Leuconostoc mesenteroides

Esta espécie também foi identificada em três das destilarias estudadas (Japungu, Miriri e Trapiche).

Bem como a espécie W. confusa, os isolados de Leuc. Mesenteroides, apresentaram um perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S distintos, apresentando uma única banda com tamanho aproximado de 620pb (Figura 20). O isolado 5 tem o perfil do gênero Weissella.

Através do rep-PCR foi possível analisar seus perfis e verificar que os isolados de destilarias diferentes apresentaram perfis distintos.

Na figura 22 onde mostra o rep-PCR de isolados das destilarias Japungu, Miriri e Trapiche fica evidente a diferença entre os perfis. Os isolados 5, 6 e 7 são os que mais se

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 100pb

Figura 19. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das destilarias Japungu, Miriri e Trapiche

Identificados como W. confusa. (1- TCP7.1.1; 2- JCP7.2.9; 3- JCP7.2.10; 4- JCP7.1.21; 5- MCP7.3.17; 6- MCP7.3.1; 7- MCP7.3.2; 8- MCP7.3.3; 9- MCP7.3.4; 10- MCP7.3.5; 9- MCP7.3.6; 10- MCP7.3.7; 11-

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assemelham entre si onde pode-se dizer que são pertencentes a uma mesma linhagem. Os outros isolados ao que parece são linhagens diferentes de Leuc. mesenteroides.

Figura 21. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das destilarias Japungu e Trapiche

Identificados como Leuc. mesenteroides (100pb Biolabs). (1- MCP7.1.5; 2- JCP7.3.3; 3- JCP7.3.14; 4- JCP7.3.20; 5- TCP7.1.2; 6- TCP7.1.3; 7- TCP7.1.4; 8- TCP7.1.17; 9- TCP7.1; TCP7.1.5)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 100pb

Figura 20. Perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S dos isolados identificados

como pertencentes ao gênero Leuconostoc. Marcador de peso molecular (100pb Biolabs). (1 - TCP7.1.7; 2 - TCP7.1.8; 3 - TCP7.1.9; 4 - TCP7.1.10; 5 - TCP7.1.11). * Isolado

identificado como Weissella confusa

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6. Discussão

Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que LABs são comumente encontradas no processo fermentativo e, que no caldo de partida utilizado por destilarias produtoras de etanol do Nordeste do Brasil há uma predominância das bactérias lácticas pertencentes ao gênero Lactobacillus. Estes resultados são inédito quanto a entrada do substrato no processo fermentativo mas ao mesmo tempo coerentes, pois coincidem com os dados encontrados na literatura onde foram estudados a produção de etanol em destilarias nos Estados Unidos com a utilização do milho como substrato (Skiner and Leathers, 2004) e no Brasil utilizando a cana-de-açúcar (Lucena et al. 2010).

Foram encontradas no caldo de partida seis espécies de lactobacilos, destas destaca-se o L. fermentum, esta espécie é a principal responsável por grandes quedas na produção e rendimento da produção do etanol devido a capacidade que algumas linhagens desta bactéria têm de induzir a floculação e a perda de viabilidade quando em sinergia com cálcio, das leveduras dando origem ao que se chama de "pé-de-cuba" causador de entupimentos de tubulações e centrífugas de separação (Yokoya & Oliva- Neto, 1991; Ludwig et al. 2001), em alguns casos o L. plantarum podem causar o mesmo efeito floculante do L. fermentum dependendo da linhagem e densidade da bactéria no processo (Garcia, 2000; Alcarde, 2001). Outros estudos demonstraram que a queda da concentração final do etanol pode chegar a 17% quando a contaminação chega a 108 CFU/mL de L. fermentum em alguns casos pode se chegar a 22% na queda da produção, aumento do desvio de carboidratos para a produção de glicerol e acido lático, queda de 55% da viabilidade da levedura e redução na formação de massa celular de levedura (Thomas et al., 2001; Bischoff et al., 2008; Beckner et al., 2011).

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No inicio da fermentação o L. fermentum não foi a espécie mais abundante identificada nas destilarias, porém estudo pretéritos mostram que esta espécie tende a ter um aumento com no decorrer da fermentação e que ela é bastante adaptadas as condições do processo.

Além desta, outras espécies de Lactobacillus identificadas neste estudo já haviam sido detectadas no processo fermentativo anteriormente, como: L. nagelii e L.

satsumensis que são organismos versáteis, que possuem um metabolismo

homofermentativo anaeróbico facultativo e com capacidade de fermentar pentoses e hexoses (ribose e arabinose) a acido láctico.

Foi demonstrado por Chin e Ingledew (1994) os efeitos das LAB sobre a S.

cerevisiae pela inoculação de L. fermentum e L. delbrueckii, onde foi verificado uma

queda na viabilidade da levedura.

Também foram identificados os lactobacilos L. delbruekii, L. plantarum e L.

salivarus foram encontrados nas coletas realizadas mas com uma menor frequência, mas

que são comuns na fermentação alcoólica em destilarias do Nordeste do Brasil (Lucena et

al. 2010).

Na descrição da microbiota da tradicional fermentação alcoólica no Vietnã ficou evidente que as LAB tiveram um destaque, onde se destacaram as espécies de LAB

Pediococcus pentosaceus, L. plantarum, L. brevis, W. confusa e W. paramesenteroides.

Além das espécies que são produtoras de amilase (Bacillus subtilis, B. circulans, B.

amyloliquefaciens e B. sporothermodurans), bactérias produtoras de acido acético

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ubonensis, Ralstonia solanacearum e Pelomonas puraquae) foram também detectados

(Thanh et al., 2008).

Existe inúmeros relatos da presença de Leuconostoc (Skinner-Nemec, Nichols & Leathers, 2007; Amorim, 2005; Skinner & Leathers, 2004; Oliva-Neto & Yokoya, 1998), e alguns de Weissella (Passoth, Blonqvist & Schnürer, 2007; Skinner & Leathers, 2004) no processo de produção do bioetanol.

Algumas destas espécies foram comuns na fermentação nas destilarias estudadas, como as W. confusa e W. paramesenteroides. Outras espécies encontradas foram a W.

cibaria esta não havia sido encontrada na fermentação alcoólica.

As espécies do gênero Leuconostoc são facilmente encontrados no inicio da fermentação mas elas raramente causam grandes infecções, por apresentar uma baixa resistência ao etanol. Kaji (1989) simulou uma fermentação mista entre a S. cerevisiae e as bactérias L. fermentum e Leuc. mesenteroides subsp. mesenteroides, apenas os lactobacilos puderam ser recuperados após a fermentação. A causa da não recuperação do Leuconostoc foi atribuída ao efeito inibitório do etanol, que a 3% foi capaz de reduzir a velocidade especifica máxima de crescimento e, em concentrações superiores a 6% houve a interrupção total do crescimento. Lucena (2010) em seus estudos sobre a diversidade genética de bactérias láticas em destilarias de álcool combustível encontrou espécies de Leuconostoc apenas nas primeiras coletas. Os resultados aqui obtidos mostram que estes organismos estão presentes no caldo de partida, porém não permanecem no processo.

Um dado interessante observado nas analises foi a identificação da "espécie"

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apresentaram uma similaridade acima 97% do seu gene 16S com sequências depositadas no Genebank, todavia este nome taxonômico genérico não foi publicado a tempo para a submissão das sequências ao Genebank. A espécie foi descrita por Kim e Kyung (2003) contudo não foi publicado (dados do NCBI).

Nossos dados mostram que a diversidade bacteriana encontra no caldo de partida é composta basicamente por espécies que não permanecem ao longo da fermentação. Portanto espécies como o Leuc. mesenteroides, Leuc. psendomesenteroides, Leuc

citreum, Leuc. garlicum, W. cibaria, W. confusa, W. paramesenteroides, Lac. Lactis, Staphylococcus epidermidis e O. kitaharae que não afetam drasticamente a produção do

bioetanol.

No presente trabalho também foi avaliado a variabilidade intraespecífica de isolados de Leuc. mesenteroides e W. confusa a partir da utilização da técnica de rep- PCR com o uso do primer (GTG)5. Foram escolhidas estas duas espécies por ser estas as

mais bem distribuídas entre as destilarias, as mais abundantes não-lactobacilos e também apresentaram perfis de amplificação da região espaçadora 16S-23S diferentes aos perfis dos lactobacilos (Figuras 19 e 21).Esta técnica foi viável para esta análise intraespecífica dos isolados oriundos do processo fermentativo. O Leuc. mesenteroides é conhecido por produzir dextrana a partir de sacarose (Kaji, 1989) isto ainda não havia sido feito com estas espécies. Nos perfis encontrados claramente foi observado que existem diferentes linhagens de W. confusa, porém os dados são conclusivos pois se trata de um novo achado tendo que ser feito estudo minuciosos sobre o efeito de cada linhagem na fermentação, da mesma forma ocorreu com os isolados de Leuc. mesenteroides, porém se sabe que estas espécies não permanecem no processo por muito tempo por não tolerarem a altas concentrações de etanol.

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7. Conclusões

A diversidade de bactérias presentes no caldo de partida utilizado no processo de fermentação do bioetanol, apresentou o gênero Lactobacillus como o principal contaminante do processo, seguido pelos gêneros Leuconostoc e Weissella.

A técnica de ARDRA, baseada na análise do perfil de digestão da amplificação da região espaçadora 16S-23S, se mostrou efetiva na identificação dos lactobacilos, mas pouco eficaz na identificação de outras espécies devido ao banco de dados que ainda é pequeno. Esta técnica não pode ser utilizada isoladamente para identificação de todas as espécies bacterianas presentes no caldo de cana.

O sequenciamento do gene pheS para a identificação das espécies se mostrou eficaz em apenas alguns casos, pois assim como no caso da ARDRA o banco de sequências depositadas ainda é pequeno. Sendo assim, foi necessário o sequenciamento do gene 16S que foi de maior precisão.

Neste estudo, obtivemos diferentes perfis genotípicos de Leuc, mesenteroides e W.

confusa, com a utilização do rep-PCR, demonstrando que esta técnica pode ser utilizada

como marcador intraespecífico destas espécies. Mais estudos são necessários para uma melhor compreensão do papel de cada linhagem no processo.

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