Sequênciamento de DNA

A utilização de macromoléculas como as sequências de DNA tem se mostrado uma ótima ferramenta para a identificação e diferenciação de espécies intimamente relacionadas. A décadas a o DNA tem sido descrita como sendo um documento que registra as mudanças evolutivas das espécies e sendo utilizado para da diversidade filogenética e a relação evolutiva entre diferentes espécies.

Diversos estudos têm sido feito e demonstrado que o uso de gene codificadores de proteínas são como marcadores filogenéticos têm sido utilizados como marcadores filogenéticos para a classificação e identificação de bactérias lácticas. A utilização de genes informativos, como o gene 16S rRNA, são considerados verdadeiros cronômetros evolutivos por estarem presentes em todos os seres vivos pois a comparação de sua sequência entre diversos organismos permite inferências filogenéticas entre os mesmos. Isto é possível porque além de estarem presentes em todos seres vivos, são conservados do ponto de vista evolutivo mas apresentam regiões com variação de nucleotídeos nas diferentes espécies, o que permite a comparação de organismos mesmo filogeneticamente distantes.

A adoção de técnicas que utilizam o gene 16S rDNA para identificar e até mesmo classificar uma bactéria foi sugerida e incentivada pelo comitê de sistemática bacteriana em 2002 (Stackebrandt et. al. 2002). Desde 2003 esta abordagem é amplamente utilizada para estudar comunidades microbianas complexas como solo, ar e água (Hongoh et. al. 2003).

O gene 16S é comumente considerado como um confiável marcador filogenético para atribuir relações evolutivas entre espécies do gênero Lactobacillus

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(Schleifer & Ludwig, 1995). Este gene ainda é o alvo mais comumente utilizado em estudos de diversidade bacteriana. Este gene é um marcador universal altamente conservado com funções bem definidas desde os primórdios da evolução e é relativamente não afetado por pressões ambientais. Isto, junto ao tamanho do gene, faz com que ele seja um bom relógio evolutivo (Kimura et al., 1997; Mohania et al., 2008). Mesmo sendo considerado um marcador universal bem conservado existem deficiências associadas ao seu uso. Primeiro, por ser bem conservado ele limita o poder de resolução. Segundo, o gene 16S rRNA aparece em diferentes espécies de bactérias em diferentes números cópias do gene (Mohania et al., 2008).

Para superar estes problemas a utilização de genes classificados como

housekeeping, genes constitutivos que são requeridos para a manutenção das

funções celulares básicas, vem surgindo como uma alternativa para a resolução destes problemas (Naser et al., 2007). Estudos recentes in silico baseados em genomas completos têm providos as bases para o estabelecimento de uma serie de genes housekeeping que podem predizer precisamente o parentesco genômico aumentar a precisão da identificação das espécies. A necessidade por marcadores genômicos alternativos que forneçam mais altos níveis de discriminação do que o gene 16S rRNA têm levado a um sequenciamento sistemático de genes

housekeeping (Coenye et al., 2005; Gevers et al., 2005; Konstatinidis & Tiedje, 2005;

Naser et al., 2005a).

Os estudos de análises de sequências de loco único (SLSA - Single-locus sequence analysis) focam genes codificadores de proteínas que tem evolução relativamente lenta, porem mais rapidamente do que os genes 16S rRNA, para obter uma alta resolução taxonômica (Figura 3).

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Para ser utilizado para discriminação de espécies, é ideal que os gene esteja presente em uma única copia no genoma, evoluir com maior rapidez do que os genes rRNA e ser amplamente distribuídos entre os genomas bacterianos. Aqueles genes nos quais a recombinação pode conferir uma vantagem seletiva, ou genes ligados estreitamente, devem ser evitados. Além disso, estes genes devem ser informativos e com um adequado grau de resolução e fornecer variabilidade para diferenciar espécies de um gênero em particular (Naser et al., 2007).

A utilização de genes housekeeping tal como o gene que codifica a subunidade α da RNA polimerase (gene rpoA) e a enzima fenilalanina-tRNA sintetase bacteriana (gene pheS) têm se mostrado como um robusto sistema para a identificação de todas as espécies reconhecidas de Enterococcus (Naser, et al., 2005b) e de todas as espécies do gênero Lactobacillus (Naser et al., 2007). A partir

Figura 4. Árvore filogenética feita a partir de sequências do gene 16S mostrando a posição do

Lactobacillus hammesii sp. nov. strains LP38T e LP39 entre alguns lactobacilli. (Reproduzido de Valcheva et al., 2005)

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da análise dos genes pheS e ropA é possível fazer a diferenciação efetiva das espécies de Lactobacillus com um alto nível de discriminação quando comparado com o gene 16S rRNA.

RecA é uma pequena proteína essencial para o reparo e manutenção do DNA. Está envolvida no processo de recombinação homóloga do DNA, indução do sistema SOS (um sistema de reparo do DNA pós-replicação), e indução dos mecanismos de reparação de lesões no DNA. Devido ao seu papel fundamental, o gene recA é ubíquo, e seu produto tem sido proposto como um marcador filogenético para espécies muito próximas (Felis et al., 2001; Torriani et al., 2001). O uso desta metodologia para a diferenciação de três espécies do grupo Lactobacillus

plantarum (L. plantarum, L. pentosus e L. paraplantarum) teve êxito e mostrou um

alto poder discriminatório no uso deste gene para separar espécies de difícil diferenciação, tais como Bifidobacterium longum e Bifidobacterium infantis. Validando a utilização deste gene como marcador filogenético-taxonômico para espécies relacionadas, abrindo uma nova possibilidade para uma rápida e segura identificação de LAB importantes de uso industrial.

Silvers et al. (2003) determinou as sequências de nucleotídeos do gene atpD que codifica a subunidade β da ATPase das bactérias Oenococcus oeni,

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Pediococcus damnosus, Pediococcus parvulus, Lactobacillus brevis e Lactobacillus hilgardii. A árvore obtida

a partir destas sequências indicaram que O. oeni e L. mesenteroides subsp.

mesenteroides formaram um grupo bem separados de P. damnosus e P. parvulus

e das duas espécies de Lactobacillus.

Tapp et al. (2003) em seus estudos, do gene rnpB, que é universalmente presente em bactérias Gram-positivas com baixo conteúdo de G+C e, que codifica a

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subunidade de RNA da endoribonuclease P, revelou que o mesmo se mostrou adequado para analises filogenéticas de taxa relativamente próximos e como uma potencial ferramenta para discriminação de espécies dentro do gênero

Streptococcus. Em outro estudo, o uso de sequências parciais do gene rpoB, que

codifica a subunidade altamente conservada da RNA polimerase bacteriana. As sequências do gene rpoB mostraram um maior poder discriminatório do que sequências do gene 16S rRNA para a identificação de LAB dos gêneros

Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia e Granulicatella (Drancourt et al., 2004).

2.4.8. Rep-PCR

A técnica Rep-PCR faz uso de sequências oligonucleotídicas iniciadoras complementares de sequências de DNA repetitivas muito conservadas e presentes em numerosas cópias no genoma da maioria das bactérias Gram-negativas e de várias bactérias Gram-positivas.

Foram identificadas três famílias de sequências repetitivas: 1) as sequências REP (Repetitive Extragenic Palindromic elements) com 35-40 pares de bases, as quais são altamente conservadas em várias espécies bacterianas; 2) as sequências ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus elements) de 124-127 pares de bases, as quais contêm um elemento repetitivo central invertido altamente conservado e que estão localizados nas regiões extragênicas do genoma bacteriano; 3) o elemento BOX de 154 pares de bases.

A amplificação das sequências entre cada um destes elementos repetitivos têm sido utilizadas para gerar perfis de DNA de várias espécies bacterianas, tanto

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Gram-positivas quanto Gram-negativas (Vuyst et al., 2008). Sequências com unidades de repetição (GTG)5 aparecem distribuídas amplamente nos genomas de

diversos grupos de bactérias. A amplificação das sequências destes elementos repetitivos gera padrões de impressões genéticas (DNA fingerprints) específicos para diversas espécies de Lactobacillus (Gevers et al., 2001) e Enterococcus (Švec

et al., 2005), permitindo uma especiação e tipagem rápida, precisa e confiável.

A Rep-PCR consiste em uma técnica com alto poder discriminatório, baixo custo, adequado para discriminação de linhagens e pode ser considerada como uma ferramenta confiável para a classificação e tipagem de um grande numero de bactérias Gram-negativas e várias bactérias Gram-positivas (Gevers et al., 2001).

Hyytiä-Trees et al. (1999) sugeriu que um adequado nível de discriminação entre linhagens de Lactobacillus sakei pode ser conseguido com o uso combinado da Rep-PCR usando primers BOX e REP e RAPD. Enquanto que, Sohier et al. (1999) demonstrou a aplicabilidade da rep-PCR para identificar as espécies de

Lactobacillus hilgardii e Lactobacillus brevis.

A técnica de Rep-PCR utilizando o iniciador (GTG)5 é uma ferramenta rápida,

de fácil perfomance e, reprodutível para a diferenciação de uma grande variedades de Lactobacillus associados a alimentos no nível de espécie, subespécie e, potencialmente, ate o nível de linhagem, com um protocolo de desempenho simples. Esta técnica consiste em uma ferramenta genotípica promissora para a especiação e tipagem rápida e confiável de Lactobacillus entre outras LAB em indústrias de fermentação (Gevers et al., 2001, Lucena et al., 2010).

Vuyst et al. (2008) fez a utilização do primer (GTG)5 que permitiu a

identificação da impressão genética das bactérias ácido acético (AAB - Acetic Acid Bacteria) durante um dia de trabalho. Fazendo uso desta ferramenta para a

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classificação e identificação de AAB no nível de espécies, bem como a para a caracterização destas bactérias ao nível intraespecífico. A utilização do primer (GTG)5 pode aumentar o conhecimento a cerca da ecologia biodiversidade tanto das

LAB como das AAB e ajudar a determinar com mais precisão o seu comportamento de crescimento e benéficos ou indesejáveis papeis durante várias etapas da fermentação de alimentos.

Diante disto, a taxonomia dos procariotos vem evoluindo juntamente com os avanços nas áreas de Genética de Populações de microrganismos, Ecologia, Genômica, Transcripitônica e na facilidade de obtenção de dados sequênciamento. Isto faz com que os conceitos de espécie sejam revistos.

Avanços na área molecular leva a crer que o futuro da taxonomia e sistemática microbiana terá como base a abordagem de análise de sequências de DNA (Gevers et al. 2005). Assim esta abordagem pode ser utilizada para o estudo de populações complexas de microganismos como a do processo de fermentação etanólica industrial. O conhecimento das espécies bacterianas que entram no processo fermentativo contribuirá para um maior controle das contaminações bacterianas que diminuem o rendimento da produção de etanol. Isto trará benefícios econômicos para o setor industrial.

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3. Objetivos