma tecnologia que se utiliza da habilidade de microrganismos ou outro membro da biosfera, para restaurar e preservar a qualidade ambiental para todas as formas de vida de um ecossistema, especialmente a humana. Tem sido sugerido que a tecnologia de biorremediação possa ser mais efetiva do que as técnicas mecânicas e físico-químicas tradicionais correspondentes (ABDEL MIGID et al., 2007). A utilização de plantas, bactérias e fungos para os processos de biorremediação tem sido muito relatada ultimamente, principalmente quanto ao uso de fungos e bactérias, devido ao seu grande potencial genético. Esses, por sua vez, podem ser isolados de ambientes altamente contaminados, devido ao seu poder de adaptação a essas condições (SRIVASTAVA; THAKUR, 2006; MARTINS, 2009).

A biorremediação é uma técnica de despoluição de ambientes contaminados baseada na aceleração do processo natural de biodegradação de determinadas substâncias no meio ambiente. O processo é dependente de algumas condições ambientais como: temperatura, presença de oxigênio, nutrientes e pH (COELHO, 2005).

Contaminante biodisponível

Microorganismos Contaminante adsorvido

O uso da técnica de biorremediação foi descoberta através de pesquisas da degradação de hidrocarbonetos no ambiente natural, nas quais foram identificados alguns microrganismos capazes de usar tais hidrocarbonetos como fonte de carbono e energia (ZOBELL, 1946; ATLAS, 1981). Mas só após a análise dos fatores bióticos e abióticos envolvidos no processo de biodegradação (Figura 9) é que a técnica passou a ser aplicada na limpeza de ambientes contaminados por óleo (LINDSTROM et al., 1991).

Figura 9 – Desenho esquemático do mecanismo de biodegradação dos contaminantes agregados ao

sedimento

Fonte: modificado de FEIJOO et al. (2003)

As técnicas de biorremediação podem ser classificadas como “ex situ” ou “in

situ”. Tecnologias “ex situ” são modalidades de tratamento nas quais o material

contaminado é removido, para um lugar diferente, onde possa ser tratado, com biorreatores, landfarmings, biopilhas e compostagem (SOUZA, 2003). Já as técnicas “in situ” são aplicadas no próprio local onde ocorreu a contaminação utilizando: i) microrganismos autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de tecnologias ativas de remediação (biorremediação intrínseca ou natural); ii) a adição de agentes estimulantes como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes (bioestímulo); iii) a bioventilação de solos em ambientes contaminados; iv) a fitorremediação e a inoculação de consórcios microbianos enriquecidos (bioaumento) (MARIANO, 2006).

A bioestimulação (Figura 10) é a aceleração da reprodução microbiana e de suas atividades metabólicas, pela adição de oxigênio, água e nutrientes ao meio ambiente contaminado (ROSA, 2001). A bioestimulação de populações de microrganismos autóctones com o objetivo de aumentar as taxas de biodegradação ; é frequentemente empregada em projetos de biorremediação (ATLAS, 1997). Para se utilizar o processo de bioestimulação, deve-se demonstrar que existe no local contaminado uma população natural de microrganismos capazes de biodegradar os contaminantes presentes, e que as condições ambientais são insuficientes para se obter altas taxas de atividade microbiológica dessa população (RAMASWAMI; LUTHY, 1997; MARIANO, 2006).

Figura 10 – Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica de

bioestimulação

Fonte: Modificado de LIMA, 2010

Durante a bioestimulação há fatores limitantes, como nutrientes e aceptores de elétrons, que estimulam o metabolismo e a velocidade de crescimento dos degradadores, o que acelera as taxas de biodegradação em condições ambientais favoráveis. A adição de nutrientes em ambientes contaminados permite a degradação mais rápida e eficaz dos hidrocarbonetos por parte dos microrganismos nativos (VALLEJO et al., 2005).

Segundo Vallejo et al. (2005) estudos prévios reportam que a bioestimulação acelera as taxas de biodegradação dos solos contaminados, quando os fatores são controlados, como pH, porcentagens de umidade, concentração de hidrocarbonetos,

D is s o lu ç ã o + B io d e g r a d a ç ã o S e d im e n ta ç ã o E s p a lh a m e n to E m u ls ific a ç ã o D is p e rs ã o O x id a ç ã o E v a p o ra ç ã o Ven to

Biodegradação usando Bioestimulo

Adição de Nutrientes Co2 + H2O Compostos menos tóxicos Nutriente Microrganismos Legenda

aceptores de elétrons e temperatura. A maioria dos estudos se baseia na adição de nutrientes em forma de fertilizantes, de compostos inorgânicos e inorgânicos simples, nitrogênio, fósforo e potássio (NPK).

A disponibilidade de oxigênio molecular, tem um profundo efeito na biodegradação de vários compostos. Limitação de oxigênio é um problema frequente na biorremediação “in situ” de hidrocarbonetos, e de outros poluentes que são biodegradados em condições aeróbias (BROWN et al., 1994; MARIANO, 2006).

Tanto a adição de água como a oxigenação do ambiente contaminado favorece a atuação da biodegradação. A aplicação de nutrientes ricos em nitrogênio e fósforo tem sido amplamente estudada, principalmente quando a concentração dessas substâncias é limitada, como ocorre nos ambientes costeiros localizados em regiões de clima tropical (ROSA, 2001).

Entre os fertilizantes oleofílicos podem ser utilizados uréia parafinada, octilfosfato, octoato férrico, fosfato duplo de amônia e magnésio parafinado, os quais podem estimular a biodegradação em diferentes ecossistemas (ATLAS; BARTHA, 1973; DIBBIE; BARTHA, 1976; HOWORITZ; OLIVIERI et al., 1976; ATLAS, 1977; BERGSTEIN; VESTAL, 1978). Em estudos utilizando fertilizantes de lenta liberação, como o Osmocote (Os. Scotts, Marysville, OH) e Inipol EAP-22 (Ip; ATOFINA Chemicals, Philadelphia, PA), combinado com nutrientes inorgânicos, Ran Xu e Obbard (2003), avaliaram a eficiência desses nutrientes na degradação dos hidrocarbonetos de petróleo presentes nos sedimentos de praia de Singapura. A degradação dos hidrocarbonetos alifáticos presentes nos óleos tratados com osmocote no sedimento de praia foi de 96%. A combinação de nutrientes solúveis e osmocote favoreceu o estímulo do metabolismo dos microrganismos indígenas, bem como manteve a liberação dos nutrientes, aumentando, assim, a biodegradação dos hidrocarbonetos do petróleo presentes no sedimento da praia.

O NPK e osmocote vêm sendo usados largamente como estimuladores. O

NPK, é composto de fosfato de amônia [(NH4)3PO4], sulfato de amônia [(NH4)2SO4] e

cloreto de potássio [KCl] nas proporções (N:P:K) de 10:10:10. O osmocote possui a mesma composição, no entanto a diferença está na forma de liberação desses nutrientes. No Osmocote a liberação é mais lenta, pois este é envolvido por uma cápsula protetora que limita a saída dos nutrientes. São fertilizantes de plantas,

facilmente encontrados no mercado a preços reduzidos (LIMA, 2010; AGARRY,

Pesquisas utilizando fertilizante do tipo NPK apresentaram resultados positivos, com a remoção de 100% dos n-alcanos compreendidos entre o decano e o eicosano, e 40% de remoção de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos foi obtido com o uso da combinação de cultura mista + fertilizante, na proporção de C:N de 100:10 (OLIVEIRA, 2001).

Todos esses resultados sugerem que o sucesso da biorremediação é função das propriedades do petróleo, da natureza dos produtos de biorremediação e das características dos ambientes contaminados. Estudos têm mostrado que a taxa de biodegradação do petróleo depende das concentrações de nutrientes na água intersticial dos sedimentos, o que poderia fornecer orientações importantes para aplicações de nutrientes (BRAGG et al., 1994; VENOSA et al., 1996).

As fontes mais comuns de nutrientes são sais de fósforo e nitrogênio encontrados em fertilizantes agrícolas, e até mesmo em subprodutos da indústria petroquímica. A adição de nutrientes é feita de modo a se estabelecer relações carbono e nitrogênio (C:N) e/ou carbono e fósforo (C:P) adequadas à biodegradação (HAMDI et al., 2007). No entanto, uma adição descontrolada pode promover a eutrofização do local, contribuindo para o desequilíbrio ambiental (SILVA, 2009). Contudo a utilização de aditivos orgânicos naturais como folhas, galhos, raízes de plantas indígenas do local podem contornar a situação. Segundo Oliveira (2009) uma das etapas mais importantes da ciclagem de nutrientes é a decomposição de folhas, galhos, flores, frutos (propágulos). A decomposição permite que parte do carbono retorne à atmosfera como dióxido de carbono e que os outros elementos absorvidos (principalmente N e P) sejam transformados para uma forma novamente utilizável.

Outra técnica utilizada é a bioaumentação (Figura 11), a qual ocorre pela adição de microrganismos específicos em regiões impactadas, adaptados em laboratório às condições ambientais. Ao usar essa técnica, faz-se a avaliação dos microrganismos presentes no ambiente, identificando-se os degradadores de óleo. Em seguida, através de biorreatores, estimula-se em laboratório o crescimento microbiano das espécies de interesse e, posteriormente, injeta-se o “pool” de microrganismos no local contaminado, com o objetivo de aumentar a população

microbiana, responsável pela degradação do óleo (VENOSA et al., 1999; ROSA,

Culturas mistas são produzidas com microrganismos coletados de regiões contaminadas, mas para isso têm-se alguns critérios para a escolha desses microrganismos, como a habilidade de degradar a maioria dos componentes do petróleo, boa estabilidade genética, elevado grau de atividade enzimática, capacidade de competir com os microrganismos autóctones, manutenção da viabilidade das células durante a estocagem, ausência de patogenicidade e crescimento rápido no meio ambiente natural (HOFF, 1992; BAKER; HERSON, 1994; SOUZA; 2003).

Figura 11 - Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica de

bioaumentação

Fonte: Modificado de LIMA, 2010

A manipulação genética de cepas de microrganismos, visando à oxidação de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, também tem sido estudada, principalmente através da introdução de plasmídeos em bactérias do gênero Pseudomonas (NOUR, 1997; SOUZA, 2003). A introdução de microrganismos geneticamente modificados requer uma avaliação criteriosa dos possíveis danos ambientais, ainda desconhecidos pela comunidade científica (LEAHY; COLWELL, 1990).

Os microrganismos aplicados devem atuar em sinergismo com as espécies autóctones, sem interferir nos processos biogeoquímicos naturais. Leavitt e Brown (1994) fizeram um estudo comparativo entre a bioestimulação e o bioaumento para um caso de tratamento de solo contaminado com óleos crus, empregando, em um

D is s o lu ç ã o + B io d e g r a d a ç ã o S e d im e n ta ç ã o E s p a lh a m e n to E m u ls ific a ç ã o D is p e rs ã o O x id a ç ã o E v a p o ra ç ã o Ven to

Biodegradação usando Bioaumento

Adição de microrganismos Co2 + H2O Compostos menos tóxicos Legenda Microrganismos

caso, microrganismos autóctones e, no outro, cultura comercial com mistura recomendada de nutrientes. Concluíram que, para algumas aplicações, a bioestimulação de microrganismos autóctones é a melhor escolha, considerando o custo e desempenho (MARIANO, 2006).

Parece que na maioria dos ambientes, microrganismos indígenas degradantes são mais do que suficiente para realizar a biodegradação de petróleo, se os níveis de nutrientes e outras condições ambientais adversas não limitá-los.

Outra forma de tratar solos contaminados com petróleo envolve o uso de biorreatores, procedimento utilizado em larga escala recentemente. São diversos os fatores que fortalecem esta convergência, que é diretamente relacionado com o movimento restrito dos microrganismos no solo, que acelera biodegradação dos contaminantes (REICHWALD, 2011).

Os biorreatores facilitam o controle do processo de biodegradação dos poluentes no solo, facilitando a aclimatação da microbiota e seu desenvolvimento. O emprego dos biorreatores vem surgindo como uma tecnologia viável e decisiva para tratamento de solos contaminados com compostos orgânicos (URURAHY, 1998).

A utilização da técnica de biorremediação pode mostrar vantagens e desvantagens, quando comparada a outras técnicas de limpeza. O método deve ser criteriosamente estudado, antes de ser aplicado num determinado ambiente (ROSA, 2001). O sucesso total por tratamentos de biorremediação depende de inúmeros fatores, tais como: característica do resíduo, presença de condições microbiológicas ótimas, seleção correta da tecnologia de biorremediação, uso de métodos analíticos apropriados para determinar o tipo e a extensão da contaminação e capacidade de estabelecer e manter as condições que favorecem as taxas de biodegradação de petróleo no ambiente (HUESEMANN, 1994; EPA, 2004; DAL FORNO, 2005).