Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Genética
Billy Manoel dos Santos
Identificação molecular de bactérias lácticas
presentes no caldo de cana-de-açúcar
Recife
2012
Billy Manoel dos Santos
Identificação molecular de bactérias lácticas
presentes no caldo de cana-de-açúcar
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Genética.
Orientador: Marcos Antônio de Morais Júnior Coorientador: Brígida Thays Luckwu de Lucena
Recife
2012
ii
Billy Manoel dos Santos
Identificação molecular de bactérias lácticas
presentes no caldo de cana-de-açúcar
Aprovado em ___/___/____
Banca Examinadora:
____________________________________________
Dr. Marcos Antônio de Morais Júnior
Universidade Federal de Pernambuco
____________________________________________
Dr. Valdir de Queiroz Balbino
Universidade Federal de Pernambuco
____________________________________________
Dra. Brígida Thays Luckwu de Lucena
iii Dedico este trabalho à minha estimada esposa que sempre esteve do meu lado me estimulando a seguir em frente.
iv
Agradecimentos
Agradeço aos meus orientadores, Dr. Marcos Morais e Dra. Brígida Lucena, por confiarem e me introduzir no fascinante mundo da Ciência, por sempre me ajudar quando mais necessitei e por suas amizades que permanecerão para sempre. À minha mãe Irenice Maria dos Santos que me ofereceu a melhor educação que uma pessoa humilde pode dar. Meus familiares e amigos que também me fortaleceram a me aconselharam sempre. meus superiores hierárquicos da Briosa Polícia Militar de Pernambuco, que me apoiaram e, que quando possível me ajudavam para que pudesse concluir o trabalho que comecei.
Sou grato ao meu casal de pastores, Prs. Dawison Alves e Adriana Alves, pelas orações e conselhos.
E por fim, e com certeza o mais importante de todos, o meu Pai, que sempre me aconselhou a andar por caminhos planos, segura na minha mão sempre que necessito e que me deu a vida, e hoje eu vivo em função dEle. Pai é por isto e por muito mais eu Te agradeço, pois até aqui o Senhor me ajudou.
v
Resumo
A indústria alcooleira no Brasil perde anualmente vários milhares de reais devido a episódios de contaminação produzidos por bactérias. Além disso, outros milhares são gastos com o uso de antibióticos industriais para a contenção dessas contaminações. Infelizmente, não há ainda um catálogo completo de informações sobre todas as possíveis espécies bacterianas envolvidas na contaminação industrial, seus efeitos no processo e os fatores que levam a essas contaminações. Com a crescente demanda por fontes de energia renováveis, principalmente o etanol, grandes esforços têm sido feitos para aumentar a sua produção. Este trabalho tem como objetivo principal identificar as bactérias lácticas que entram no processo de fermentação alcoólica através do caldo de cana-de-açúcar com a utilização de ferramentas moleculares para uma rápida e eficiente identificação. Para foram realizadas coletas em quatro destilarias do Nordeste do Brasil durante a safra de 2007/2008. A identificação dos isolados foi realizada através da técnica ARDRA e pela análise do sequenciamento de DNA dos genes pheS e 16S. Os resultados obtidos mostram que os lactobacilos são os principais contaminantes do processo, com o Lactobacillus fermentum se destacando entre as demais. Também foi observado que entram no processo bactérias dos gene Weissella e Leuconostoc, com destaque para a W. confusa e o Leuc. mesenteroides que foram identificadas em três das destilarias estudadas. Além da identificação, os isolados de W. confusa e o Leuc. Mesenteroides foram tipados pelo REP-PCR com o primer (GTG)5. Os
resultados mostraram que, além da diversidade de espécies bacterianas detectadas, existe uma diversidade de linhagens dessas duas principais espécies no processo. A espécie Leuc. mesenteroides tem sido apontada como contaminante em processo de fermentação alcoólica industrial, sendo algumas linhagens capazes de causar a formação de dextrana, podendo causar danos ao processo fermentativo. Desta forma se faz necessário trabalhos futuros com o fim de correlacionar os perfis destas espécies com possíveis danos à fermentação, para que com este conhecimento possa ser criadas novas estratégias de controle destes microorganismos.
Palavras-chave: Lactobacillus, Leuconostoc, Identificação molecular, processo fermentativo, Weissella
vi
Abstract
The alcohol industry in Brazil loses several thousand dollars each year due to episodes of contamination produced by bacteria. In addition, thousands more are spent on the industrial use of antibiotics to contain these contaminants. Unfortunately, there is still no complete catalog of all possible information about bacterial species involved in industrial pollution, its effects on the process and the factors that lead to these contaminants. With the growing demand for renewable energy sources, especially ethanol, great efforts have been made to increase production. This work has as main objective to identify lactic acid bacteria that enter the process of fermentation through the juice sugarcane with the use of molecular tools for rapid and efficient identification. For this, samples were taken at four distilleries in northeastern Brazil during the harvest of 2007/2008. The identification of isolates was performed using the ARDRA technique and analysis of DNA sequencing of the pheS and 16S genes. The results show that lactobacilli are the main contaminants of the process with Lactobacillus fermentum stood out among the others. We also observed that bacteria enter the process of genus Weissella and
Leuconostoc, with emphasis on the W. confused and Leuc. mesenteroides that were
identified in three distilleries studied. Besides identification, the isolates of W. confusa and Leuc. mesenteroides were typed by rep-PCR with the primer (GTG)5. The results
showed that, in addition to the variety of bacterial species found, there are several lines of these two major species in the process. The species Leuc. mesenteroides has been identified as a contaminant in industrial fermentation process, some strains can cause the formation of dextran, causing damage to the process. Thus further work is required in order to correlate the profiles of these species with possible damage to the fermentation, so that this knowledge can be created new control strategies such microorganisms.
Key words: Lactobacillus, Leuconostoc, molecular identification, fermentative
vii
Lista de Figuras
Item Página
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de três importantes representantes
das bactérias lácticas
11
Figura 2. Mapa físico da região 16S-23S ITS do rDNA típico do gênero Lactobacillus
21
Figura 3. Amplificação da região espaçadora 16S-23S do agrupamento
de genes de rDNA das amostras de bactérias lácticas da Fermentec Ltda
22
Figura 4. Árvore filogenética feita a partir de sequências do gene
16S mostrando a posição do Lactobacillus hammesii sp. nov. strains LP38T e LP39 entre alguns lactobacilli
25
Figura 5. Gêneros de LAB encontrados no caldo de cana das
destilarias Japungu, Miriri e Giasa durante a safra 2007/2008.
37
Figura 6. Distribuição percentual das espécies de bactérias lácticas
identificadas utilizando as técnicas de ARDRA e sequênciamento do genes 16S e pheS.
38
Figura 7. Bactérias lácticas identificadas a partir da análise do perfil de
restrição do rDNA amplificado ARDRA.
39
Figura 8. Bactérias Lácticas identificadas a partir da análise de
sequências do gene 16S
40
Figura 9. Árvore filogenética construída a partir do gene pheS utilizando
o método Neighbour-Joining dos isolados da destilaria Giasa.
40
viii
durante a safra 2007/2008
Figura 11. Bactérias lácticas identificadas pela análise do perfil de
digestão do rDNA amplificado.
42
Figura 12. Dinâmica da população bacteriana da destilaria Japungu
durante a safra 2007/2008
44
Figura 13. Árvore filogenética construída a partir das sequências de
nucleotídeos do gene 16S dos isolados encontrados no caldo de cana da destilaria Japungu durante a safra de 2007/2008.
46
Figura 14. Bactérias lácticas identificadas pela análise do perfil de
digestão do rDNA amplificado.
47
Figura 15. Diversidade da população bacteriana presente no caldo de
cana da destilaria Miriri durante a safra 2007/2008.
49
Figura 16. Árvore filogenética construída a partir das sequências do
gene 16S dos isolados da destilaria Miriri
50
Figura 17. Árvore filogenética construída a partir das sequências do
gene 16S dos isolados da destilaria Trapiche.
52
Figura 18. Perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S dos
isolados identificados como pertencentes ao gênero Weissella.
53
Figura 19. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das
destilarias Japungu, Miriri e Trapiche Identificados como W. confusa
55
Figura 20. Perfil de amplificação da região espaçadora 16S-23S dos
isolados identificados como pertencentes ao gênero Leuconostoc.
56
Figura 21. Perfis representativos de rep-PCR dos isolados das
destilarias Japungu e Trapiche Identificados como Leuc. mesenteroides 56
ix
Lista de Tabelas
Tabela 1. Contaminantes bacterianos encontrados na Fermentação
Etanólica.
8
Tabela 2. Primers utilizados nas reações de PCR e sequenciamentos. 36
Tabela 3. Isolados identificados a partir do sequenciamento dos genes
16S e pheS
41
Tabela 4. Isolados identificados através da análise das sequências
parciais dos genes 16S e pheS durante a safra 2007/2008.
43
Tabela 5. Isolados identificados a partir do sequenciamento dos genes
16S e pheS oriundos da destilaria Miriri durante a safra 2007/2008
48
Tabela 6. Isolados identificados a partir do sequenciamento dos genes
16S e pheS encontrados no caldo de partida da destilaria Trapiche.
x
Lista de Abreviaturas
Item Definição
AAB Bactéria Acido Acético
AFLP Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados ARDRA Análise de Restrição de DNA Ribossomal Amplificado
BSA Albumina de Soro Bovino DDH Hibridização DNA-DNA DNA Ácido Desoxirribonucleico
ISR Região Espaçadora Intergênica ITS Regiões Espaçadoras Intergênicas LAB Bactéria ácido láctica
MLSA Análise de Sequências de Multiplos Loci) PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PFGE Eletroforese em Campo Pulsátil
RAPD Amplificação Aleatória do DNA Polimórfico REA Análise de Enzimas de Restrição
rep-PCR Amplificação de elementos de DNA repetitivos bacteriano rRNA Ácido Ribonucleico Ribossomal
tRNA Ácido Ribonucleico transportador UFC Unidade Formadora de Colônia
xi
Sumário
Item+ Pagina
Resumo v
Abstract vi
Lista de Ilustrações vii
Lista de tabelas ix
Lista de abreviaturas x
1. Introdução 1
2. Revisão da Literatura 3
2.1 Fermentação Alcoólica 3
2.2 Contaminantes bacterianos do processo de produção do etanol 4 2.3. Bactérias Lácticas (Lactic Acid Bacteria-LAB) 10 2.4. Identificação e Tipagem Genética 15
2.4.1. Perfil de plasmidial 16
2.4.2. Eletroforese em campo pulsátil (PFGE) 17 2.4.3. Amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD) 17 2.4.4. Análise de enzimas de restrição (REA) 18
2.4.5. Ribotipagem 18
2.4.6. Análise de Restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA) 19
2.4.7. Sequênciamento de DNA 23
2.4.8. Rep-PCR 27
3. Objetivos 30
xii
3.2. Objetivos específicos 30
4. Material e Métodos 31
4.1. Isolamento, manutenção e identificação bacteriana 31 4.1.1 Isolamento e purificação das Culturas 31
4.2. Tipagem Genética 32
4.2.1. Extração de DNA 32
4.2.2. ARDRA-PCR 33
4.2.3. Rep-PCR 33
4.2.4. Sequênciamento dos genes 16S rRNA e pheS 34
5. Resultados 37
5.1. Análise Molecular das Bactérias isoladas do Caldo de Cana 37
5.1.1. Destilaria Giasa 39
5.1.2. Destilaria Japungu 42
5.1.3. Destilaria Miriri 47
5.1.4. Destilaria Trapiche 51
5.2. Análise Intraespecífica dos isolados 53
5.2.1. Weissella confusa 53 5.2.2. Leuconostoc mesenteroides 55 6. Discussão 57 7. Conclusões 61 8. Referências Bibliográficas 62 9. Anexos 73 10. Curriculum Lattes 84
1. Introdução
No Brasil o processo de produção do etanol se dá através da fermentação do caldo e/ou melaço de cana-de-açúcar pela levedura Saccharomyces cerevisiae, a mesma levedura que é utilizada na indústria da panificação. Curiosamente este processo ocorre em ambientes com baixa assepsia, que propiciam a contaminação por vários microrganismos, ocorrendo a entrada de bactérias e/ou a contaminação por outras espécies de leveduras, que são chamados de microrganismos selvagens. Estes podem promover episódios de contaminações que resultam numa queda na taxa de produção do etanol, consequentemente uma redução no rendimento industrial.
As contaminações bacterianas, observadas no processo de fermentação do etanol, são apontadas como sendo as principais causas para a queda da viabilidade, do crescimento das leveduras e as que causam maiores prejuízos para a industria, proporcionando uma diminuição na produção do etanol. As bactérias lácticas (Lactic Acid Bacteria – LAB) se destacam como sendo os principais contaminantes bacterianos do processo, fermentando o carboidrato a ácido láctico e a ácido acético em pequenas quantidades, estes metabólitos diminuem o rendimento do etanol pela inibição da fermentação, principalmente pela ação do ácido láctico. Além disso, o estresse celular pelo qual as leveduras são submetidas faz com que excretem nutrientes para o meio, tais como, adenina, guanina, ácido aspártico e nicótico, triptofano, glicina e lisina, que podem estimular o crescimento bacteriano, agindo como um processo de feedback para os episódios de contaminação.
Grandes perdas econômicas causadas pela queda do rendimento do etanol proveniente das contaminações por bactérias são observadas. Isto ocorre devido
2
aos gastos com o controle dos episódios de contaminações quanto, quanto a redução da produção efetiva do etanol.
A identificação das espécies de LAB que entram no processo de fermentação é de fundamental importância para a criação de uma base de dados para um maior conhecimento da complexa microbiota do processo de produção do etanol. E a partir destas informações buscar maneiras para um controle mais eficaz dos episódios de contaminações para que haja um aumento na produção de etanol.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Fermentação Alcoólica
O processo de fermentação industrial para a produção de álcool combustível ocorre através de dois processos: a) o processo de batelada alimentada (fed-batch) no qual toda fermentação se processa em dornas individuais com recuperação do fermento e sua reutilização em fermentações posteriores e; b) o processo continuo, que consiste na fermentação através de dornas interligadas nas quais a fermentação ocorre gradualmente em vários estágios, nesse processo também ocorre a reutilização do fermento, pois o mesmo retorna a dorna inicial depois de centrifugado juntamente com o mosto para realimentação do processo (Wheals et al., 1999; Silva-Filho, 2003).
As espécie de leveduras comumente utilizadas para fermentar açucares são
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Schizasaccharomyces pombe
e Kluyveromyces sp. (Kosaric et al. 1983). Sendo a S. cerevisiae que eram utilizada na industria da panificação. Estas se constituem um bom fermento por serem mais tolerantes a mudanças das condições do meio. Porém estas não são mais utilizadas pois durante o processo pois perdem sua viabilidade rapidamente, permanecendo por poucas gerações, causando instabilidade que oferece condições para organismos oportunistas se estabelecerem no processo, tais como outras leveduras e diversos outros tipos de bactérias (Basso et al., 2008).
Para aumentar o desempenho e a longevidade das células de leveduras no processo fermentativo se passou a usar as células de leveduras provenientes do próprio processo de fermentação alcoólica. Esta medida fez reduzir o risco de
4
contaminações por organismos indesejáveis pois estas são mais resistentes e apresentam maior rendimento de etanol (Basso et al. 1993; Basso e Amorim, 1996).
Apesar da utilização de células de leveduras obtidas diretamente da fermentação ainda ocorre contaminação do processo. Silva-Filho et al. observou que durante o processo fermentativo linhagens de leveduras introduzidas pelo substrato não estéril substituíram as leveduras introduzidas no começo da fermentação causando instabilidade durante o processo. Esta instabilidade pode ser apontada como uma das causas para o estabelecimento de episódios de contaminação tanto por outras leveduras, tais como a levedura Dekkera bruxelensis foi apontada como uma das maiores contaminantes das destilarias de álcool do Nordeste do Brasil (De Sousa-Liberal et al. 2007). Fato que também foi observado em destilarias de álcool na America do Norte e Europa onde os substratos utilizados são o amido de milho e a beterraba açucareira, respectivamente (Abbott et al. (2005); de Miniac, 1989; Ciani et al., 2003).
Atualmente as leveduras utilizadas para a fermentação são obtidas a partir de seleções de S. cerevisiae utilizadas em processos fermentativos anteriores. Estas linhagens podem ser adquiridas comercialmente para este fim.
Assim como outras leveduras se estabelecem devido a instabilidade outras bactérias também entram e podem trazer grandes problemas para a fermentação.
2.2 Contaminantes bacterianos do processo de produção do etanol
O caldo de cana-de-açúcar se constitui um ótimo substrato para o crescimento de uma flora microbiana diversificada, devido ao sua composição em nutrientes orgânicos e inorgânicos, alta atividade aquosa, pH e temperaturas
5
favoráveis. Assim normalmente é possível se encontrar uma microbiota bacteriana presente no mosto utilizado como matéria-prima para a produção de açúcar e etanol (Yokoya, 1991; Gallo, 1992; de Souza-Liberal et al., 2007).
No Brasil o processo fermentativo ocorre em um ambiente séptico e, por conta disso, está propenso a contaminações por bactérias e/ou outros tipos de leveduras. Vários são os problemas que podem surgir durante a fermentação, dentre eles os mais comuns são:
Competição por açúcares. As bactérias estranhas ao processo competem e assimilam o açúcar que tinha por finalidade ser convertido em etanol;
Toxinas e ácidos. Com o consumo do açúcar pelas bactérias são lançados ao meio toxinas e principalmente ácidos orgânicos que podem inibir o processo por causar a morte da levedura devidos suas propriedades e características importantes com relação aos efeitos inibitórios. Um dos ácidos mais importantes que causam problemas à fermentação é o ácido lático produzido em sua grade parte pelas bactérias lácticas;
Floculação. Este é um fenômeno apresentado por leveduras, as quais se unem em agregados denominados flocos, constituídos por centenas e milhares de células. Ela propicia perdas de células de levedura no fundo das dornas ou nas centrifugas. Isto se acentua mais pela utilização do reciclo de células, o qual é utilizado para aumentar a produtividade do processo, reduzindo o tempo e os custos da fermentação (Yokoya & Oliva-Neto, 1991)
Muito estudos foram feitos onde ficou claro que as bactérias têm um papel muito importante na fermentação, se destacando desempenhando um mal papel
6
para o processo. Vale salientar que nem todas as bactérias são prejudiciais à fermentação, muitas delas estão relacionadas com a produção de congêneres secundários que contribuem de forma benéfica para a qualidade de bebidas como a cachaça e o wisky uma vez que estes congêneres são responsáveis pela produção de sabor e aroma destas bebidas (Schwan et. al., 2001)
Amorim & Oliveira (1982) encontraram como principais contaminantes da fermentação alcoólica as bactérias dos gêneros Acetobacter, Bacillus, Lactobacillus,
Leuconostoc e Atreptococcus.
Rondini (1985) encontrou no ambiente fermentativo um predomínio de bactérias Gram-positivas (65,1%), dentro das quais 62,1% pertencentes ao gênero
Bacillus, 3% ao Lactobacillus e 1,5% pertencendo ao gênero Leuconostoc. Um
estudo feito por Silva (1988) da microbiota bacteriana do caldo clarificado, pasteurizado e previamente resfriado encontrou bactérias dos gêneros Bacillus,
Lactobacillus e Leuconostoc, com cerca de 3%, 38% e 12%, respectivamente.
Gallo (1989) isolou a partir de coletas realizadas em diferentes pontos do processo fermentativo 334 culturas microbianas onde foi contatado a predominância de bactérias Gram-positivas (98,52%), onde 87,76% eram bastonetes, dentre eles 73,95% bastonetes não esporulados. Ainda neste estudo o autor comprovou que o gênero mais frequente foi o Lactobacillus (59,75%), com a identificação das seguintes espécies: L. acidophillus, L. agilis, L. amylophilus, L. animalis, L. buchneri,
L. coryniformis subsp. torquens, L. delbruekii subsp. bulgaricus, L. delbruekii
subsp.lactis, L. fermentum, L. helveticus, L. murinus, L. plantarum, L. reuteri, L. sake,
L. viridescens, L. vitulinus; 26,58% de Bacillus, dos quais foram identificados: B. brevis, B. coagulans, B. lentus, B. megaterium, B.pasteurii, B. stearothermophilus;
7
8,76% de Staphylococcus; 1,56% de Micrococcus; 1,48% de representantes da família Enterobacteriaceae; 1,26% de Pediococcus e 0,70% de Streptococcus.
Analises feitas a partir do leite de leveduras sem tratamento acido mostraram que, 62% das bactérias encontradas foram da espécie L. fermentum, 9% de L.
murinus, 2% de L. plantarum, 9% de L. vaccinostercus e 2% de Leuconostoc
(Oliva-Neto, 1990).
Em seus estudos de caracterização da microbiota contaminante da produção de álcool combustível, nos Estados Unidos, utilizando o milho como substrato Skiner e Leathers (2004) demonstraram que prevaleceram as bactérias lácticas, em particular Lactobacillus sp., representando cerca de 40% dos contaminantes totais isolados. Alem de outros isolados, menos frequentes, dos gêneros Clostridium,
Eubacterium, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus e Weissella (Tabela 1).
A maior parte dos trabalhos realizados tornou evidente a predominância de bactérias, principalmente as Gram-positivas, no processo de fermentação do etanol com um importante destaque aos microorganismos dos gêneros Bacillus e
Lactobacillus.
As fontes de contaminações são peculiares de cada etapa do processo fermentativo e de cada destilaria. Bem como a seleção de determinadas espécies ou linhagens de microrganismos que favorecidos pelas condições pelas quais ocorre a fermentação em um determinada destilaria (Cherubin, 2003). Além de inúmeras fontes de contaminações que vão desde os microrganismos encontrados no solo onde é plantada a matéria prima até a linha de produção (dornas, fermento, trocadores de calor, etc.) da destilaria.
Cherubim (2003) demonstrou que as contaminações bacterianas industriais são prejudiciais quando estão acima de 5,0 x 106 UFC/mL e; nestes casos, os
8
prejuízos econômicos são significativos quando atingem valores acima de 1,0 x 108 UFC/mL onde acontecem as quedas de rendimentos fermentativos.
Tabela 1 Contaminantes bacterianos encontrados na Fermentação Etanólica.
Organismo Referência
Bacteriodes forsytus Skinner e Leathers (2004)
Bifidobacterium sp., Bif. adolescentis, Bif. angulatum, Skinner e Leathers (2004)
Clostridium sp., Cl. aerotolerans, Cl. Clostridiiforme Skinner e Leathers (2004)
Eubacterium biforme Skinner e Leathers (2004)
Fusobacterium nucleatum Skinner e Leathers (2004)
Lactobacillus sp., L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. crispatus, L. delbrueckii subsp delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis, L. diolivorans-like, L. ferintoshensis, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. hilgardii, L. lindneri, L. manihotivorans, L. mucosae, L. nagelii, L. paracasei subsp. paracasei, L. pentosus, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. salivarus, L. vini, Lactobacillus sp. desconhecidas
Skinner e Leathers (2004); Lucena et al. (2010); Chang
et al. (1995)
Lactococcus sp., Lac. lactis subsp. lactis, Lac. raffinolactis Skinner e Leathers (2004)
Leuconostoc sp., Leuc. carnosum, Leuc. citreum, Leuc. lactis subsp. lactis, Leuc. mesenteroides subsp. cremoris
Skinner e Leathers (2004)
Oenococcus kitharae-like Lucena et al. (2010)
Pediococcus sp., P. acidilactici, P. damnosus, P. parvulos, P. pentosaceus, Pediococcus sp. desconhecidas
Skinner e Leathers (2004)
Propionibacterium granulosum Skinner e Leathers (2004)
Weissella sp. W. confusa, W. paramesenteroides, W. viridescens Skinner e Leathers (2004); Lucena et al. (2010)
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Makanjuola et a.l (1992) constatou uma contagem de bactérias de 4,5 x 108 UFC/mL em 30 horas de fermentação resultou em uma queda de 17% no rendimento do etanol. A queda do rendimento fermentativo geralmente deve-se à redução da viabilidade celular das leveduras em função do aumento da acidez no mosto após oito horas de cultivo associado com bactérias dos gêneros Bacillus e
Lactobacillus da fermentação alcoólica (Alcarde et al., 2002).
Lucena et. al. (2010) em seu estudo realizado em destilarias do Nordeste do Brasil, demonstrou que as LABs são facilmente encontradas nas destilarias. A maior frequência de isolados foram pertencentes ao gênero Lactobacillus tendo a maioria dos isolados identificados como pertencendo as espécies Lactobacillus fermentum e
Lactobacillus vini. Estas espécies foram encontradas em meio contendo mais de
10% de etanol, sugerindo uma seleção de bactérias tolerantes a etanol ao longo do tempo em todo processo. Além destas, foram encontrados isolados pertencentes as espécies: L. plantarum, L. nagelii, L. amylovorus, L. brevis, L. diolivorans - like, L.
ferintoshensis, L. manihotivorans, L. mucosae e Oenococcus kitaharae - like, todas
pertencentes ao gênero Lactobacillus. Além destas também foram encontrados isolados da espécie Weissella parameseteroides.
Por estar presentes em processos fermentativos com diferentes substratos e com os problemas que podem surgir no processo pela entrada deste organismos é de suma importância que se conheça quais as espécies de bactérias lácticas estão relacionadas com a contaminação da fermentação alcoólica.
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2.3. Bactérias Lácticas (Lactic Acid Bacteria-LAB)
As bactérias lácticas é como são chamadas as bactérias que são gram-positivas, não formadoras de esporos, ácido tolerantes, fastidiosas, estritamente fermentativas, catalase-negativas, desprovidas de citocromos que crescem sob condições microaerofílicas a condições estritamente anaeróbicas. Elas também possuem um baixo conteúdo de guanina e citosina (G+C), ficando entre 33% a 55%. Esta alta heterogeneidade é refletida pelos testes fenotípicos dos isolados de
Lactobacillus de diversos ecossistemas, que mostram perfis de fermentação do
açúcar intermediários o que dificulta mais a tipagem ao nível de espécie. Dentre o grande número de gêneros que existe de bactérias lácticas os mais importantes são:
Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetraghenococcus e Weissella (Klein et al. 1998; Holzapfel et al. 2001; Moreira et al. 2005).
As bactérias lácticas são encontradas em diversos tipos de habitats, desde solo, plantas, adubo, carnes, água, esgotos, restos de alimentos, em fermentações lácticas (na produção de laticínios como: queijos, iogurtes e manteiga) e em fermentações alcoólicas (produção de etanol e bebidas destiladas como: vinho, uísque, cachaça, cerveja). Além desses habitats as LAB também podem, ser encontradas na cavidade oral, trato digestivo e vaginal humano, e podem trazer benefícios para estes ecossistemas (Holzapfel et al. 2001; Morea et al. 1998; Simpson et al. 2001; Du Plessis et al., 2004). Elas também são quimiotróficas e fermentam o carboidrato produzindo como produto final ácido láctico e, em pequenas quantidades ácido acético. Algumas características fisiológicas são de interesse por suas funções como probióticos, uma pré-condição para sobreviver no
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trato intestinal. Estas características são de menor interesse para a taxonomia das LAB, pois pode ocorrer mudanças morfofisiológicas nas bactérias devido as condições do meio onde elas estão sendo cultivadas, dificultando a identificação precisa dos isolados (Klein et al., 1988).
Dentre as inúmeras espécies de bactérias utilizadas pelo homem podem se destacar as pertencentes ao gênero Lactobacillus (Figura 1). Elas estão envolvidas nas fermentações para a produção de diversos produtos tais como: vinho, cerveja, uísque de malte dentre outras bebidas fermentadas. Também estão presentes na fabricação de iogurtes, kefir, queijos. Ainda, outras espécies do gênero Leuconostoc são utilizadas na fabricação de queijos e manteiga. Na produção de vinho e cidra se destacam as bactérias do gênero Oenococcus. Alem de outros gêneros como o
Weissella e Pediococcus que são responsáveis pela degradação de carnes e
vegetais, fermentação, preparo e conservação de alimentos (Slonczewski e Foster, 2008).
Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de três importantes representantes das bactérias lácticas.
Weissella confusa (A) encontrada em fermentações alcoólica (Lucena et al., 2010); Lactobacillus casei (B) utilizado no preparo de leites fermentados
(http://www.probioticsnews.creativetesting.co.uk/library); Oenococcus oeni (C) bactéria
frequentemente utilizada na fermentação de vinhos (barra = 3µm) (http://genome.jgi-psf.org/oenoe/oenoe.home.html).
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A identificação das bactérias tem sido, e ainda é feito principalmente através da utilização de marcadores morfofisiológicos e bioquímicos. Entretanto estes marcadores contam com a expressão de fenótipos variados, os quais podem não ser expressos sob certas condições (Nour, 1998).
Tradicionalmente, as LAB têm sido classificadas com base nas propriedades fenotípicas, isto é, morfologia, no padrão de fermentação de carboidratos, diferenças entre a resistência a diferentes concentrações de NaCl, crescimento em diferentes tipos de meios e temperaturas e resistência a antibióticos. Por muito tempo estes foram os únicos critérios utilizados para a taxonomia de LAB (Holzapfel et at. 2001; Klein et al. 1998). Já os métodos taxonômicos modernos aplicados a LAB incluem a caracterização fenotípica e genotípica, reveladas em nível molecular. A identificação molecular de LAB é baseada nas análises na homologia DNA-DNA como método de referência. Para tal, sondas de ácidos nucleicos têm sido desenvolvidas para varias espécies de Lactobacillus, frequentemente em combinação com métodos primários (Klein et al. 1998; Tilsala-Timisjärvi e Alatossava 1997). A utilização de técnicas que são baseadas em características fenotípicas e genômicas, conhecida como taxonomia polifásica, têm se mostrado capaz de diferenciar espécies que são fenotipicamente semelhantes, mas diferente ao nível de genotípico. A taxonomia polifásica tem se mostrado confiável por se associar técnicas que revelam diferenças tanto a nível intra como interespecíficos do microrganismos. Isto é de suma importância na industria, uma vez que muitas espécies de bactérias são utilizadas como probiótico, sendo de extrema importância uma classificação mais acuradas desse grupo (Holzapfel et at. 2001; Klein et al. 1998).
Por muito tempo as bactérias lácticas foram classificadas por suas características fenotípicas, tais como: morfologia, fermentação de diferentes
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carboidratos, variação na temperatura de crescimento, fermentação de glicose, entre outras. Mas com os avanços nas técnicas moleculares novas técnicas têm surgido para aumentar e agilizar a identificação de bactérias muito próximas.
A definição de espécie biológica não é aceita em espécies procarióticas, sendo necessário uma novo conceito de espécies para as mesmas. Em seu estudo Vandamme et al. (1996) definiu uma espécie procariótica como "uma categoria que engloba (preferencialmente) um grupo coerente genômicamente de isolados/linhagens individuais que compartilham um alto grau de similaridade em características independentes, testadas comparativamente sob condições altamente padronizadas" (Gevers et al., 2005). Na pratica, uma espécie procariótica é considerada sendo um grupo de linhagens, incluindo a linhagem tipo, que são caracterizada por um alto grau de consistência fenotípica, mostrando 70% de hibridização DNA-DNA (DDH, DNA-DNA Hybrization) e mais de 97% de identidade na sequência do gene 16S do RNA ribossomal (rRNA) (Vandamme et al., 1996; Gevers et al., 2005).
Desde a década de 1970, espécies procarióticas foram descritas com base em dados produzidos em experimentos de hibridização DNA-DNA. Nesta abordagem, a similaridade genética entre isolados é avaliada pelo grau em que seus genomas hibridizam sob condições padronizadas. Isolados que demonstram mais de 70% de DDH e valores menores que 5% de diferença em sua temperatura de desnaturação (ΔTm) são considerados como pertencentes à mesma espécie (embora este valor limite pode ser ajustado pelos especialistas que estão familiarizados com a excentricidade de cada um dos grupos taxonômicos). Ao passo que, os isolados que compartilham menos que 50% de DDH pertencem, definitivamente, a espécies diferentes. Para facilitar a identificação são necessárias
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consistência fenotípica dentro da espécie e as diferenças entre as espécies. A análise comparativa da sequência do gene 16S rRNA é amplamente utilizado para determinar a posição filogenética do isolados. Linhagens que mostram similaridade menores que 97% na sequência do gene 16S rRNA com todos os taxa conhecidos são consideradas como pertencendo a uma nova espécie, já que não existem exemplos em que cepas com este ponto de divergência na sequência do gene 16S do rRNA cumprir os critérios de apresentar mais de 70% de DDH (Gevers et al., 2005).
Na prática, a caracterização taxonômica de uma coleção de isolados começam com uma triagem que permite os isolados esteritamente relacionados sejam agrupados e distinguidos de isolados não relacionados. Os métodos de triagem frequentemente utilizados incluem o conteúdo de ácidos graxos celular (um método quimiotaxonômico no qual os lipídeos que estão presentes nas células bacterianas são analisados e usados para delinear agrupamentos) (Welch, 1991; Gevers et al., 2005) e uma ampla gama de métodos de tipagem baseads na análise de DNA, incluindo AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) entre outro métodos que se utilizam de primers randômicos (Vos, et al., 1996; van Belkum, 1994; Gevers 2005). Estes métodos têm a vantagem de serem relativamente rápidos e fáceis de executar e podem ser automatizados, tornando-os úteis para a triagem padronizada grande número de isolados. Posteriormente, a análise da sequência genética do gene ribossomal 16S rRNA é realizada com representantes dos diferentes grupos, e estas sequências são comparadas com as de espécies conhecidas. Desta forma, a posição filogenética é determinada. Com base nos resultados desta análise, os organismos são selecionados, e devem ser incluídos em experimentos de hibridização DNA-DNA (Gevers et al., 2005).
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2.4. Identificação e Tipagem Genética
Pesquisas continuas têm sido realizadas para definir um conceito de espécie procariótica, devido a particularidades da reprodução destes microrganismos.
Stackebrandt (2002) sugeriu uma espécie procariota como "um grupo (de
preferência) genomicamente coerente de isolados individuais/cepas compartilhando um alto grau de semelhança em (muitas) características independentes, comparativamente testado sob condições altamente padronizadas". Com esta
continua busca por um conceito natural de espécie, baseados em novas abordagens genômicas e no crescente número de genomas sequenciados disponíveis vem mudando continuamente a taxonomia bacteriana e seus conceitos. Considerando que o conceito de espécies é o arcabouço teórico que descreve o que são espécies de bactérias e explica como eles são formados.
A definição das espécies é a forma como a concepção é exercida na prática, e consistem de um conjunto de regras de fácil aplicação e estável (Doolittle & Papke, 2006; Konstantinidis et al., 2006). A definição de espécies bacterianas considera espécies de bactérias os grupos de linhagens que são caracterizados por um certo grau de consistência fenotípica, por um significativo grau de hibridação (>70%) DNA-DNA (DDH) e mais de 97% de identidade sequência do gene 16S da RNA do ribosomal (rRNA) (Ursing et al., 1995; Vandamme et al., 1996; Gevers et. al., 2005).
Gevers et. al. (2005) em seu trabalho de reavaliação de espécies procarióticas demonstrou em seu estudo que a utilização do DDH e a análise de sequencias do gene 16S associadas com a utilização da Multilocus Sequence
Analysis (MLSA) pode melhorar a caracterização genotípica dos procariotos ao nível
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Inúmeras técnicas têm sido utilizadas para a identificação das LAB para uma rápida e precisa identificação e diferenciação inter e intraespecíficas. Para obter uma identificação precisa, técnicas fenotípicas e genotípicas são frequentemente combinadas em uma abordagem polifásica, onde as deficiências de um método é compensado pelo uso de outro método (De Bruyne, 2009).
Alguns destes métodos se destacam por já serem consolidados devido à rapidez, praticidade, robustez, reprodutibilidade e eficácia na identificação de microrganismos. Dentre estes podemos citar alguns mais utilizados para o fim de identificar espécies ou linhagens de bactérias: perfil plasmidial, eletroforese em gel de campo pulsátil (PFGE).
2.4.1. Perfil plasmidial
Consiste numa técnica utilizada para caracterizar bactérias a partir da análise do padrão criado quando plasmídios são separados, com base no peso molecular, por eletroforese em gel de agarose. Entretanto a falta de estabilidade dos plasmídios por um longo tempo para algumas linhagens em particular, pode ser a sua maior desvantagem (Towner & Cockayne, 1993). Em bactérias lácticas, o perfil plasmidial era considerado útil para a tipagem de linhagens dentro de uma espécie. Contudo, como resultado da instabilidade do DNA extracromossomal, métodos que utilizam o DNA cromossomal, têm sido mais utilizados por demonstrarem melhores resultados (Duffner e O’Connell, 1995, Holzapfel et al., 2001).
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2.4.2. Eletroforese em campo pulsátil (PFGE)
Consiste em um método com alto poder discriminatório e reprodutível, e tem sido usado para diferenciar linhagens de importantes bactérias probióticas, como
Bifidobacteria, L. casei, L. acidophilus (Roy et al. 1996; Ferrero et al. 1996; Roussel et al. 1993; Holzapfel et al. 2001). Em muitos estudos com Lactobacillus, o PFGE
tem se mostrado como um método poderoso para tipagem de linhagens, sendo também utilizado em estudos epidemiológicos. Contudo consiste em uma técnica laboriosa e cara, e apenas um limitado número de amostras pode ser analisado ao mesmo tempo (Ventura e Zink, 2002).
2.4.3. Polimorfismo de amplificação aleatória do DNA (RAPD)
Essa técnica tem como principal vantagem a geração de perfis moleculares sem a necessidade de conhecimento específico do genoma a ser estudado. Contudo, seu aspecto negativo consiste na sua baixa reprodutibilidade, necessitando de condições cuidadosamente controladas (Seseña, 2004). Por ser uma técnica rápida e simples de ser executada ela elimina muitos problemas encontrados por outras técnicas moleculares como o PFGE e perfil plasmidial. Van Reenen (1996) utilizou esta metodologia para diferenciar Lactobacillus plantarum e
Lactobacillus pentosus que apresentavam padrões similares para assimilação de
açucares, contudo apresentaram padrões distintos para o RAPD. Outra desvantagem é o alto nível de padronização e controles dos parâmetros, como concentrações adequadas de DNA, magnésio, primer e enzima, assim como o número de ciclos da PCR (Bassam et al., 1992).
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2.4.4. Análise de Enzimas de Restrição (REA)
A utilização de endonucleases de restrição para a digestão do DNA cromossomal gera um padrão de fragmentos de restrição são separados em gel de agarose em uma eletroforese convencional. O padrão de bandas gerado por esta técnica é de difícil análise visual, sendo necessário a utilização de programas computacionais de análise multivariável (Charteris et al. 1997). O método de REA tem sido utilizada e conseguido bons resultados para a diferenciação de linhagens de L. acidophilus (Roussel et al. 1993) L. casei e L. rhamnosus (Ahrné e Molin, 1997), e L. reuteri (Ahrné e Molin, 1997; Stahl e Molin, 1994).
2.4.5. Ribotipagem
Consiste na hibridização do tipo Southern Blotting de fragmentos de restrição do rRNA por . Em geral, o padrão obtido é mais estável e de melhor interpretação que o padrão conseguido pela REA (Charteris et al. 1997). A alta reprodutibilidade é outra vantagem desta técnica e a possibilidade de se utilizar uma sonda universal para todas as espécies, levando-se em consideração a similaridade entre os genes ribossomais (Pot et al. 1993; Grimont et al. 1986; Holzapfel et al. 2001). A ribotipagem vem sendo frequentemente utilizada na identificação e caracterização de linhagens e diferentes espécies de LAB encontradas em diferentes processos industriais como: fabricação do queijo mussarela (Morea et al. 1998), na produção de whisky (Simpson et al. 2001), trato vaginal (Pavlova et al. 2002), processo de fermentação do vinho (Du Plessis et al., 2004), produção de álcool combustível (Skinner e Leathers, 2004) entre outros.
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2.4.6. Análise de Restrição do DNA Ribossomal Amplificado (ARDRA)
A técnica de ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) consiste na análise do perfil de digestão do produto da PCR da região ITS do loco de rDNA. O perfil gerado por ARDRA é distinto entre os grupos, podendo se diferenciar dentro de um mesmo grupo. Esta técnica tem se mostrado uma ferramenta importante na identificação de bactérias, e de linhagens dentro das espécies, pois nem sempre os métodos clássicos baseados nas características bioquímicas e/ou morfofisiológicas geram resultados claros e confiáveis (Dubernet et al. 2002; Collado e Hernández, 2007).
Assim como a ribotipagem, a ARDRA faz uso da análise dos genes ribossomais que carregam consigo informações úteis sobre a relação evolutiva e de parentesco entre as bactérias (Miteva et al. 2001). Esta metodologia combina facilidade, rapidez, especificidade e sensibilidade, sendo ela precisa para a identificação de bactérias e se mostrando bastante eficiente na diferenciação das espécies dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus e Bifidobacterium (Miteva et al. 2001; Moreira et al. 2005; Collado e Hernández, 2007).
Três tipos de rRNAs são encontrados nos ribossomos das bactérias (23S, 16S e 5S). Os genes codificantes destes rRNAs são separados por sequências espaçadoras (ISRs) e são organizados em operons que podem variar de 1 a 11 por célula bacteriana. O mais comum arranjo destes genes para as diferentes subunidades dentro do operon segue a seguinte ordem 16S-23S-5S, são raras as exceções nas quais os genes não se encontram dispostos desta forma (Gürtler e Stanisich, 1996; Pisabarro et al. 1998; Roth et al. 1998; García-Martinez et al. 1999). Estes genes são essenciais para a sobrevivência dos organismos e são altamente
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conservados entre as espécies bacterianas. O comprimento das regiões espaçadoras entre os genes do rRNA 16S-23S (ISRs), que são amplificados pela ribotipagem por PCR, podem variar entre as diferentes espécies ou dentro da mesma espécie (García-Martinez et al. 1999). As variações no comprimento das ISRs 16S-23S podem ser explicadas pelo fato de existir números e tipos de genes diferentes do tRNA que pode-se encontrar dentro destas regiões (Gürtler e Stanisich, 1996); além da presença de sequencia de reconhecimento de enzimas, como a ribonuclease III, esta enzima está envolvida no processo de splicing para a produção de ribossomos maduros (Bram et al. 1998); e boxA, sequência que tem um papel anti-terminador durante a transcrição (Harvey et al. 1988). O restante desta região consiste em sequências de genes não essenciais, e estas sequências estão sujeitas a frequentes eventos de inserção-deleção (García-Martinez et al., 1999).
É sabido que a sequência espaçadora 16S-23S do DNA ribossomal exibe uma grande quantidade de elementos, com comprimentos variados e sequências conservadas com papeis funcionais definidos, como por exemplo, genes de tRNAs (Ruiz et al. 2000).
A técnica de ARDRA-PCR foi utilizada com sucesso na diferenciação das espécies de bactérias produtoras de ácido acético destituídas de variações intraespecíficas indicando que a alta variabilidade da sequência 16S-23S ITS nestas bactérias pode ser utilizadas para fazer a identificação e classificação taxonômica de linhagens ou de grupos relatados dentro das próprias linhagens de bactérias (Ruiz et
al. 2000; Shang et al. 2003).
Para as espécies de Lactobacillus a utilização de sondas espécie-especificas para a diferenciação intraespecífica de todas as linhagens para L. delbrueckii conseguiu diferenciar com sucesso três linhagens de L. delbrueckii: a L. delbrueckii
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subsp. bulgaris de L. delbrueckii subsp. delbrueckii/L. delbrueckii subsp. lactis pela análise do perfil de restrição do 16S gerado com a enzima EcoRI (Miteva et al. 2001).
A metodologia da ARDRA constitui um especifico e reprodutível caminho para a identificação de LAB ao nível de espécie. Além disso, a maior parte dos gêneros co-isolados com Lactobacillus pôde ser identificada com precisão através da ARDRA da 16S-23S rRNA (Moreira et al. 2005). Esta região permite discriminar o gênero
Lactobacillus devido ao seu padrão de amplificação, apresentando três bandas,
correspondendo às três regiões espaçadoras (pequena, media e grande regiões espaçadoras), similar as encontradas nas espécies dos gêneros Pediococcus,
Carnobacterium, Leuconostoc e Weissella. Estas diferenças nos tamanhos são
devido a inserção do gene do tRNA-Ala dentro do médio espaçador ou dos genes dos tRNA-Ala e tRNA-Ile dentro do espaçador maior (Figura 1). Bifidobacteria,
Enterococci, Streptococci e Staphylococci apresentam padrões de amplificação com
uma banda ou duas com tamanhos diferentes, também devido a inserção dos genes dos tRNA (Moreira et al. 2005).
Figura 2. Mapa físico da região 16S-23S ITS do rDNA típico do gênero Lactobacillus mostrando
a inserção dos tRNAs da alanina e isoleucina. Modificado de Lucena (2010)
ITS (p) ITS (m) ITS (g)
16S
23S
5S
16-1A 16-1A 23-1B tRNAAL A tRNAAL A tRNAIL E ITSInserção de tRNAs
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O gênero Lactobacillus apresenta um perfil de amplificação da região 16S-23S ITS com três bandas com a banda menor com cerca de 503 pb (Figura 2). Um estudo realizado por Lucena (2010) de linhagens industriais mostrou (Fermentec Ltda) o perfil de amplificação típico para Lactobacillus.
Segundo Moreira et al. (2005) o padrão de amplificação e o perfil de digestão dos três espaçadores tem permitido a identificação de diferentes espécies de
Lactobacillus, o que indica ser essa uma metodologia fácil e rápida para
identificação de bactérias lácticas.
Com isso, a técnica de ARDRA poderá ser utilizada na análise da população bacteriana associada a produção de etanol para a identificação dos contaminantes bacterianos presentes no processo de fermentação alcoólica. Por se tratar de uma técnica rápida, com alta sensibilidade e precisa para a identificação de LAB.
Figura 3. Amplificação da região espaçadora 16S-23S do agrupamento de genes de rDNA das
amostras de bactérias lácticas da Fermentec Ltda. As linhagens estão representadas na parte superior do gel. Modificado a partir de Lucena (2010)
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2.4.7. Sequênciamento de DNA
A utilização de macromoléculas como as sequências de DNA tem se mostrado uma ótima ferramenta para a identificação e diferenciação de espécies intimamente relacionadas. A décadas a o DNA tem sido descrita como sendo um documento que registra as mudanças evolutivas das espécies e sendo utilizado para da diversidade filogenética e a relação evolutiva entre diferentes espécies.
Diversos estudos têm sido feito e demonstrado que o uso de gene codificadores de proteínas são como marcadores filogenéticos têm sido utilizados como marcadores filogenéticos para a classificação e identificação de bactérias lácticas. A utilização de genes informativos, como o gene 16S rRNA, são considerados verdadeiros cronômetros evolutivos por estarem presentes em todos os seres vivos pois a comparação de sua sequência entre diversos organismos permite inferências filogenéticas entre os mesmos. Isto é possível porque além de estarem presentes em todos seres vivos, são conservados do ponto de vista evolutivo mas apresentam regiões com variação de nucleotídeos nas diferentes espécies, o que permite a comparação de organismos mesmo filogeneticamente distantes.
A adoção de técnicas que utilizam o gene 16S rDNA para identificar e até mesmo classificar uma bactéria foi sugerida e incentivada pelo comitê de sistemática bacteriana em 2002 (Stackebrandt et. al. 2002). Desde 2003 esta abordagem é amplamente utilizada para estudar comunidades microbianas complexas como solo, ar e água (Hongoh et. al. 2003).
O gene 16S é comumente considerado como um confiável marcador filogenético para atribuir relações evolutivas entre espécies do gênero Lactobacillus
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(Schleifer & Ludwig, 1995). Este gene ainda é o alvo mais comumente utilizado em estudos de diversidade bacteriana. Este gene é um marcador universal altamente conservado com funções bem definidas desde os primórdios da evolução e é relativamente não afetado por pressões ambientais. Isto, junto ao tamanho do gene, faz com que ele seja um bom relógio evolutivo (Kimura et al., 1997; Mohania et al., 2008). Mesmo sendo considerado um marcador universal bem conservado existem deficiências associadas ao seu uso. Primeiro, por ser bem conservado ele limita o poder de resolução. Segundo, o gene 16S rRNA aparece em diferentes espécies de bactérias em diferentes números cópias do gene (Mohania et al., 2008).
Para superar estes problemas a utilização de genes classificados como
housekeeping, genes constitutivos que são requeridos para a manutenção das
funções celulares básicas, vem surgindo como uma alternativa para a resolução destes problemas (Naser et al., 2007). Estudos recentes in silico baseados em genomas completos têm providos as bases para o estabelecimento de uma serie de genes housekeeping que podem predizer precisamente o parentesco genômico aumentar a precisão da identificação das espécies. A necessidade por marcadores genômicos alternativos que forneçam mais altos níveis de discriminação do que o gene 16S rRNA têm levado a um sequenciamento sistemático de genes
housekeeping (Coenye et al., 2005; Gevers et al., 2005; Konstatinidis & Tiedje, 2005;
Naser et al., 2005a).
Os estudos de análises de sequências de loco único (SLSA - Single-locus sequence analysis) focam genes codificadores de proteínas que tem evolução relativamente lenta, porem mais rapidamente do que os genes 16S rRNA, para obter uma alta resolução taxonômica (Figura 3).
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Para ser utilizado para discriminação de espécies, é ideal que os gene esteja presente em uma única copia no genoma, evoluir com maior rapidez do que os genes rRNA e ser amplamente distribuídos entre os genomas bacterianos. Aqueles genes nos quais a recombinação pode conferir uma vantagem seletiva, ou genes ligados estreitamente, devem ser evitados. Além disso, estes genes devem ser informativos e com um adequado grau de resolução e fornecer variabilidade para diferenciar espécies de um gênero em particular (Naser et al., 2007).
A utilização de genes housekeeping tal como o gene que codifica a subunidade α da RNA polimerase (gene rpoA) e a enzima fenilalanina-tRNA sintetase bacteriana (gene pheS) têm se mostrado como um robusto sistema para a identificação de todas as espécies reconhecidas de Enterococcus (Naser, et al., 2005b) e de todas as espécies do gênero Lactobacillus (Naser et al., 2007). A partir
Figura 4. Árvore filogenética feita a partir de sequências do gene 16S mostrando a posição do
Lactobacillus hammesii sp. nov. strains LP38T e LP39 entre alguns lactobacilli. (Reproduzido de Valcheva et al., 2005)
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da análise dos genes pheS e ropA é possível fazer a diferenciação efetiva das espécies de Lactobacillus com um alto nível de discriminação quando comparado com o gene 16S rRNA.
RecA é uma pequena proteína essencial para o reparo e manutenção do DNA. Está envolvida no processo de recombinação homóloga do DNA, indução do sistema SOS (um sistema de reparo do DNA pós-replicação), e indução dos mecanismos de reparação de lesões no DNA. Devido ao seu papel fundamental, o gene recA é ubíquo, e seu produto tem sido proposto como um marcador filogenético para espécies muito próximas (Felis et al., 2001; Torriani et al., 2001). O uso desta metodologia para a diferenciação de três espécies do grupo Lactobacillus
plantarum (L. plantarum, L. pentosus e L. paraplantarum) teve êxito e mostrou um
alto poder discriminatório no uso deste gene para separar espécies de difícil diferenciação, tais como Bifidobacterium longum e Bifidobacterium infantis. Validando a utilização deste gene como marcador filogenético-taxonômico para espécies relacionadas, abrindo uma nova possibilidade para uma rápida e segura identificação de LAB importantes de uso industrial.
Silvers et al. (2003) determinou as sequências de nucleotídeos do gene atpD que codifica a subunidade β da ATPase das bactérias Oenococcus oeni,
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Lactobacillus brevis e Lactobacillus hilgardii. A árvore obtida
a partir destas sequências indicaram que O. oeni e L. mesenteroides subsp.
mesenteroides formaram um grupo bem separados de P. damnosus e P. parvulus
e das duas espécies de Lactobacillus.
Tapp et al. (2003) em seus estudos, do gene rnpB, que é universalmente presente em bactérias Gram-positivas com baixo conteúdo de G+C e, que codifica a
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subunidade de RNA da endoribonuclease P, revelou que o mesmo se mostrou adequado para analises filogenéticas de taxa relativamente próximos e como uma potencial ferramenta para discriminação de espécies dentro do gênero
Streptococcus. Em outro estudo, o uso de sequências parciais do gene rpoB, que
codifica a subunidade altamente conservada da RNA polimerase bacteriana. As sequências do gene rpoB mostraram um maior poder discriminatório do que sequências do gene 16S rRNA para a identificação de LAB dos gêneros
Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia e Granulicatella (Drancourt et al., 2004).
2.4.8. Rep-PCR
A técnica Rep-PCR faz uso de sequências oligonucleotídicas iniciadoras complementares de sequências de DNA repetitivas muito conservadas e presentes em numerosas cópias no genoma da maioria das bactérias Gram-negativas e de várias bactérias Gram-positivas.
Foram identificadas três famílias de sequências repetitivas: 1) as sequências REP (Repetitive Extragenic Palindromic elements) com 35-40 pares de bases, as quais são altamente conservadas em várias espécies bacterianas; 2) as sequências ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus elements) de 124-127 pares de bases, as quais contêm um elemento repetitivo central invertido altamente conservado e que estão localizados nas regiões extragênicas do genoma bacteriano; 3) o elemento BOX de 154 pares de bases.
A amplificação das sequências entre cada um destes elementos repetitivos têm sido utilizadas para gerar perfis de DNA de várias espécies bacterianas, tanto
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Gram-positivas quanto Gram-negativas (Vuyst et al., 2008). Sequências com unidades de repetição (GTG)5 aparecem distribuídas amplamente nos genomas de
diversos grupos de bactérias. A amplificação das sequências destes elementos repetitivos gera padrões de impressões genéticas (DNA fingerprints) específicos para diversas espécies de Lactobacillus (Gevers et al., 2001) e Enterococcus (Švec
et al., 2005), permitindo uma especiação e tipagem rápida, precisa e confiável.
A Rep-PCR consiste em uma técnica com alto poder discriminatório, baixo custo, adequado para discriminação de linhagens e pode ser considerada como uma ferramenta confiável para a classificação e tipagem de um grande numero de bactérias Gram-negativas e várias bactérias Gram-positivas (Gevers et al., 2001).
Hyytiä-Trees et al. (1999) sugeriu que um adequado nível de discriminação entre linhagens de Lactobacillus sakei pode ser conseguido com o uso combinado da Rep-PCR usando primers BOX e REP e RAPD. Enquanto que, Sohier et al. (1999) demonstrou a aplicabilidade da rep-PCR para identificar as espécies de
Lactobacillus hilgardii e Lactobacillus brevis.
A técnica de Rep-PCR utilizando o iniciador (GTG)5 é uma ferramenta rápida,
de fácil perfomance e, reprodutível para a diferenciação de uma grande variedades de Lactobacillus associados a alimentos no nível de espécie, subespécie e, potencialmente, ate o nível de linhagem, com um protocolo de desempenho simples. Esta técnica consiste em uma ferramenta genotípica promissora para a especiação e tipagem rápida e confiável de Lactobacillus entre outras LAB em indústrias de fermentação (Gevers et al., 2001, Lucena et al., 2010).
Vuyst et al. (2008) fez a utilização do primer (GTG)5 que permitiu a
identificação da impressão genética das bactérias ácido acético (AAB - Acetic Acid Bacteria) durante um dia de trabalho. Fazendo uso desta ferramenta para a
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classificação e identificação de AAB no nível de espécies, bem como a para a caracterização destas bactérias ao nível intraespecífico. A utilização do primer (GTG)5 pode aumentar o conhecimento a cerca da ecologia biodiversidade tanto das
LAB como das AAB e ajudar a determinar com mais precisão o seu comportamento de crescimento e benéficos ou indesejáveis papeis durante várias etapas da fermentação de alimentos.
Diante disto, a taxonomia dos procariotos vem evoluindo juntamente com os avanços nas áreas de Genética de Populações de microrganismos, Ecologia, Genômica, Transcripitônica e na facilidade de obtenção de dados sequênciamento. Isto faz com que os conceitos de espécie sejam revistos.
Avanços na área molecular leva a crer que o futuro da taxonomia e sistemática microbiana terá como base a abordagem de análise de sequências de DNA (Gevers et al. 2005). Assim esta abordagem pode ser utilizada para o estudo de populações complexas de microganismos como a do processo de fermentação etanólica industrial. O conhecimento das espécies bacterianas que entram no processo fermentativo contribuirá para um maior controle das contaminações bacterianas que diminuem o rendimento da produção de etanol. Isto trará benefícios econômicos para o setor industrial.
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3. Objetivos 3.1 Geral
Este trabalho teve como principal objetivo a identificação de bactérias presentes no caldo de cana-de-açúcar e destilarias da região Nordeste do Brasil.
3.2 Específicos
Identificar quais grupos bacterianos entram no processo fermentativo do caldo de cana-de-açúcar.
Verificar quais as bactérias lácticas mais comuns quais problemas podem ser identificados como sendo causados por sua presença durante a fermentação.
Demonstrar a eficácia das técnicas de ARDRA e Sequênciamento de DNA para identificação empregadas neste trabalho
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4. Material e Métodos
4.1. Isolamento, manutenção e identificação bacteriana
Amostras do caldo de cana-de-açúcar de quatro destilarias localizadas nos estados da Paraíba e Pernambuco, região Nordeste do Brasil, foram coletadas durante o período da safra de 2007-2008. As coletas foram realizadas nas usinas Giasa (Pedras de Fogo-PB), Japungu e Miriri (Santa Rita-PB) e Trapiche (Sirinhaém-PE) onde 100mL do caldo de partida foi coletado em sacos estéreis e transportados em gelo para o laboratório onde foram executados os experimentos.
Inicialmente amostras foram diluídas em solução salina 0,85% estéril até 3x10-4 e semeadas em placas de Petri contendo o meio de cultura MRS® sólido acrescido de ciclohexamida (0,2 gL-1) para inviabilizar o crescimento de fungos. As placas foram incubadas em jarras de anaerobiose a 37ºC com geradores de anaerobiose Anaerocult A (Merk) (Skinner e Leathers, 2004).
4.1.1 Isolamento e purificação das Culturas
Após o crescimento, foram selecionadas as placas nas quais havia um crescimento de aproximadamente 100 colônias com uma boa distribuição na placa. As colônias foram caracterizadas segundo a sua morfologia, e o isolamento realizado por amostragem estratificada segundo cada morfotipo. Os isolados foram mantidos em glicerol 30% a -20oC. As colônias foram semeadas em meio MRS líquido para o crescimento e posterior extração do material genético das mesmas.
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4.2. Tipagem Genética
4.2.1. Extração de DNA
O método extração de DNA foi adaptado do protocolo de Moreira et al. (2005). Resumidamente, os isolados obtidos foram semeados em 10mL do meio MRS líquido em tubos Falcon™ de 15mL. As células foram centrifugadas por 10min a 4.000 rpm, e o sedimento celular foi ressuspenso em 1ml de LiCl 5M, transferidos para microtubos de 1,5mL e incubados por 1h sob agitação constante. Após incubação, as células foram centrifugadas a 4.000 rpm em microcentrífuga de bancada. O sedimento foi ressuspenso em 1ml do tampão TE10 (Tris 50mM, EDTA
10mM, pH 8,0) acrescido de 3 L de solução de lisozima (10mg/mL) e incubados por 1h e posteriormente centrifugados por 10min a 4.000 rpm. O sedimento foi novamente ressuspensos em TE10 (540 µL) acrescido de 60µL de solução de SDS
(10%) para permitir a lise celular (entre cada fase de ressuspensão o sedimento foi lavado em água mili-Q).
Os tubos foram centrifugados mais uma vez e o sobrenadante foi transferido para outro microtubo onde foi acrescido de clorofane (fenol-clorofórmio + álcool isoamílico, 1:1) na quantidade de 600μL por microtubo e centrifugado por 10min a 14.000 rpm, ao sobrenadante retirado e transferido para um novo microtubo onde foi acrescido 600μL de clorofil (clorofórmio-álcool isoamílico, 24:1). O DNA foi precipitado em 600μL de álcool isopropanol 100%, centrifugado a 4°C a 14.000 rpm por 30min. Mais uma vez ressuspendido em 500μL de etanol 70% e centrifugado a 4°C a 14.000 rpm por 10min e, por fim ressuspendido em 100μL de água estéril.
