Tipagem Genética

4.2.1. Extração de DNA

O método extração de DNA foi adaptado do protocolo de Moreira et al. (2005). Resumidamente, os isolados obtidos foram semeados em 10mL do meio MRS líquido em tubos Falcon™ de 15mL. As células foram centrifugadas por 10min a 4.000 rpm, e o sedimento celular foi ressuspenso em 1ml de LiCl 5M, transferidos para microtubos de 1,5mL e incubados por 1h sob agitação constante. Após incubação, as células foram centrifugadas a 4.000 rpm em microcentrífuga de bancada. O sedimento foi ressuspenso em 1ml do tampão TE10 (Tris 50mM, EDTA

10mM, pH 8,0) acrescido de 3 L de solução de lisozima (10mg/mL) e incubados por 1h e posteriormente centrifugados por 10min a 4.000 rpm. O sedimento foi novamente ressuspensos em TE10 (540 µL) acrescido de 60µL de solução de SDS

(10%) para permitir a lise celular (entre cada fase de ressuspensão o sedimento foi lavado em água mili-Q).

Os tubos foram centrifugados mais uma vez e o sobrenadante foi transferido para outro microtubo onde foi acrescido de clorofane (fenol-clorofórmio + álcool isoamílico, 1:1) na quantidade de 600μL por microtubo e centrifugado por 10min a 14.000 rpm, ao sobrenadante retirado e transferido para um novo microtubo onde foi acrescido 600μL de clorofil (clorofórmio-álcool isoamílico, 24:1). O DNA foi precipitado em 600μL de álcool isopropanol 100%, centrifugado a 4°C a 14.000 rpm por 30min. Mais uma vez ressuspendido em 500μL de etanol 70% e centrifugado a 4°C a 14.000 rpm por 10min e, por fim ressuspendido em 100μL de água estéril.

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4.2.2. ARDRA-PCR

A amplificação da região espaçadora 16S-23S do gene do rRNA seguiu o protocolo descrito por Moreira et al. (2005), utilizando o primer 16-1A, e o primer 23- 1B, (Tabela 2) (Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997).

Para a amplificação realizou-se uma reação em cadeia da polimerase (PCR) com as seguintes condições: 10pmol de cada primer, 0,2 mM de cada dNTP, tampão de reação (1X), com 1,5mM de MgCl2 e 5U de Taq DNA polimerase

(Invitrogen Life Technologies) para um volume final de 50µL. A amplificação consistiu de um ciclo de desnaturação de 2 minutos a 94°C, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 30seg, anelamento a 55°C por 1min, extensão a 72°C por 1min e extensão final a 72°C por 10min. Os produtos da amplificação foram separados em gel de agarose 1,4% submetidos a 5 V/cm por 45min em tampão TBE 0,5X, corados em brometo de etídeo, e visualizados em transiluminador ultravioleta.

Os produtos de amplificação foram digeridos com 12 enzimas de restrição (SphI, NcoI, NheI, SspI, SfuI, EcoRV, DraI, VspI, HincII, EcoRI, HindIII, AvrII) (Fermentas) e os fragmentos de digestão foram separados em gel de agarose 1,4% submetidos a 5 V/cm por 45min em tampão TBE 0,5X, corados em brometo de etídeo, e visualizados em transiluminador ultravioleta. Os produtos de digestão foram comparados com o banco de dados genéticos descrito por Moreira et al. (2005) (Anexo 1).

4.2.3. rep-PCR

Para realizar a reação de amplificação dos elementos repetitivos do DNA foi utilizado primer (GTG)5 segundo Lucena et al. (2010). Na reação de amplificação foi

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utilizado 0,2 pmol do primer (GTG)5; 0,2 mM de dNTP; 3 mM MgCl2; 0,025 µg/µL de

BSA (Bovine Serum Albumin - soro de albumina bovina)e 1 U Taq polimerase (Invitrogen). O programa de amplificação foi composto por um período de desnaturação a 95°C por 7min, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1min, anelamento a 40°C por 1min, extensão a 65ºC por 8min seguidos por um período de extensão final de 16min. O produto da PCR foi separado em gel de agarose 1,5% submetido a 5 V/cm em tampão TBE 0,5X, corado em brometo de etídeo. As imagens do foram capturadas usando um sistema de captura de imagens PhotoCapture™. A similaridade entre os padrões de amplificações foram determinadas através de análises visuais das imagens.

4.2.4. Sequênciamento dos genes 16S rRNA e pheS

O gene 16S rRNA foi amplificado por PCR utilizando os primers 27F e 519R, desenhados para o anelamento nas extremidades do gene e amplamente utilizados, que amplificam um fragmento de aproximadamente 492 pb (Hauben et al. 2005) (Tabela 1). O programa térmico consistiu de 1 ciclo de desnaturação a 95°C por 3 minutos, seguidos por 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1min; anelamento a 51°C por 1min e 30s; extensão a 72°C por 3min e uma extensão final a 72°C por 30min no termociclador Biocycler (MJ96+).

Para o gene pheS foram utilizados os primers 21-F, e 22-R ou 23-R (Tabela 2) (Naser et al. 2005b). As reações para amplificações foram feitas utilizando 0,5 µM de cada primer, 0.2 mM de cada dNTP, tampão de reação (1X) com 1,5 nM de MgCl2 e 1U de Taq polimerase (Invitrogen). As amplificações foram feitas em no

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minutos a 95°C, seguidos por 3 ciclos de desnaturação 95°C por 1 minuto, anelamento a 46°C por 2 minutos e 15 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e 15 segundos e 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 35 segundos, anelamento a 46°C por 1 minuto e 15 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto e 15 segundos, e uma extensão final de 7 minutos a 72°C.

Os produtos da PCR foram purificados com o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Cerca de 50 a 100 ng do produto da purificação foram misturados com a reação de marcação BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), seguindo as instruções do fabricante na presença de um dos primers descritos na concentração de 1,2µM. O sequênciamento foi realizado na Plataforma Genômica do Laboratório Central do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, utilizando o sequenciador 3500 Genetic Analyser (Applied Biosystems - USA). A verificação da qualidade das sequências geradas foi feita pelo programa Sequencing Analysis (Applied Biosystems), que gerou arquivos com o eletroferograma de cada sequência.

Inicialmente as sequências fora editadas através do programa Pregap4 pertencentes ao Standen Package (Standen, 1998) e submetidas à busca de similaridade no banco de dados do NCBI, utilizando a ferramenta Blast N (Altschul et

al., 1997). A identificação bacteriana foi assumida se a sequência de consulta

mostrou similaridade >90% com a sequência de nucleotídeos da linhagem tipo para o gene pheS (Naser et al., 2007) e similaridade > 97% para o gene 16S (Gevers et

al., 2005).

Após a edição foi feito o alinhamento múltiplo utilizando a ferramenta ClustalW do programa MEGA 4 (Tamura et al., 2007), que também foi utilizado para a construção e visualização das árvores filogenéticas geradas. Os agrupamentos

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baseados nas inferências filogenéticas foram construídos aplicando o algoritmo Neighbour-Joining (Saitou e Nei, 1987) com testes estatísticos de bootstrap com 2000 replicações.

Tabela 2. Primers utilizados nas reações de PCR e sequenciamentos.

Primer Sequência (5'→3')a Posição Referencia

16-1A GTCGGAATCGCTAGTAATCG 1361b Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997 23-1B GGGTTCCCCCATTCGGA 127 b Tilsala-Timisjarvi e Alatossava, 1997 21-F CAYCCNGCHCGYGAYATGC 557 c Naser et al. 2005b

22-R CCWARVCCRAARGCAAARCC 1031c Naser et al. 2005b 23-R GGRTGRACCATVCCNGCHCC 968c Naser et al. 2005b 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 8-27c Hauben et al. 2005 519R GTATTACCGCGGCTGCTG 536-519c Hauben et al. 2005

a

Y:C ou T; N:A,C,G ou T; H:A, C ou T; W:A ou T; R:A ou G; V:A, C ou G

b

Posição de ligação no cromossomo de L. casei

c

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5. Resultados