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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE GEOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GEOLOGIA
DANUSIA FERREIRA LIMA
AVALIAÇÃO DE PROCESSOS GEOQUÍMICOS E DA
EFICIÊNCIA DE CONSÓRCIOS FÚNGICOS EM TESTES DE
SIMULAÇÃO DA BIORREMEDIAÇÃO EM SEDIMENTOS DE
MANGUEZAL CONTAMINADOS COM ÓLEO
Salvador
2014
DANUSIA FERREIRA LIMA
AVALIAÇÃO DE PROCESSOS GEOQUÍMICOS E DA
EFICIÊNCIA DE CONSÓRCIOS FÚNGICOS EM TESTES DE
SIMULAÇÃO DA BIORREMEDIAÇÃO EM SEDIMENTOS DE
MANGUEZAL CONTAMINADOS COM ÓLEO
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação, da Universidade Federal da Bahia, do Curso de Pós-Graduação em Geologia, área de concentração em Geologia Ambiental, Hidrogeologia e Recursos Hídricos, submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências – Geologia.
Orientadores: Profa. Dra. Olívia Maria Cordeiro de Oliveira
Prof. Dr. Manoel Jerônimo Moreira Cruz
Co-orientadora: Profa. Dra. Regina Maria Geris dos Santos
Salvador
2014
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________________________________________________________________ L732 Lima, Danusia Ferreira
Avaliação de processos geoquímicos e da eficiência de consórcios fúngicos em testes de simulação da biorremediação em sedimentos de manguezal contaminados com óleo / Danusia Ferreira Lima.- Salvador, 2014.
229 f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Olívia Maria Cordeiro de Oliveira.
Tese (Doutorado em Geologia) - Programa de Pós-Graduação em Geologia, Universidade Federal da Bahia, Instituto de Geociências, 2014.
1. Geoquímica ambiental – Recôncavo (BA). 2. Geoquímica ambiental – Rio de Janeiro. 3. Bacias sedimentares. 4. Manguezais. 5. Hidrocarbonetos. 6.
Biorremediação. I. Oliveira, Olívia Maria Cordeiro de. II. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Geociências. III. Título.
CDU: 550.4:504(81) _____________________________________________________________________ Elaborada pela Biblioteca do Instituto de Geociências da UFBA.
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“Dedico esse trabalho a Deus: Senhor, obrigada porque sei que sempre estás
presente em minha vida. Agradeço-te por ter me dado à vida e por guiar os meus passos, tanto nos momentos mais difíceis, como nas alegrias e conquistas. Dedico esse trabalho à minha família, por serem as pessoas mais importantes para mim e os que me ensinaram os valores da vida, honestidade, humildade e do amor. Obrigada por serem exemplos de perfeição e dedicação”.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro quero agradecer a Deus pela minha existência, pela realização deste trabalho, pela família maravilhosa que tenho, pelos amigos verdadeiros e por
ter me iluminado nas horas mais difíceis. A tua benção, Senhor! Ao Prof. Dr. Manoel Jerônimo Moreira Cruz, pela orientação, confiança, incentivo e oportunidade de aprendizado na área de geologia e principalmente pela amizade e por acreditar na minha capacidade profissional. Você é a base deste meu
sucesso! Muito Obrigado!
A Profa Dra.Olívia Maria Cordeiro de Oliveira pela orientação, paciência, incentivo,
oportunidade para realização deste trabalho e pelo aprendizado na temática de remediação de áreas impactadas por atividades petrolíferas. Mas acima de tudo por
ter confiado em mim, pela amizade, compreensão, e por sempre estar presente em todos os momentos de diálogo. Você é muito especial! Obrigada!
A profa Regina Geris pelo apoio técnico científico na área de microbiologia. Obrigada
por ter me recebido, por ter confiado na minha capacidade e por sempre estar disponível para transmitir seus conhecimentos. A senhora foi o “anjo bom” que cruzou o meu caminho, sendo de extrema importância para o desenvolvimento deste
trabalho. Muito obrigada!
Ao Prof. Dr. Jorge Alberto Trigüis, pesquisador renomado com grande sapiência na área de Geoquímica orgânica, pela disponibilidade sempre em transmitir seus conhecimentos. O grande mentor deste projeto. Confiou e acreditou na minha competência. O senhor foi muito importante para o alcance desta vitória. Meus
sinceros agradecimentos!
Ao curso e professores da Pós-Graduação em Geologia do Instituto de Geociências (UFBA) pela oportunidade e pelos conhecimentos transmitidos.
A todos os colegas de pós-graduação pela amizade, companheirismo e alegrias compartilhadas... a Antônio Bomfim, Rodrigo e Manuel... um grande Abraço! E
obrigada pela grande amizade.
Ao CNPq pelo apoio através da concessão da Bolsa de Doutorado.
À FINEP, pelo apoio financeiro através convênio FINEP no 01.05.0016.00 e
Referência FAPEX no 040318 associado ao Convênio PETROBRAS no 4600204631
– 0050.0020078.06.4 e Referência FAPEX no 060061, intitulado “Rede Cooperativa
em Recuperação de Áreas Contaminadas (RECUPETRO) Pesquisas e Desenvolvimento Tecnológico nos Laboratórios Integrados de Petróleo da Região Nordeste RECUPETRO 5”, que permitiu a realização deste trabalho. Muito obrigada
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A toda equipe do Núcleo de Estudos Ambientais – NEA, em especial ao Prof. Dr. Antônio Fernando Souza pela confiança e apoio recebido desde as primeiras etapas desta jornada... a Cícero Gonçalves da Silva, Izabel Biasi, Adriana, Lismar e
Alexsandro Rocha, que se mostraram presente em todos os momentos administrativos de realização deste trabalho.
Aos meus queridos bolsistas e filhos científicos Roberto Gomes, Eduardo Carrilho, Natali Santos, Narayana, Jessyca Beatriz, Taise, Lucas, Naijane (sorridente), Cibele, Thiara (dedicada), Isana (menina de ouro), Luana (amiga inseparável) pela amizade, companheirismo, pelo aprendizado que tivemos juntos e
por todo o apoio nos trabalhos de campo e laboratório... Sem vocês seria difícil a execução deste trabalho. Obrigada!!!
Ao Laboratório de Estudos de Petróleo (LEPETRO) do Instituto de Geociências (IGEO/UFBA) pela realização das análises químicas e geoquímicas... À coordenadora do LEPETRO, Dra. Karina Garcia que sempre se mostrou disponível
em ajudar... ao Técnico em química Jorge Palma que com sua boa vontade, amizade me proporcionou momentos de aprendizado, Rui Garcia, Isabel, e em especial a Química Dra. Sarah Adriana, amiga que se disponibilizou a me ajudar em
todos os momentos e a técnica Gisele Moraes dedicada e amiga tão especial. É de coração que agradeço, serei eternamente grata por tudo que fizeram por mim e para
realização deste trabalho.
Aos colegas Ketlyn Fioravanti, Verônica, Daiane, Ícaro Moreira, Carine, Daniele Magalhães e seus alunos de iniciação Científica... que se disponibilizaram em me
ajudar durante o desenvolvimento deste trabalho. Muito Obrigada!
Aos técnicos em informática Joaquim e Eduardo pela ajuda em momentos de sufoco e riscos de perder o banco de dados! Muito Obrigada!
A Daniela Assunção pela ajuda nos tratamentos dos dados e a Renan pelos esclarecimentos na interpretação dos dados estatísticos. Ao amigo Marcos Melo
pelo momentos compartilhados. Muito obrigada!
As amigas que conquistei... em especial a Luana amiga fiel que me acompanhou em todos os momentos com sua garra e boa vontade, a Sarah amiga
em todos os momentos e sentidos...a Claudia pelo incentivo e disponibilidade em transmitir seus conhecimentos. Vocês são muito especiais para mim.
A Nilton, secretário da pós- graduação em Geologia, amigo que sempre buscou resolver de forma sensata as minhas solicitações... É de coração que te
agradeço!
Aos motoristas e servidores do Instituto de Geociências. Em especial a Jairo que acompanhou e ajudou em muitas fases deste trabalho, com seu carisma e
simplicidade. Ao conhecido “Boçal” que nunca se negou a ajudar no desenvolvimento desse trabalho. Muito Obrigada!
Ao Laboratório de LBQM na pessoa da Profa. Dra. Regina Geris, que me recebeu e teve toda disponibilidade em me treinar e me ajudar em todas as etapas do trabalho
microbiológico...aos alunos de mestrado Hênia, Ailton e Adriana que sempre estiveram dispostos a me ajudar. As profa. Lurdinha e Isley pelo momento de
aprendizado que me propocionaram. Obrigada!
Ao Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia (LACE) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) na pessoa da profa. Lilia e mestre Deloar pelas análises de
toxicologia.
À Petrobras UN-BA, na pessoa de Isabela Pereira Moreira Santos por disponibilizar
os seguranças para acompanhamento das coletas em campo.
Às minhas amigas Jamile Batista, Sulamita Telles, pela amizade, compreensão, apoio, incentivos fundamentais para realização deste trabalho. Pela disposição em
me ajudar, escutar... meu Muito Obrigado!
À minha irmã, Denize Lima, pelo apoio incondicional, pela ajuda, por me acudir nas horas difíceis, pelo carinho e dedicação. A meu sobrinho e afilhado Arthur, a sua
chegada trouxe mais sentido a minha vida! Muito Obrigada!
À Césio Eloy, pela compreensão, apoio, dedicação, incentivo, ânimo, força e conselhos... Muito Obrigada!
Aos meus pais, Domingos Lima e Dasdores Oliveira, meus ombros gigantes... pelo grande amor, carinho, afeto e dedicação plena, pelas constantes palavras de força, pela presença mesmo que a distância... com esforço incansável, pelas noites sem dormir, pelos domingos sem descanso que com certeza conseguiram construir com
muito amor e carinho um lar de paz e amor, uma família maravilhosa. Pelas alegrias compartilhadas, pelos problemas vencidos... Vocês foram o alicerce desta
minha vitória e que sem essa força jamais seria possível chegar até aqui!!!! E a todos que de certa forma contribuíram para a concretização deste momento.
“É difícil alguém não lutar pelo próprio sonho Mas é inevitável que alguém lhe diga: Não vai dar certo!!
Você sabe que isso pode acontecer, Mas não desvalorize cada passo dado... Fortaleça sua fé e continue tentando Erga os olhos em direção ao destino final.. e siga em frente. Sempre vai haver um novo obstáculo E cada vez mais você terá orgulho de superá-lo Não importa o quão demore a chegada ao topo.
A vista de lá estará lhe esperando. esse é o momento em que você deve se lembrar... Que dias de chuva ainda virão
Mas você pode continuar. A guerra não acaba: A batalha sempre permanece e você deve aprender a perder. Para ganhar com nobreza no final Julia Venite
LIMA, Danusia Ferreira. Avaliação de processos geoquímicos e da eficiência de consórcios fúngicos em testes de simulação da biorremediação em sedimentos de
manguezal contaminados com óleo. Tese (doutorado) – Instituto de Geociências,
Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2014.
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo avaliar os processos geoquímicos e a eficiência de consórcios fúngicos em testes de simulação da biorremediação em sedimento de manguezal contaminados por dois tipos de óleos (óleo da bacia do Recôncavo e óleo da bacia de Campos). Para isto foram montados três experimentos. O experimento 1 consistiu na avaliação geoquímica das frações (saturados, aromáticos e NSO) do óleo da bacia do Recôncavo em sedimentos e na investigação de fungos específicos, degradadores de cada fração para obtenção de consórcios. O experimento 2 consistiu na avaliação dos processos geoquímicos e da eficiência dos consórcios fúngicos na degradação de dois tipos de óleos (bacia do Recôncavo e bacia de Campos) em sedimentos de manguezal em condições laboratoriais. E o experimento 3 consistiu na avaliação dos processos geoquímicos e na eficiência dos consórcios fúngicos na degradação do óleo da Bacia do Recôncavo em sedimentos de manguezal confinados em protótipos de biorreatores. No experimento 1 o monitoramento geoquímico mostrou que ao longo de 30 dias houve degradação dos n-alcanos (saturados). No entanto, não foi observada degradação nas demais frações do óleo da bacia do Recôncavo. Os parâmetros físico-químicos e químicos foram favoráveis, não sendo parâmetros impeditivos para o processo de biodegradação e foram isolados 72 fungos, sendo que a menor quantidade de isolados foi obtida da unidade de simulação contaminada com fração de saturados. Os fungos isolados foram selecionados, utilizando o indicador redox 2,6 diclorofenol-indofenol (DCPIP), com base no acompanhamento do crescimento radial e através do teste de antagonismo. O consórcio 1 (com potencialidade para degradar o óleo da bacia do Recôncavo) foi composto por 30 isolados e o consórcio 2 (com potencialidade para degradar o óleo da bacia de Campos) por 28 isolados. Os consórcios foram imobilizados com polímeros a base de fibra de coco e folha de manguezal em pó. A aplicação dos consórcios imobilizados com potencialidade em degradar os dois tipos de óleo estudados (experimento 2) em condições laboratoriais apresentou resultados promissores para o entendimento do processo de biorremediação em sedimentos de manguezal. Em relação ao processo de bioestimulação utilizando a fibra de coco e folha de manguezal em pó imobilizada, não foi possível observar uma diferença significativa na eficiência em relação à liberação de nutrientes. Em contrapartida, pode ser observado que de alguma forma foram mantidos os teores de nutrientes adequados ao longo de 90 dias de experimento, o que não ocorreria se não tivesse sido adicionado nenhum tipo de aditivo nutricional. Já em relação ao bioaumento foi possível observar aceleração na biodegradação em relação ao controle com atenuação natural. A partir da visualização dos cromatogramas foi possível observar que o óleo da bacia do Recôncavo sofreu uma modificação no perfil ao longo dos 90 dias, houve redução dos n-alcanos mais leves com aumento da linha de base, mostrando que também ocorreu degradação das frações mais pesadas. Os cromatogramas que mostram a
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modificação do perfil do óleo da bacia de Campos levam a conclusão que os fungos contidos no consórcio têm habilidade em reduzir os hidrocarbonetos saturados (n-alcanos), mas parecem ter maior habilidade em degradar os compostos aromáticos e NSO. Os resultados obtidos para o experimento 3, utilizando um protótipo de biorreator foram melhores quando comparados ao experimento 2. A redução de n-alcanos do óleo da bacia do Recôncavo foi bem mais expressiva. Os resultados no geral apontam que os consórcios são promissores para o processo de biorremediação. Entretanto seria necessário uma maior atenção na interação entre os fungos (sinergismo).
Palavras- chave: consórcio fúngico, bacia do Recôncavo, bacia de Campos, biorremediação, hidrocarbonetos totais do petróleo.
LIMA, Danusia Ferreira. Evaluation of geochemical processes and efficiency of fungal consortia simulation of bioremediation in mangrove sediments contaminated with oil tests. Thesis ( Ph.D. ) - Institute of Geosciences, Federal University of Bahia, Salvador, 2014.
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the geochemical processes and efficiency of fungal consortia simulation of bioremediation in mangrove sediment contaminated by two types of oils (the Reconcavo Basin and oil in the Campos Basin) tests. For this experiments were assembled. Experiment 1 consisted of the evaluation of geochemical fractions (saturates, aromatics and NSO) in the Reconcavo Basin oil in sediments and in the investigation of specific fungi, decomposers of each fraction to obtain consortia. Experiment 2 consisted of the evaluation of geochemical processes and efficiency of these fungal consortia in degradation of both types of oils (and Reconcavo Basin Campos Basin) in mangrove sediments under laboratory conditions. And the third experiment consisted in the evaluation of geochemical processes and efficiency of fungal consortia in degradation of oil in the Reconcavo Basin sediments of mangrove confined in prototype bioreactors. In experiment 1 geochemical monitoring showed that over 30 days there was degradation of n- alkanes (saturated), however no degradation was observed in the other fractions of the oil from the Reconcavo basin. The physico- chemical and chemical parameters were favorable, being not impede parameters for the process of biodegradation and 72 were isolated, of which the smaller quantity of isolated unit was obtained from the fraction contaminated with saturated simulation. The isolates were selected based on two types of oxidation tests, using the indicator redox indicator 2,6 - dichlorophenol indophenol (DCPIP), based on the monitoring of radial growth and through the antagonism test. The consortium 1 (with the potential to degrade the oil of the Reconcavo basin) was composed of 30 isolates and consortium 2 (with potential to degrade the oil in the Campos Basin) for 28 isolates. Consortia were immobilized with a polymer base of coconut fiber and mangrove leaf powder. The application of immobilized consortia with the potential to degrade the two oil types studied (experiment 2) in laboratory conditions showed promising results for understanding the process of bioremediation in mangrove sediments. Regarding the biostimulation process using the fiber from coconut and mangrove leaf on immobilized powder did not exhibit a significant difference in efficiency in relation to the release of nutrients. By contrast can be observed that somehow the appropriate levels throughout the 90 days of the experiment, which would not happen if he had not been added to any kind of nutritional additive nutrients was maintained. In relation to biaumento was observed acceleration in the biodegradation compared to control with performance of natural attenuation. From the view of the chromatograms was observed that the oil Reconcavo basin has undergone a change in profile over 90 days, reduction of the lighter n-alkanes increase from baseline, demonstrating that degradation also occurred more fractions heavy. The chromatograms show that the modification of the oil in the Campos Basin profile lead to the conclusion that the strains contained in the consortium have ability to reduce saturated (n- alkane) hydrocarbons, but seem to
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have greater ability to degrade aromatic compounds and NSO. The results for Experiment 3, using a prototype bioreactor showed better results when compared to experiment 2. The reduction of n-alkanes oil Reconcavo basin was much more expressive. The results in general indicate that consortia are promising for the process of bioremediation, however greater attention on the interaction between fungi (synergism) would be necessary.
Keywords : fungal consortium, Reconcavo Basin, Campos basin, bioremediation, total petroleum
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Imagem de satélite do trecho do rio São Paulo (próximo a sua foz)
localizado no município de São Francisco do Conde, Bahia e área de coleta ... 33 Figura 2 - Mapa de situação e localização da área de estudo. a) Mapa de situação da
BTS; b) imagem de satélite da área em destaque de amarelo ... 34 Figura 3 - Estruturas dos isoprenóides: (a) pristano e (b) fitano ... 36 Figura 4 - Estruturas dos hidrocarbonetos aromáticos (a) antraceno e (b) fenantreno 37 Figura 5 - Estrutura de compostos polares contendo nitrogênio.
2-cloro-6-triclorometilpireno ... 38 Figura 6 – Esquematização demonstrativa da biodegradação do pristano ... 40 Figura 7 – Esquematização demonstrativa da biodegradação anaeróbica de alcanos 41 Figura 8 - Esquematização demonstrativa da biodegradação do (a) antraceno, (b,c)
alternativas para fenantreno ... 42 Figura 9 – Desenho esquemático do mecanismo de biodegradação dos contaminantes agregados ao sedimento ... 48 Figura 10 – Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica
de bioestimulação ... 49 Figura 11 - Desenho esquemático do processo de biodegradação utilizando a técnica
de bioaumentação ... 52 Figura 12 - Organograma ilustrativo do Modelo do Experimento 1 de biorremediação
montado no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação,
Candeias-BA ... 56 Figura 13 - Organograma ilustrativo do Modelo do Experimento 2 de biorremediação
montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA. Onde BR- bacia do Recôncavo; BC- bacia de Campos; AQ.- aquário ... 56 Figura 14 - Organograma ilustrativo do Modelo do Experimento 3 de biorremediação
montado em biorreatores no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA ... 58 Figura 15 - Investigação da área de manguezal localizada nas margens do estuário do
rio São Paulo: (a) Área de coleta (b) Coleta do sedimento ... 58 Figura 16 - Coleta do sedimento de manguezal do estuário do rio São Paulo para
montagem dos experimentos de biorremediação ... 59 Figura 17 - Montagem do experimento 1 (parte 1) de biorremediação no Laboratório de
Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA: (a) unidades de simulação; (b) provetas vasadas revestidas com sacos de algodão sustentadas por suporte de madeira; (c) aquários com bomba de oxigenação e (d) bancada montada com as unidades de simulação ... 60 Figura 18 - Montagem do experimento 1 (parte 2) de biorremediação no Laboratório de
Simulação de processos de Biorremediação, Candeias-BA: (a) placas de Petri com sedimento contaminado com frações; (b e c) transferência do sedimento contaminado para as provetas e (d) unidades de simulação cheias, simulando a maré alta ... 61 Figura 19 - Coleta das amostras de sedimento no experimento 1 de Biorremediação
montado no Laboratório de Simulação de processos de Biorremediação,
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das provetas, (c) homogeneização das amostras e (d) acondicionamento das amostras... 63 Figura 20 - Montagem do Experimento 2 (fase 1) de biorremediação no Laboratório de
Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) sedimento homogeneizado sendo colocado nas provetas; (b) provetas com sedimento; (c) sedimento esterilizado e (d)
proveta sendo revestida e colocadas no suporte de madeira ... 64 Figura 21 - Montagem do Experimento 2 (fase 2) de biorremediação no Laboratório de
Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) inserção das cápsulas com consórcios imobilizados; (b) simulação do derrame com óleo; (c) inserindo os suportes com as provetas nos aquários; (d) inserindo a tampa no aquário; (e) aquário lacrado e (f) bancada montada ... 65 Figura 22 - Sistema desenvolvido para simulação da maré no experimento 2 de
biorremediação no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador-BA: (a) sistema com galões alimentando os aquários, simulando a maré alta; (b) simulação da descida da maré ... 66 Figura 23 - Coleta das amostras de sedimento no experimento 2 de Biorremediação
montado no Laboratório de Estudos do Petróleo, Salvador -BA: (a) aquários na capela de fluxo laminar; (b) retirada das provetas; (c) homogeneização das
amostras e (d) acondicionamento das amostras ... 68 Figura 24 - Esquema do protótipo de biorreator de imersão temporária desenvolvido
para o experimento 3 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA ... 69 Figura 25 - Esquema do protótipo de biorreator de imersão temporária desenvolvido
para o experimento 3 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA ... 69 Figura 26 - Montagem do Experimento 3 de biorremediação montado em biorreatores
no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA: (a) biorreatores com água do estuário e com sedimento esterilizado; (b) cápsulas com consórcios imobilizados; (c) simulando o derrame com óleo; (d) vista superior do biorreator e (e) protótipo montado ... 70 Figura 27 – Fotografia do protótipo de biorreator de imersão temporária: (a) biorreator
na fase de maré alta e (b) biorreator na fase de maré baixa. ... 71 Figura 28 - Coleta das amostras para determinações analíticas no Laboratório de
Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 71 Figura 29 - Cromatogramas das amostras coletadas no ponto 1, 2 e 3 do manguezal
do estuário do rio São Paulo ... 79 Figura 30 – Cromatogramas do fracionamento do óleo da bacia do Recôncavo: (a)
perfil do óleo da Bacia do Recôncavo (BR); (b) perfil da fração de saturados do óleo BR; (c) perfil da fração de aromáticos do óleo BR e (d) perfil da fração de NSO do óleo BR (condições de análise vide apêndice A) ... 81 Figura 31 – Cromatogramas do fracionamento do óleo da bacia de Campos: (a) perfil
do óleo da bacia de Campos (BC); (b) perfil da fração de saturados do óleo BC; (c) perfil da fração de aromáticos do óleo BC e (d) perfil da fração de NSO do óleo BC. (condições de análise vide apêndice A)... 83 Figura 32 - Cromatogramas dos extratos das unidades de simulação no tempo 0 e no
tempo 30: (a) Controle (REF01); (b) saturados(SAT); (c) Aromáticos (ARO03) e (d) NSO (NSO04). Frações do óleo da bacia do Recôncavo... 85
Figura 33 - Gráfico com variação dos teores de fósforo nas unidades de simulação no 1º e 30º dia de experimento ... 88 Figura 34 - Gráfico com variação dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação
no 1º e 30º dia de experimento ... 88 Figura 35 - Gráfico com variação dos teores de CO% nas unidades de simulação no 1º
e 30º día de experimento ... 89 Figura 36 - Análise dos Componentes Principais (ACP). Onde: (a) – Variáveis: fósforo,
nitrogênio, matéria orgânica, temperatura, pH, Eh (mV), salinidade e O.D. aos tempos amostrais T0 e T30 e (b) – Casos - amostras de sedimento controle (REF 01), contaminados com fração de saturados (SAT 02), contaminados com fração de aromáticos (ARO 03) e contaminados com NSO (NSO 04). Círculos verdes correspondem as principais variáveis que explicam o PC1. ... 90 Figura 37. Médias da fecundidade total expressa em indivíduos produzidos (a) e da
sobrevivência (b) da espécie Tisbe biminiensis quando exposta aos sedimentos, contaminados com frações do óleo da bacia do Recôncavo, da área do estuário do Rio São Paulo e controle (Maracaípe-PE ). ... 92
Figura 38 - Gráfico de linhas para número de células viáveis (UFCs x 105) em amostras
de sedimento controle (REF01) e contaminados com frações do óleo da bacia do Recôncavo (SAT02, ARO03 e NSO04): (a) UFCs de fungos no T0 e T30, e (b) UFCs de bactérias no T0 e T30 ... 93 Figura 39 – Gráfico de barras para quantidade dos fungos isolados em amostras de
sedimento do Estuário do rio São Paulo, Candeias- BA coletadas em cada
unidade de simulação (REF01, SAT02, ARO03 e NSO04) no T0 e T30 ... 94 Figura 40 – Gráfico evidenciando os fungos testados quanto a sua oxidação para o
óleo da bacia do Recôncavo: (a) teste com fração de saturados; (b) teste com fração de aromáticos e (c) teste com a fração de NSO ... 98 Figura 41 – Ilustração mudança de cor do indicador após 48hs para dois fungos
testados quanto a sua oxidação para o óleo da Bacia do Recôncavo. (a) tempo 0 e (b) após 48hs ... 99 Figura 42 – Gráfico com fungos selecionados capazes de degradar as três frações
presentes no óleo da bacia do Recôncavo ... 100 Figura 43 - Gráfico evidenciando os fungos testados quanto a sua oxidação para o
óleo da Bacia de Campos ... 101 Figura 44 – Gráfico com fungos selecionados capazes de degradar as três frações
presentes no óleo da bacia de Campos ... 103 Figura 45 - Gráfico mostrando os fungos testados quanto a sua oxidação para óleo da
bacia do Recôncavo ... 105 Figura 46 – ilustração mudança de cor do indicador após 24hs para dois fungos
testados quanto a sua oxidação para Óleo da Bacia do Recôncavo. (a) teste com a linhagem R33 e (b) teste com a linhagem S52 ... 106 Figura 47 - Gráfico mostrando os fungos testados quanto a sua oxidação para óleo da
Bacia de Campos ... 107 Figura 48 – Ilustração mudança de cor do indicador após 24hs para dois fungos
testados quanto a sua oxidação para óleo da Bacia do Recôncavo. (a) teste com a linhagem R11 e (b) teste com a linhagem A77 ... 108 Figura 49 – Gráfico de box plot para crescimento radial em dois tipos de meio (BDA e
Sabouraud), em duas condições (com e sem fração) para as frações (saturados, aromáticos e NSO), do óleo da bacia do Recôncavo ... 111
16
Figura 50 – Gráfico de box plot para crescimento radial em dois tipos de meio (BDA e Sabouraud) em duas condições (com e sem fração), para fração de saturados, aromáticos e NSO do óleo da bacia de Campos ... 114 Figura 51 – Gráfico de regressão linear para crescimento radial dos fungos isolados
para óleo da bacia do Recôncavo e óleo da bacia de Campos ... 114 Figura 52 – Teste de antagonismo dos isolados, com potencialidade em degradar
frações do óleo da bacia do Recôncavo. (a) isolados da fração de saturados, (b) isolados da fração de aromáticos e (c) isolados da fração de NSO ... 116 Figura 53 - Teste de antagonismo dos isolados com potencialidade em degradar
frações do óleo da bacia de Campos. (a) isolados da fração de saturados, (b) isolados da fração de aromáticos e (c) isolados da fração de NSO ... 117 Figura 54 – Micrografia dos isolados crescidos em meio BDA, em lâmina e imagem
fotográfica dos mesmos, que compuseram o Consórcio da bacia do Recôncavo. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x ... 120 Figura 55 – Continuação... Micrografia dos isolados fúngicas crescidos em meio BDA,
em lâmina e imagem fotográfica dos mesmos, que compuseram o Consórcio da bacia do Recôncavo. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x ... 121 Figura 56 - Micrografia e imagem fotográfica dos isolados que compuseram o
consórcio da bacia de Campos. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x ... 123 Figura 57 – Continuação... Micrografia e imagem fotográfica dos isolados que compôs
o Consórcio da bacia de Campos. Imagens obtidas por microscopia ótica com aumento de 400x ... 124 Figura 58 – Consórcios fúngicos encapsulados: (a) encapsulados à base de fibra de
coco e (b) encapsulados à base de folha de manguezal em pó ... 125 Figura 59 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de
simulação controle do experimento de biorremediação em sedimentos do
manguezal do estuário do rio São Paulo ... 129 Figura 60 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de
simulação controle do óleo da bacia do Recôncavo do experimento de
biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo ... 129 Figura 61 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de
simulação controle do óleo da bacia de Campos do experimento de
biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo. Linha pontilhada – corresponde ao início do processo ... 130 Figura 62 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de
simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + fibra de coco, do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo ... 132 Figura 63 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de
simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + folha de manguezal do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo ... 134 Figura 64 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de
simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + fibra de coco do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo ... 136
Figura 65 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados das unidades de simulação do óleo da bacia do Recôncavo + consórcio 1 + folha de manguezal do experimento de biorremediação em sedimentos do manguezal do estuário do rio São Paulo ... 137 Figura 66 – Gráfico com variação da razão Pristano/Fitano (ppb) nos tempos 0, 30, 60
e 90 dias de experimento ... 138 Figura 67 – Gráfico com variação da razão Pristano/Fitano nos tempos 0, 30, 60 e 90
dias de experimento ... 139
Figura 68 – Gráfico com variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias
de experimento ... 140
Figura 69 – Gráfico com variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0 e média (dias)
do experimento ... 141
Figura 70– Gráfico com variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias
de experimento ... 141
Figura 71 – Gráfico com variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0 e média (dias) do
experimento ... 142 Figura 72 – Gráfico com variação da HTP/UCM nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de
experimento ... 143 Figura 73 - Análise dos Componentes Principais (ACP) para as razões dos parâmetros
geoquímicos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18) monitorados no experimento 2. Onde:
(a) –Variáveis (unidades de simulação) e (b) – Casos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18, nos tempos 0 e 30, 60 e 90) ... 144 Figura 74 – Gráfico de similaridade (Cluster) entre as variáveis dos parâmetros
geoquímicos (HTP/UCM, P/F, P/nC17, F/nC18) monitorados no experimento 2 ... 145
Figura 75 - Gráfico com a variação dos valores da temperatura do experimento 2 mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ... 146 Figura 76 - Gráfico com a variação dos valores do pH do experimento 2 mensurados
nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias... 147
Figura 77 - Gráfico com a variação dos valores do EH do experimento 2 mensurados
nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias... 148 Figura 78 - Gráfico com a variação dos valores da salinidade do experimento 2
mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ... 149 Figura 79 - Gráfico com a variação dos valores de O.D. do experimento 2, mensurados nas unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias... 150 Figura 80 – Gráfico de box plot para os parâmetros físico-químicos (pH, temperatura,
EH, O.D. e salinidade monitorados no experimento 2 ... 151 Figura 81 – Gráfico de similaridade (Cluster) entre as variáveis dos parâmetros
físico-químicos (pH, temperatura, EH, O.D. e salinidade monitorados no experimento 2
... 151 Figura 82 - Análise dos Componentes Principais (ACP) para parâmetros
físico-químicos (pH, temperatura, EH, salinidade monitorados no experimento 2. Onde:
(a) – Variáveis (pH, temperatura, EH, O.D. e salinidade) e (b) – Casos (T0, T30, T60
e T90) ... 152 Figura 83 – Gráfico de regressão linear para parâmetros físico-químicos (pH,
18
Figura 84 - Gráfico com variação dos teores de fósforo nas unidades de simulação, nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ... 154 Figura 85 - Gráfico com média dos teores de fósforo nas unidades de simulação nos
tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias... 155 Figura 86 - Gráfico com variação dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação,
nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ... 156 Figura 87 - Gráfico com média dos teores de nitrogênio nas unidades de simulação
nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ... 156 Figura 88 - Gráfico com variação dos teores de CO% nas unidades de simulação
simulação, nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias ... 157 Figura 89 - Gráfico com média dos teores de CO (%) nas unidades de simulação nos
tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias... 158 Figura 90 - Análise dos Componentes Principais (ACP) parâmetros químicos (fósforo,
nitrogênio e CO) monitorados no experimento 2. Onde: (A) –Variáveis (T0, T30, T60 e T90) e (B) – Casos (fósforo, nitrogênio e CO) ... 159 Figura 91 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de bactérias nas
unidades de simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias... 160 Figura 92 – Gráfico de box plot de células bacterianas (UFC) monitorados no
experimento 2 ... 161 Figura 93 – Gráfico de similaridade (Cluster) de células bacterianas (UFC)
monitorados no experimento 2 ... 161 Figura 94 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de fungos nas
unidades de simulação simulação nos tempos 0, 8, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dias 162 Figura 95 – Gráfico de box plot de células fúngicas (UFC), monitorados no
experimento 2 ... 163 Figura 96 – Gráfico de similaridade (Cluster) de células fúngicas (UFC), monitoradas
no experimento 2 ... 163 Figura 97 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos
T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BRFO ... 164 Figura 98 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0,
T30, T60 e T90 na unidade de simulação BRFI ... 165 Figura 99 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos T0,
T30, T60 e T90 na unidade de simulação BCFI ... 167 Figura 100 - Gráfico de linhas para os parâmetros biogeoquímicos para os períodos
T0, T30, T60 e T90 na unidade de simulação BCFO ... 168 Figura 101 - Cromatogramas com perfis do sedimento coletados dos biorreatores
(BIO1, BIO2 e BIO3) nos períodos T0, T30, T60 e T90 ... 170 Figura 102 – Variação da razão Pristano/Fitano nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de
experimento 3 ... 171
Figura 103 – Variação da razão Pristano/nC17 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de
experimento 3 ... 172
Figura 104 – Variação da razão Fitano/nC18 nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de
experimento 3 ... 172 Figura 105 – Variação da razão HTP/UCM nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias de
experimento 3 ... 173 Figura 106 - Variação dos teores de fósforo nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas
Figura 107 - Variação dos teores de nitrogênio nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas unidades de biorreator ... 175 Figura 108 - Variação dos teores de CO% nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias, nas
unidades de biorreator ... 175 Figura 109 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de bactérias nas
unidades de biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias ... 176 Figura 110 - Gráfico para número de células viáveis (UFC). UFC de fungos nas
unidades de biorreator nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias ... 177 Figura 111 - Gráfico de linhas para número de células viáveis (UFC) nas unidade de
20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Tabela com a indicação dos valores de temperatura (Temp.), pH, oxigênio
dissolvido (O.D.), salinidade (SAL.) e EH ao longo do experimento 1 mensurados
nas unidades de simulação (REF01, SAT02, ARO02 e NSO04) no tempo 0 (T0) e após 30 dias (T30) ... 86 Tabela 2 - Códigos dos fungos isolados em cada unidade de simulação do
experimento 1 ... 96 Tabela 3 - Valores quantitativos da solução de esporos utilizados no teste de oxidação para óleo da bacia do Recôncavo ... 100 Tabela 4 - Valores quantitativos de esporos utilizados no teste de oxidação para
frações do óleo da bacia de Campos ... 103 Tabela 5 - Velocidades de crescimento radial em diferentes meios (BDA, Saboraud), e
com as frações as do óleo da bacia do Recôncavo (Saturados, Aromáticos e NSO). Destaque em vermelho – maiores velocidades. Destaque em verde –
maiores velocidades com adição das frações do óleo da bacia do Recôncavo .. 110 Tabela 6 - Velocidades de crescimento radial em diferentes meios (BDA, Saboraud), e
com as fração do óleo da bacia de Campos (Saturados, Aromáticos e NSO). Destaque em vermelho – maiores velocidades. Destaque em verde – maiores velocidades com adição das frações ... 113 Tabela 7 – Isolados que compuseram o consórcio da bacia do Recôncavo e seus
principais resultados ... 119 Tabela 8 - Isolados que compuseram o consórcio da bacia do Recôncavo e seus
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Descrição dos tratamentos do Experimento 2 de biorremediação montado no Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), Salvador-BA ... 57 Quadro 2 - Análises realizadas ao longo do experimento 1 no Laboratório de Estudos
do Petróleo (LEPETRO) e no Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos
Microrganismos (LBQM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 62 Quadro 3 - Análises realizadas ao longo do experimento 2 no Laboratório de Estudos
do Petróleo (LEPETRO) e no Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos
Microrganismos (LBQM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 67 Quadro 4 - Análises realizadas ao longo do Experimento 3 no Laboratório de Estudos
de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 72 Quadro 5 – Análises físicas realizadas na investigação da área no Laboratório de
Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 73 Quadro 6 - Análises geoquímicas realizadas na investigação da área no Laboratório
de Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 74 Quadro 7 - Análises físicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de Estudos de
Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 74 Quadro 8 - Análises geoquímicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de
Estudos de Petróleo (LEPETRO) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 75 Quadro 9 - Análises biológicas realizadas no experimento 1 no Laboratório Ao
Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia (LACE) da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE) ... 75 Quadro 10 - Análises microbiológicas realizadas no experimento 1 no Laboratório de
Estudos de Petróleo (LEPETRO) e Laboratório de Biotecnologia e Quimica dos Microrganismos (LBQM) da Universidade Federal da Bahia (UFBA) ... 76
22
LISTA DE ABREVIATURAS
BTS Baía de Todos os Santos RLAM Refinaria Landulpho Alves HPAs Hidrocarbonetos poliaromáticos UFBA Universidade Federal da Bahia BC Bacia de Campos
BR Bacia do Recôncavo
GPS Sistema de Posicionamento Global PTFE Politetrafluoretileno
IGEO Instituto de Geociências/UFBA
NEA Núcleo de Estudos Ambientais/UFBA IQ Instituto de Química/UFBA
LBQM Laboratório de Biotecnologia e Química dos microrganismos/UFBA
LEPETRO Laboratório de Estudos do Petróleo/UFBA DCPIP Indicador redox 2,6 diclorofenol-indofenol pH Potencial hidrogeniônico
EH Potencial redox
C.O Carbono Orgânico M.O Matéria orgânica O,D. Oxigênio dissolvido
ACP Análise de Componentes Principais UFC Unidade Formadora de Colônias BDA Batata Dextrose Ágar
UCM Unresolved Complex Mixture
HTP Hidrocarbonetos Totais do petróleo
SÚMARIO RESUMO ... 9 ABSTRACT ... 11 LISTA DE FIGURAS ... 13 LISTA DE TABELAS ... 20 LISTA DE QUADROS ... 21 LISTA DE ABREVIATURAS ... 22 CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL E OBJETIVOS ... 25
I.1.0INTRODUÇÃO ... 27 I.1.1OBJETIVOS ... 31 I.1.1.1OBJETIVO GERAL ... 31 I.1.1.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 31
CAPÍTULO II - ÁREA DE AMOSTRAGEM ... 32
II.2.0LOCALIZAÇÃOESITUAÇÃODAÁREADEAMOSTRAGEM ... 33
CAPÍTULO III - ESTADO DA ARTE ... 35
II.3.0PETRÓLEOESUACOMPOSIÇÃOQUÍMICA ... 36 III.3.1BIODEGRADAÇÃODEHIDROCARBONETOS ... 38 III.3.2FUNGOSDEGRADADORESDEHIDROCARBONETOS ... 43 III.3.3. BIORREMEDIAÇÃO ... 47
CAPÍTULO IV - MATERIAIS E MÉTODOS ... 54
IV.4.0TRABALHOSDEESCRITÓRIO ... 55 IV.4.1TRABALHOSDECAMPO ... 55
IV. 4.1.2 Experimento 1 (Isolamento e seleção de microrganismos) ... 59 IV. 4.1.3 Experimento 2 (aplicação em condições laboratoriais) ... 63
IV.4.2TRABALHOSDELABORATÓRIO ... 73
IV. 4.2.1 Investigação da área ... 73 IV. 4.2.2 Experimento 1 (Isolamento e seleção dos microrganismos) ... 74 IV. 4.2.3 Experimento 2 (aplicação em condições laboratoriais) ... 76 IV. 4.2.4 Experimento 3 (Biorreatores) ... 76
CAPÍTULO V - RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 77
V.5.0.ANÁLISESDASAMOSTRASPARAINVESTIGAÇÃODAÁREADE
AMOSTRAGEM ... 78
V.5.1.ANÁLISESDASFRAÇÕESDOSÓLEOS(BACIADORECÔNCAVOEBACIADE CAMPOS) ... 80 V.5.2.EXPERIMENTO1-ISOLAMENTOESELEÇÃODOSMICRORGANISMOS ... 84
V. 5.2.1. Monitoramento geoquímico ... 84 V. 5.2.2. Monitoramento físico-químico e químico ... 86 V. 5.2.3. Monitoramento biológico ... 91 V. 5.2.4. Monitoramento microbiológico ... 92
V.5.3EXPERIMENTO2(APLICAÇÃOEMCONDIÇÕESLABORATORIAIS) ... 127
24
V. 5.3.2. Monitoramento químico e físico-químico ... 145 V. 5.3.3. Monitoramento microbiológico ... 159 V. 5.3.4. Integração de dados biogeoquímicos do experimento 2 ... 164
V.5.4EXPERIMENTO3(BIORREATORES) ... 169
V. 5.4.1. Monitoramento geoquímico ... 169 V. 5.4.2. Monitoramento químico ... 173 V. 5.4.3. Monitoramento microbiológico ... 176
CAPÍTULO VI - CONSIDERAÇÕES FINAIS E RECOMENDAÇÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 179
VI.6.0CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 180
VI.6.1RECOMENDAÇÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 184
CAPÍTULO VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA ... 185
VII.7.0REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 186
APÊNDICE A - PROTOCOLOS ... 207
PROTOCOLO Nº 1 PARA FRACIONAMENTO DO ÓLEO DA BACIA DO RECÔNCAVO ... 208 PROTOCOLO Nº 2 PARA FRACIONAMENTO DO ÓLEO DA BACIA DE CAMPOS ... 211
PROTOCOLO Nº 3 PARA SELEÇÃO DE FUNGOS DEGRADADORES ... 212 PROTOCOLO Nº 4 PARA SELEÇÃO DE FUNGOS DEGRADADORES ... 215 PROTOCOLO Nº 5 PARA SELEÇÃO DE FUNGOS DEGRADADORES CRESCIMENTO RADIAL ... 218 PROTOCOLO Nº 6 PARA FORMAÇÃO E CRESCIMENTO DOS CONSÓRCIOS ... 221 PROTOCOLO Nº 7 PARA MICROCULTIVO ... 223
PROTOCOLO Nº 8 PARA CONTAGEM DE ESPOROS ... 225 PROTOCOLO Nº 9 PARA TESTE DE ANTAGONISMO ... 227
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO GERAL E
OBJETIVOS
26
Apresentação do Trabalho
Este trabalho está disposto em capítulos, com a seguinte ordem: Capítulo I –
Introdução geral e objetivos; Capítulo II – Área de Amostragem; Capítulo III –
Estado da Arte; Capítulo IV – Materiais e Métodos; Capítulo V – Resultados e
Discussão; Capítulo VI - Considerações finais e Recomendações Futuras; Capítulo
VII - Referências Bibliográficas. Cada Capítulo apresenta as seguintes composições: Capítulo I - Nesse capítulo será apresentado A introdução geral à pesquisa
contendo Objetivos - Gerais e Específicos;
Capítulo II – Será descrita a área de amostragem - Localização e situação da área
de estudo.
Capítulo III – Nesse capítulo será abordado o Estado da Arte com os principais
temas relacionados com a investigação científica realizada. Biorremediação e seus
processos, composição química do petróleo, principais microrganismos
degradadores de petróleo e biodegradação por microrganismos.
Capítulo IV – Serão demonstrados os materiais e métodos adotados: amostragem;
Metodologia de montagem do experimento; metodologias de simulação; metodologia de retirada de amostras; monitoramento das unidades de simulação; procedimentos analíticos.
Capítulo V - Nesse capítulo serão apresentadas as discussões dos resultados
obtidos ao longo de cada experimento. Resultados de análises físicas, químicas,
geoquímicas e biológicas.
Capítulo VI – Esse capítulo apresentará as considerações finais do trabalho e as
sugestões para pesquisas futuras.
Capítulo VII – Nesse capítulo serão apresentadas todas as referências utilizadas
para a construção deste trabalho.
Neste trabalho também serão apresentados em Apêndice, os protocolos desenvolvidos ao longo da pesquisa.
I.1.0 INTRODUÇÃO
O desenvolvimento populacional e o avanço da industrialização, principalmente da cadeia produtiva do petróleo, tem levado inevitavelmente ao aumento do impacto antropogênico na biosfera. São diferentes as fontes de petróleo necessárias para atender a demanda mundial, por isso o processamento, armazenamento e transporte são constantes. Em consequência, derramamentos de petróleo, são uma das principais causas de poluição da água e do solo (RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ et al, 2006; TABARI; TABARI, 2010; SONAWDEKAR, 2012).
Derramamentos de óleo no mar, especialmente acidentes em grande escala, têm trazido ameaças e tem causado grandes danos ao ambiente marinho costeiro dentre esses a destruição do “habitat” de animais e plantas aquáticas, bem como a devastação de toda a fauna e flora circundante, além de trazer sérios riscos a saúde para dos habitantes locais (VENOSA; ZHU, 2006; DIAS, 2007).
Atualmente, os métodos mais comuns que visam lidar com a contaminação por hidrocarbonetos são físicos, químicos ou de natureza mecânica, evaporação e dispersão. Porém essas tecnologias são muito dispendiosas e podem levar a incompleta decomposição de contaminantes (SONAWDEKAR, 2012). Métodos biológicos, denominados de biorremediação, têm se destacado ao longo dos últimos anos como uma solução efetiva para a eliminação de diversos poluentes, entre eles os produtos do petróleo, óleo bruto e graxas. Estes métodos são favorecidos por serem ecologicamente corretos, mais limpos, com custos baixos e de mais fácil aplicação em grande escala, além de não alterarem o equilíbrio dos ecossistemas (YEUNG et al., 1997).
A persistência de um poluente no ambiente é influenciada pela natureza do contaminante e pela interação entre as características biológicas, químicas, geológicas e físicas do local contaminado (KOUL, 2013). Em teoria, solos e sedimentos contaminados com esses compostos podem ser tratados utilizando diferentes estratégias de limpeza. A biorremediação tem sido reconhecida como um dos métodos menos invasivos e tem se mostrado uma ferramenta eficaz para o tratamento de derrames de petróleo, sendo uma modalidade promissora para a minimização ou até extinção das concentrações desses compostos (LIMA, 2010).
No entanto, muitas estratégias propostas têm sérios problemas econômicos e de viabilidade. Os benefícios potenciais desses trabalhos poderiam incluir redução dos custos de tratamento, uma melhor avaliação e concepção de tecnologias de limpeza, regulação e uma maior aceitação pública do processo tecnológico empregado.
A biorremediação, definida como um processo natural onde se utiliza microrganismos para desintoxicar ou remover os poluentes, devido as suas diversas capacidades metabólicas, é um método promissor para a remoção e degradação dos diversos poluentes ambientais, incluindo os produtos das indústrias de petróleo (MEDINA; BELLVER, 2005; KOUL, 2013). Além disso, acredita-se que a tecnologia de biorremediação é menos invasiva e relativamente eficiente (APRIL, 1999). A biorremediação que utiliza comunidades indígenas de microrganismos constitui um dos principais mecanismos pelos quais o petróleo e outros hidrocarbonetos contaminantes podem ser removidos, além de ser uma tecnologia de baixo custo em relação a outras de recuperação (LEAHY;COLWELL, 1990; ULRICI, 2000; KOUL, 2013).
Essa tecnologia parte da premissa de que grande parte dos componentes do petróleo são biodegradáveis na natureza, onde os microrganismos utilizam como principal fonte de carbono os hidrocarbonetos em seus processos metabólicos, podendo ocorrer em condições anaeróbicas e aeróbicas (ATLAS, 1981, 1984; ROSA, 2001; MARIANO, 2006).
No entanto, esse processo natural pode ser acelerado pela utilização da bioestimulação e/ou da bioaumentação. Na bioestimulação, nutrientes são adicionados e as condições ambientais otimizadas, visando o desenvolvimento de populações nativas de microrganismos (FENIMAN et al., 2009). Aditivos nutricionais são agentes de biorremediação, um dos meios primários para aumentar a taxa de crescimento de microrganismos que degradam petróleo. Este tipo de agente tem a intenção de aumentar a biomassa que degrada o óleo já presente em uma área afetada para um nível onde o petróleo irá ser utilizado como fonte primária de alimentos ou energia. O ambiente natural não tem nutrientes suficientes para estimular o metabolismo e crescimento dos microrganismos. Por conseguinte, é necessários proporcionar nutrientes para manter ou aumentar a atividade microbiana e a biodegradação natural (PEDIGO et al., 2011).
Pela bioaumentação, são adicionados microrganismos capazes de degradar rapidamente os contaminantes específicos (FENIMAN et al., 2009). Em alguns casos, os microrganismos podem ser colonizados em biorreatores. Todos os agentes comercialmente disponíveis usam naturalmente os microrganismos. Alguns agentes podem também conter nutrientes para assegurar a atividade das suas culturas microbianas. Os agentes microbianos são projetados para aumentar a biodegradação de petróleo, em qualquer localização e seria muito útil em zonas onde a população de degradadores de petróleo indígenas é pequena (PEDIGO et al., 2011).
Muitos microrganismos indígenas da água e do solo são capazes de degradar hidrocarbonetos contaminantes (KUMARI et al., 2013). Portanto não é restrita a apenas alguns gêneros de microrganismos, pois vários grupos de bactérias, fungos, algas e algumas cianobactérias têm mostrado possuir essa capacidade (KATAOKA, 2001; MARIANO, 2006). Leahy e Colwell (1990) citam os seguintes gêneros de bactérias como os mais importantes: Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes,
Arthobacter, Bacillus flavobacterium, Nocardia e Pseudomonas.
Riser-Roberts (1992) cita como as principais espécies que assimilam hidrocarbonetos os fungos do gênero Aspergillus e Penicillium. Contudo, esta característica é uma propriedade individual da espécie e não necessariamente uma característica particular do gênero. Dentre os gêneros de cianobactérias e algas destaca-se: Oscillatoria, Microcoleus, Anabaena, Nostoc, Chlorella, Chlamydomonas e Ulva (ATLAS, 1981).
O petróleo é considerado como uma mistura complexa onde dentre os principais componentes encontra-se os alcanos, aromáticos e naftênicos, que podem ser degradados por microrganismos (KIRCHMANN; EWNETU, 1998). No entanto, o que se observa é que uma única espécie isoladamente não consegue degradar todos os componentes do petróleo, e que sob condições favoráveis um microrganismo consegue degradar um tipo ou uns poucos componentes ao mesmo tempo (KORDA et al., 1997).
Na segunda metade do século XX, inúmeros acidentes ambientais envolvendo derrames de óleo ocorreram na região norte da Baía de Todos os Santos, Bahia, atingindo os manguezais da localidade. Depois de cinquenta anos de convívio com derrames e vazamentos de óleo e derivados, a região é apontada pela literatura especializada como uma área contaminada por hidrocarbonetos de
petróleo. Com isso vários estudos vem sendo desenvolvidos na tentativa de minimizar os efeitos causados por essas contaminações (VEIGA, 2003).
Diversos trabalhos (SANTANA, 2008; LIMA, 2010; MOREIRA, 2011), desenvolvidos em áreas contaminadas da Baía de Todos os Santos obtiveram bons resultados, mas observou-se também a necessidade de se fazer ajustes para que os resultados fossem mais satisfatórios quanto à degradação do óleo total. Verificou-se, nesses trabalhos, que algumas frações dos hidrocarbonetos não haviam sido degradadas, a exemplo dos biomarcadores (hidrocarbonetos cíclicos saturados), ou hidrocarbonetos aromáticos, e de uma forma constante a não degradação da fração das resinas e asfaltenos.
A finalidade de fracionar o óleo em compostos saturados, aromáticos e NSO (resinas e asfaltenos) através de cromatografia líquida, contaminar o sedimento limpo, em experimento de bancada, com cada fração separadamente com o intuito de obter microrganismos (fungos) adequados e específicos para tal degradação, é a principal justificativa desta pesquisa. A este aspecto alia-se a necessidade verificada internacionalmente da identificação e isolamento dos microrganismos para possível formação de um consórcio capaz de degradar o óleo total, melhorando desta forma os resultados da biorremediação.
Segundo Rambeloarisoa et al.(1984), Cookson (1995), Chhatre et al. (1996), Tanodebrah et al. (1999) e Venosa et al. (1999), para que ocorra a biodegradação total se faz necessário uma assembléia ou pool de microrganismos capazes de degradar todos os compostos contidos no petróleo e com isso várias pesquisas internacionais têm proposto a utilização de culturas mistas para fins de biorremediação.
I.1.1 OBJETIVOS
I.1.1.1 Objetivo Geral
O presente trabalho tem como objetivo avaliar os processos geoquímicos e a eficiência de consórcios fúngicos em testes de simulação da biorremediação em sedimento de manguezal, contaminados por dois tipos de óleos (óleo da bacia do Recôncavo e óleo da bacia de Campos).
I.1.1.2 Objetivos Específicos
Determinar a concentração de nutrientes: nitrogênio total e fósforo em
sedimento;
Monitorar os parâmetros físico-químicos, não conservativos em água:
temperatura, oxigênio dissolvido (O.D.), pH, EH e salinidade, durante todo o
experimento;
Simular derrames de frações do óleo (Saturados, Aromáticos e NSO) em
substrato de manguezal;
Monitorar a degradação dos hidrocarbonetos em sedimentos através de
técnicas cromatográficas;
Monitorar a dinâmica da comunidade microbiana (quantificação de fungos e
bactérias) para cada uma das simulações realizadas;
Isolar e verificar a capacidade dos fungos em degradar as frações do óleo;
Obter consórcios de fungos capazes de degradar o óleo total;
Imobilizar os consórcios fúngicos;
Testar a fibra de coco e a folha de manguezal como aditivos estruturante e
nutricionais;
Monitorar a eficiência dos consórcios fúngicos na degradação do óleo da
bacia do Recôncavo em biorreatores de imersão temporária;
Monitorar a eficiência dos consórcios fúngicos na degradação de dois tipos
de óleo (bacia do Recôncavo e bacia de Campos) em condições laboratoriais.
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II. 2.0 LOCALIZAÇÃO E SITUAÇÃO DA ÁREA DE AMOSTRAGEM
A área de amostragem é representativa do ecossistema manguezal e está localizada nas cercanias do rio São Paulo (Figura 1) o qual deságua na Baía de Todos os Santos (BTS), Bahia, município de São Francisco do Conde, próximo à estação Pedra Branca, nas coordenadas 12º 44’ 26,0”(S) e 38º 31’ 53,9” (W).
Figura 1 – Imagem de satélite do trecho do rio São Paulo (próximo a sua foz) localizado no município
de São Francisco do Conde, Bahia e área de coleta
Fonte: modificado de Google Earth, 2014
A área fica compreendida nos limites dos municípios de Madre de Deus, Candeias e São Francisco do Conde. A principal via de acesso à região, a partir de Salvador, é através da BR-324, onde no entroncamento com a BA-522 se toma a direção para Candeia; em seguida segue-se na direção contínua nordeste da BA-522 pela vicinal. Chegando à Refinaria Landulpho Alves (RLAM). Ao acesso à esquerda segue-se até chegar à área de estudo que se encontra sinalizada por placa indicativa e está localizada mais especificamente nas proximidades da Estação de Produção da JO-BA (Petrobras) denominada “Estação Pedra Branca”, com uma área de aproximadamente 10km² a NW de Salvador (Figura 2). A RLAM que está instalada na região desde a década de 1950, é responsável por diversas atividades ligadas à indústria petrolífera (campo de produção, refinaria, porto).
Rio São Paulo
Figura 2 - Mapa de situação e localização da área de estudo. a) Mapa de situação da BTS; b)
imagem de satélite da área em destaque de amarelo
550456 550226 548384 8593473 8595374 548473 8593359 8595317 548473 8593359
Fonte: (a) Modificado da folha da Baía de Todos os Santos: SD-24-X-A-IV (BAHIA, 2004); (b) Google Earth, 2014)
Declinação M agnética Variação M agnética Cresce 5' anualm ente
NM NV Legenda C o n tin e n te Ma r D re n a g e n s Estra d a s C id a d e s Áre a d e Estu d o 27 (a) (b)
II.3.0 PETRÓLEO E SUA COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Os hidrocarbonetos são os principais constituintes do petróleo, estes são compostos orgânicos formados por hidrogênio e carbono. A composição química e a natureza física do petróleo podem variar em função das características: matéria orgânica original; grau de evolução térmica da rocha geradora e estado de biodegradação do óleo; e fracionamento sofrido durante a migração até a rocha reservatório; entre outras (IARC, 1989). Os principais grupos de hidrocarbonetos presentes em frações leves, médias e pesadas são n-alcanos, naftênicos, hidrocarbonetos aromáticos, resinas e asfaltenos (PETERS et al., 2005).
Fração dos Hidrocarbonetos Saturados
As principais famílias dos hidrocarbonetos saturados são os n-alcanos, alguns isoprenóides (pristano e fitano) (Figura 3), terpanóides (hopanos) e derivados de esteróides (esteranos) (KASSIM; SIMONEIT, 2001).
Figura 3 - Estruturas dos isoprenóides: (a) pristano e (b) fitano
Fonte: SANTOS, 2008
Os alcanos são hidrocarbonetos de cadeia aberta e saturada que apresentam somente ligação simples entre os átomos de carbono, e também são conhecidos como parafinas normais (BENTO, 2005).
Já os isoprenóides são hidrocarbonetos parafínicos que apresentam ramificação em um ou mais átomos de carbono. Esse grupo apresenta uma grande importância nos estudos geoquímicos (TISSOT; WELTE, 1984; HUNT, 1995).
Fração dos Hidrocarbonetos Aromáticos (HPAs)
Os hidrocarbonetos aromáticos são compostos orgânicos que possuem alternadamente ligações carbono-carbono simples e dupla em uma estrutura cíclica com seis átomos de carbono (Figura 4) (WAPLES, 1981). Os HPAs compreendem de dois a sete anéis aromáticos condensados ou fundidos (KENNISH, 1991). O composto mais simples dessa classe é o benzeno que aparentemente é apenas um composto insaturado cíclico contendo várias duplas ligações, mas na verdade é notavelmente estável e quimicamente bastante diferente dos compostos insaturados (BARKER, 1979; WAPLES, 1981).
O anel benzênico pode ligar-se a outros anéis formando anéis aromáticos polinucleares; juntar-se a anéis saturados formando compostos cicloaromáticos; ou pode também ligar-se a cadeias lineares formando alquilaromáticos. Os compostos aromáticos possuem baixo conteúdo de hidrogênio e isso é comprovado quando se compara benzeno com a parafina normal cíclica de carbonos (BARKER, 1979).
Figura 4 - Estruturas dos hidrocarbonetos aromáticos (a) antraceno e (b) fenantreno
Fonte: NEILSON; ALLARD (2007)
Uma das principais características dos compostos aromáticos está relacionada à sua elevada estabilidade química, quando comparada a de outros compostos insaturados, que está associada à habilidade dos elétrons que participam das ligações ocuparem uma extensa região do anel (ATKINS, 2000). Os HPAs com dois e três anéis (baixo peso molecular) têm uma alta toxicidade, enquanto que alguns HPAs com quatro a seis anéis (alto peso molecular) são potencialmente
carcinogênicos, mutagênicos e teratogênicos (NEFF, 1979; WITT, 1995; KENNISH, 1991; SANTOS, 2008).
Compostos polares (NSO)
Quando o esqueleto básico da molécula de um composto de petróleo é formado de um hidrocarboneto contendo heteroátomos como: enxofre, nitrogênio (Figura 5) e oxigênio; são conhecidos como a fração de não-hidrocarbonetos (NSO). Estes compostos estão presentes nas frações de asfaltenos e resinas (TISSOT; WELTE, 1984; HUNT, 1996).
Na composição química dos NSO também podem ser encontradas substâncias que possuem carbonos ligados a metais (C-metal) em pequenas quantidades (ALLINGER et al., 1976), e entre eles predominam o níquel e o vanádio. Outros metais como ferro, zinco, cobre, chumbo, arsênio, molibdênio, cobalto, manganês e cromo também são encontrados, porém em menores concentrações (TISSOT; WELTE, 1978).
Figura 5 - Estrutura de compostos polares contendo nitrogênio. 2-cloro-6-triclorometilpireno
Fonte: NEILSON; ALLARD (2007)
III. 3.1 BIODEGRADAÇÃO DE HIDROCARBONETOS
Além de ser constituído de uma mistura de hidrocarbonetos, o petróleo possui em sua constituição outros compostos orgânicos, principalmente níquel e vanádio (constituintes organometálicos complexados) (VAN HAMME et al., 2003), produtos difíceis de serem degradados.
