Genes de plantas mediadores da resistência a doenças (Genes R)

A resistência das plantas a doenças provocadas por estirpes específicas de patogénios enquadra-se normalmente num tipo de interacção gene-for-gene que pressupõe que a resistência a um patogénio é dependente da existência de um gene de avirulência (Avr) no patogénio e de um gene de resistência (R) na planta (Hammond- Kosack e Jones, 1997). Segundo esta hipótese, os mecanismos de defesa das plantas são activados pelo produto dum gene de resistência (R) do hospedeiro, após reconhecimento do produto do gene de avirulência (AVR) do agente patogénico que lhe corresponde. O modelo molecular em que se baseia a interacção específica do tipo gene-for-gene define a existência de um ligando e de um receptor, em que o produto do gene R actua como um receptor que reconhece um ligando, ou eliciador, produzido directa ou indirectamente pelo gene AVR do patogénio ou reconhece o factor AVR de forma indirecta através de um co-receptor (Hammond-Kosack e Jones, 1997; Dixon et al., 2000). A interacção directa entre uma proteína R e um factor AVR foi demonstrada para o sistema de proteínas Pto do tomateiro e AvrPto existente nalgumas estirpes de

bactérias Pseudomonas syringae pv. tomato, entre a proteína do arroz Pi-ta e o produto do gene AVR-Pita, expresso pelo fungo do arroz, Magnaphorthe grisea e entre o produto do gene RPS2 de Arabidopsis thaliana e as estirpes de bactérias P. syringae, possuidoras do gene de avirulência avrRpt2 (Tang et al., 1996; Jia et al., 2000; Leister e Katagiri, 2000). O gene Pto, do tomateiro confere resistência a estirpes de Pseudomonas syringae pv. tomato que possuem o gene AvrPto, com ocorrência de uma resposta hipersensível por parte da planta, característica de uma interacção de incompatibilidade. A bactéria Pseudomonas introduz nas células do tomateiro o produto do gene AvrPto, que codifica uma proteína hidrofílica de 18,3 kDa, através de um sistema de secreção tipo III, que vai interagir directamente com o produto do gene Pto que codifica uma proteína citoplasmática de 321 aminoácidos, com características de serina/treonina quinase, capaz de autofosforilação (Hammond-Kosack e Jones, 1997; Bogdanove e Martin, 2000). A especificidade quanto ao reconhecimento de AvrPto é determinada por um único resíduo em Pto, a treonina 204 (Frederick et al., 1998). A resposta de defesa é desencadeada pela interacção AvrPto-Pto, com activação do próprio receptor, a quinase (Pto) e, subsequentemente, responsável pela fosforilação doutras quinases em reacções em cadeia, tais como os factores de transcrição Pti4/5/6 e a serina/treonina quinase Pti1. Pti4, Pti5 e Pti6 são potenciais factores de transcrição envolvidos na activação de genes relacionados com a patogénese e Pti1 está associada à resposta hipersensível (van der Biezen e Jones, 1998). A interacção incompatível entre a planta do arroz (Oryza sativa), que expressa o gene Pi-ta e algumas estirpes do fungo patogénico Magnaporthe grisea, que expressam o gene AVR-Pita, é outro exemplo de interacção do tipo gene-for-gene que segue o formato receptor-ligando. Jia et al. (2000) mostraram que a expressão transitória da metaloprotease AVR-Pita176, correspondente à forma activa da proteína AVR-Pita, no interior das células vegetais, resulta numa resposta hipersensível dependente da proteína Pi-ta. Em experiências de interacção proteína-proteína, tipo far-western realizadas in vitro, observaram que o factor de avirulência se liga especificamente ao domínio rico em leucinas LRD (leucine–rich domain-LRD) da proteína Pi-ta, em ensaios realizados no yeast two–hybrid system. A resposta de defesa mediada pelo gene Pi-ta não ocorre quando são feitas substituições pontuais de aminoácidos no LRD da proteína Pi-ta ou na sequência com o motivo associado à função de protease em AVR- Pita176, tanto no sistema da levedura como nos ensaios in vitro, porque estas substituições destroem a possibilidade de interacção física entre o ligando e o receptor (Jia et al., 2000). Em A. thaliana foi observado, in vivo, a formação de um complexo

entre as proteínas RPS2 (produto do gene R-receptor) e AvRpt2A (produto do factor de avirulência-ligando) através de co-imunoprecipitação das proteínas, após expressão dos genes em protoplastos (Leister e Katagiri, 2000).

Alguns autores apresentam alternativas ao modelo receptor/ligando para ilustrar a interacção gene-for-gene, propondo o modelo do “gene guardião” (Dixon et al., 2000). Neste sistema, os factores de avirulência codificados pelo patogénio interagem com proteínas do hospedeiro, modificando as suas funções, de forma a aceder aos nutrientes ou suprimindo os mecanismos de defesa. A associação entre o factor Avr e as proteínas celulares é especificamente reconhecida pelas proteínas R que activam, em seguida, os mecanismos de defesa. As proteínas R funcionam como “guardiões” das proteínas celulares do hospedeiro. A existência de um co-receptor foi observada na interacção incompatível relativa ao sistema patogénico planta do tomate/fungo Cladosporium fulvum, em que intervêm a proteína R codificada pelo gene Cf-2 e o factor de avirulência Avr2. Neste sistema foi identificada a proteína Rcr3, que parece ser o alvo de Avr2 e que é indispensável para que ocorra uma resposta de defesa mediada por Cf-2 (Dixon et al., 2000). As respostas de defesa por parte dos hospedeiros, mediadas pelos genes de resistência, reflectem-se no mesmo tipo de eventos descritos para a interacção criptogeína-células do tabaco (Toyoda et al., 2002).

No decurso dos últimos anos, a clonagem de vários genes de resistência e a caracterização dos produtos deduzidos a partir da sequência nucleotídica respectiva, contribuíram de forma significativa para o conhecimento das bases moleculares da resistência específica nas plantas. Os genes R foram isolados de várias espécies vegetais (tomate, linho, arroz, tabaco, beterraba, milho) e conferem resistência a fungos, bactérias, vírus e nemátodos (Tabela 9). A comparação das sequências das proteínas R revela uma grande homologia entre elas e a existência de motivos estruturais conservados independentemente do organismo para o qual conferem resistência. Quase todos os produtos dos genes R combinam um domínio receptor e um domínio transmissor e asseguram duas funções principais: o reconhecimento das moléculas eliciadoras através de mecanismos de interacção proteína-proteína e a activação directa ou indirecta de sinais de transdução (Noir e Lashermes, 2000).

A classe de genes R mais representada é a que codifica proteínas citoplasmáticas que possuem três regiões distintas: LRR localizada na extremidade carboxílica e implicada em interacções proteína-proteína; local de ligação de nucleotídeos (Nucleotide-Binding Site-NBS), localizada no centro e que corresponde ao local de

fixação e de hidrólise dos nucleótidos trifosfato ATP e GTP; TIR (Toll/Interleukin-1 Resistance) e LZ (Leucine Zipper), localizadas na extremidade NH2. A região TIR foi definida por homologia com os domínios intracelulares da proteína Toll da Drosophila e com o receptor interleuquina-1 dos mamíferos. A região LZ é, por vezes, denominada enrolamento helicoidal (CC-Coiled-Coil), por se considerar que a sequência do motivo LZ facilita a formação de estruturas do tipo CC que promovem a formação de dímeros ou a formação de interacções específicas com outras proteínas. Os domínios LRR correspondem à repetição de um motivo de tamanho variável constituído por leucinas e/ou por outros resíduos hidrofóbicos e pode, nalguns casos, ter associado um domínio serina/treonina quinase que, normalmente, está implicado nas reacções de fosforilação associadas às reacções em cadeia para transmissão de sinais (Hammond-Kosack e Jones, 1997; Toyoda et al., 2002).

No domínio NBS estão presentes os motivos quinase 1a (P-loop; phosphate- binding loop), quinase 2 e quinase 3a, que apresentam uma homologia de aproximadamente 50 % com a região compreendida entre os aminóacidos 92 e 412 das proteínas APAF-1 e CED-4 reguladoras da actividade das proteases envolvidas na morte celular (apoptose) nos animais (van der Biezen e Jones, 1998a; Zou et al., 1999). A descoberta da existência de homologia entre o domínio NBS das proteínas R e as proteínas ligadas à morte celular programada nos animais é muito interessante porque os mecanismos de defesa das plantas incluem a resposta hipersensível que é um tipo de apoptose. A relação encontrada levou à redefinição da designação do domínio NBS, passando actualmente a designar-se NB-ARC, que significa local de ligação de nucleótidos (Nucleotide Binding site) partilhado por APAf-1, alguns produtos dos genes R e CED-4 (Figura 46) (Van der Biezen e Jones, 1998a).

A classe NBS-LRR de proteínas R é abundante nas plantas. Em Arabidopsis, por exemplo, estima-se que existam pelo menos 200 genes NBS-LRR diferentes, o que corresponde a 1 % do genoma. Alguns destes genes já foram identificados, tais como RPS2 e RPM1, com a estrutura LZ-NBS-LRR e os genes RPP5 e RPP1, com a estrutura TIR-NBS-LRR (Mindrinos et al., 1994; Grant et al., 1995; Parker et al., 1997; Botella et al., 1998). Os genes de resistência estão normalmente organizados na forma de cluster e os genes que integram estes agrupamentos podem apresentar diferentes graus de recombinação. RPP5 faz parte de uma família de genes agrupados num locus e codificam proteínas de resistência contra Peronospora parasitica. Recentemente, foram completamente sequenciados e analisados os haplotipos (conjunto de genes que

integram um locus complexo) em Arabidopsis ecotipo Landsberg erecta (Ler) e Columbia (Col-0) (Nöel et al., 1999). Numa sequência de DNA de 95 kb do haplotipo de RPP5, em Ler, foram encontrados dez genes homólogos a RPP5 [La-A (RPP5) a La- J], todos orientados no mesmo sentido, com excepção do La-J e em 90 kb do haplotipo de RPP5, em Col-0, foram encontrados oito genes homólogos, orientados no mesmo sentido. A localização relativa dos genes, o número de homólogos, a posição de cada gene no interior do cluster e as sequências das regiões intergénicas divergem muito entre os dois haplotipos. Em Arabidopsis o polimorfismo intra-específico é extraordinariamente elevado no locus RPP5. Os membros da família RPP5 têm entre 13 a 23 motivos LRR adquiridos por duplicações ou eliminações. Prevê-se que tenham evoluído de um ancestral comum possuidor de oito motivos LRR. Teoricamente, um gene em Ler (La-A; RPP5) e dois em Col-0 (Col-B e Col-F) codificam proteínas completas do tipo TIR-NBS-LRR, responsáveis por conferir resistência ao fungo. Os restantes genes possuem nas suas sequências codões de terminação ou insersões por retrotransposição (Nöel et al., 1999).

TIR NBS LRR CC NBS LRR TIR TIR CARD NBS TM TM TM TM WD LRR LRR LRR Ig Ig Ig Ig SER/THR QUINASE PLANTAS ANIMAIS Membrana plasmática Apoplasma Citoplasma Meio extracelular L6, N, RPP5 M, RPP1 RPS2, RPM1, I2 Prf, Xa1, RPP8 RPS5, Mi, RGC2 SER/THR QUINASE Pto Cf-2/4/5/9 Xa21 Apaf1 Toll Interleukin-1 TIR NBS LRR CC NBS LRR TIR TIR CARD NBS TM TM TM TM WD LRR LRR LRR Ig Ig Ig Ig SER/THR QUINASE PLANTAS ANIMAIS Membrana plasmática Apoplasma Citoplasma Meio extracelular L6, N, RPP5 M, RPP1 RPS2, RPM1, I2 Prf, Xa1, RPP8 RPS5, Mi, RGC2 SER/THR QUINASE Pto SER/THR QUINASE Pto Cf-2/4/5/9 Xa21 Apaf1 Toll Interleukin-1

Figura 46. Representação esquemática dos domínios conservados dos produtos dos genes de resistência a doenças, nas plantas e de proteínas do sistema imunológico, nos animais. As proteínas de resistência L6, N, RPP5, M, RPP1 pertencem à classe TIR-NBS-LRR; RPS2, RPM1, I2, Prf, Xa1, RPP8, RPS5, Mi e RGC2 pertencem à classe CC-NBS-LRR; Cf-2, Cf-4, Cf-5 e Cf-9 pertencem à classe II, Pto pertence à classe III e Xa21 pertence à classe IV (Tabela 9). Apaf1 é um regulador da morte celular, nos

mamíferos, com três domínios funcionais: CARD, caspase recruitment domain; WD, WD-40 repeat; NBS, nucleotide binding site. NBS por vezes denomina-se NB-ARC. Os receptores Toll existentes em humanos e em Drosophila e o receptor Interleukin-1, existente em mamíferos, possuem domínios intracelulares TIR e possuem uma homologia de 20 % com as proteínas de resistência das plantas. LRR:

leucine-rich repeat; NBS: nucleotide binding site; CC: coiled-coil; TM: domínio transmembranar; TIR: toll/interleukin-1 resistance; Ig: imunoglobulina (Pan et al., 2000; Toyoda et al., 2002; Van der Biezen e

Jones, 1998).

A resistência por parte da planta do tomate ao fungo do solo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (F. o. Lycopersici), ilustra bem a complexidade associada aos genes NBS-LRR. O locus I2 na planta do tomate é responsável por conferir resistência à estirpe 2 de F. o. Lycopersici e compreende uma família múltipla de genes, designada por complexo I2C. Os genes desta família estão distribuídos por 3 cromossomas diferentes, estando 2 grupos de vários genes localizados no cromossoma 11 (Ori et al., 1997). A família I2C do cromossoma 11 é composta por sete membros, dos quais apenas I2 é um gene funcional que confere resistência completa à estirpe 2 de F. o. Lycopersici (Simons et al., 1998). Recentemente, Sela-Buurlage et al. (2001) realizaram testes de patogenicidade com várias estirpes de F. o. Lycopersici em 53 estirpes de L. esculentum que possuíam, por introgressão, regiões do genoma de L. pennellii e identificaram seis loci de genes que conferem resistência, de forma independente, às estirpes 1, 2 e 3 de F. o. Lycopersici. Um dos locus identificado foi o I2 anteriormente caracterizado, observando-se que, neste locus, genes individuais, pertencentes a uma mesma família, podem conferir níveis de resistência diferentes a F. o. Lycopersici, estirpe 2. A complexidade é criada pela existência de muitos genes funcionais num único locus dum complexo de resistência e, também, pela presença de muitos loci independentes.

No entanto, as proteínas R pertencentes à classe NBS-LRR também podem ser codificadas por um único gene que possui vários alelos. O locus L que codifica proteínas da classe TIR-NBS-LRR, na planta do linho, possui 13 alelos (L, L1 a L11 e LH). A comparação das sequências nucleotídicas de 11 destes alelos, revela que possuem entre si uma identidade superior a 90 % (Ellis et al., 1999). A especificidade destes alelos em interações do tipo gene-for-gene está relacionada com as regiões TIR e LRR. Esta dedução resulta da análise comparativa efectuada com as sequências em aminoácidos das proteínas deduzidas dos alelos L6, L7 e L11 e por análises realizadas com plantas transgénicas em que foram introduzidos genes L híbridos, resultantes de trocas de sequências entre alelos, realizadas in vitro. Os alelos L6 e L11 diferem apenas na região LRR, ao passo que os alelos L6 e L7 diferem na região TIR, indicando que os

polimorfismos nestas regiões podem afectar a especificidade da resistência (Ellis et al., 1999). Em Arabidopsis, o locus RPP13 possui um gene com dois alelos que, curiosamente, codificam proteínas do tipo LZ-NBS-LRR com características funcionais distintas (Bittner-Eddy et al., 2000). O alelo RPP13-Nd confere resistência a cinco isolamentos diferentes de Peronospora parasitica e o alelo RPP13-Rld confere resistência a mais um isolamento não reconhecido pelo outro alelo.

Alguns trabalhos muito recentes têm posto em evidência a complexidade implicada na transmissão de sinais para activação dos mecanismos de defesa nas plantas mediados por genes de resistência da classe NBS-LRR. Em Arabidopsis Col-0 foi identificado o gene RPP4, que é ortólogo (genes que pertencem a espécies diferentes, mas asseguram a mesma função e ocupam uma posição correspondente nos cromossomas) de RPP5 em Ler que, para além de estar envolvido na resistência a P. parasitica Noco2, também confere resistência às estirpes Emoy2 e Emwa1 (van der Biezen et al., 2002). Por comparação entre as sequências em aminoácidos das proteínas RPP4 e RPP5 foram identificados resíduos importantes para a especificidade de reconhecimento das estirpes, localizados nas regiões TIR e LRR. A resistência mediada por RPP4 envolve vários componentes associados à transmissão de sinal nas reacções de defesa, tais como: DTH9; EDS1; PAD4; PBS2 e PBS3; SID1 e SID2. Para além destes factores foi também observado que a acção de RPP4 diminui quando é inibida a fenilalanina-amónia-liase (PAL), um gene associado à síntese de ácido salicílico. A dependência de RPP4 em EDS1 confirma estudos efectuados em Arabidopsis, que puseram em evidência que as proteínas de resistência do tipo TIR-NB-LRR (RPP1; RPP5; RPS4) empregam vias diferentes para transmissão de sinais das proteínas R do tipo LZ-NB-LRR (RPS2; RPS5; RPM1) durante as respostas de defesa. As primeiras funcionariam através da proteína lipídica EDS1 e as segundas através da proteína NDR1, uma proteína associada à membrana plasmática (Aarts et al., 1998; Van der Biezen et al., 2002).

A classificação dos genes de resistência compreende, para além da classe NB-LRR anteriormente referida, mais três classes. A segunda classe é representada principalmente pelos genes Cf-2, Cf-4, Cf-5 e Cf-9 da planta do tomate, que codificam proteínas possuidoras dum domínio LRR extracelular, dum domínio transmembranar e duma pequena região citoplasmática e que conferem resistência contra o fungo patogénico Cladosporium fulvum. A terceira classe possui apenas o gene Pto, também da planta do tomate, que codifica uma proteína quinase do tipo serina/treonina. A quarta

classe é representada pela proteína codificada pelo gene Xa21 da planta do arroz, que possui um domínio extracelular, uma região transmembranar e um domínio citoplasmático do tipo serina/treonina quinase e que confere resistência contra a bactéria Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Figura 5). Pto é o único produto dum gene R que não possui domínio LRR e que, para activar o sistema de defesa, requer a presença do factor Prf (Pseudomonas resistance and fenthion sensitivity), uma proteína do tipo NBS-LRR (Hammond-Kosack e Jones, 1997; Noir e Lashermes, 2000).

Em vários locus dos genes de resistência tem-se constatado que genes homólogos pertencentes a um mesmo cluster conferem resistência a organismos de origem diferente. É o caso dos genes Gpa2 e Rx1, na planta da batata, que pertencem ao locus Gpa2 e que conferem resistência contra o nemátodo Globodera pallida e contra o vírus X da batata, respectivamente. Estes genes codificam duas proteínas do tipo LZ-NBS-LRR, com uma homologia de 88 % entre si (Van der Vossen et al., 2000).

A estrutura e a organização dos genes R e dos factores de avirulência mostram que são genes sujeitos a pressão selectiva recíproca e que, como consequência, evoluem em paralelo. Os agentes patogénicos apresentam algumas vantagens que derivam da frequência do ciclo generativo e também, do tamanho das populações. Os mecanismos moleculares que parecem estar na origem da evolução dos genes R e no aparecimento de novas especificidades, mediante a pressão exercida pelos agentes patogénicos, são as mutações pontuais sinónimas ou não sinónimas, combinadas com mecanismos de recombinação, eliminação, duplicação e transposição dos genes, no interior de um mesmo cluster. Michelmore e Meyers (1998) consideram que a evolução das especificidades dos genes R, em particular da classe NBS-LRR, é assegurada, principalmente, por mecanismos de recombinação inter-alélicos e de conversões de genes que não se expressam ou são inactivos, como os pseudogenes.

Tabela 9. Genes de resistência a doenças nas plantas e factores de avirulência respectivos.

Planta Gene de resistência Agente patogénico Factores de avirulência Referência bibliográfica

Arabidopsis thaliana RPM1 RPS2 RPS5 RPS4 RPP5 RPP1; RPP10; RPP14 RPP8 RRS1

Pseudomonas syringae pv maculicola Pseudomonas syringae pv tomato Pseudomonas syringae pv tomato Pseudomonas syringae pv tomato

Peronospora parasitica Peronospora parasitica Peronospora parasitica Ralstonia solanacearum AvrRpm1, avrB AvrRpt2 AvrPph3, AvrPphB AvrRps4 ? ? ? ? Grant et al., 1995 Mindrinos et al., 1994 Warren et al., 1998 Gassmann et al., 1999 Parker et al., 1997 Botella et al., 1998 McDowell et al., 1998 Deslandes et al., 2002 Linum usitatissimum (Linho) M L6 Melampsora lini Melampsora lini ? ? Anderson et al., 1997 Lawrence et al., 1995 Lactuca sativa

(Alface) RGC2 Bremia lactucae ? Meyers et al., 1998

Oryza sativa L.

(arroz)

Xa1 Xa21

Pib

Xanthomonas oryzae pv. oryzae estirpe 1 Xanthomonas oryzae pv. oryzae estirpe 6

Magnaporthe grisea ? ? ? Yoshimura et al., 1998 Song et al., 1995 Wang et al., 1999 Lycopersicon esculentum (tomate) Pto; Prf Mi I2 Cf2 Cf9 Cf4

Pseudomonas syringae pv tomato Meloidogyne spp

Fusarium oxysporum f sp. lycopersici estirpe 2 Cladosporium fulvum Cladosporium fulvum Cladosporium fulvum AvrPto ? ? Avr2 Avr9 Avr4 Salmeron et al., 1996 Milligan et al., 1998 Simons et al., 1998 Dixon et al., 1996 Jones et al., 1994 Thomas et al., 1997 Nicotiana spp

(tabaco) N TMV (tobacco mosaic virus) Replicase Whitham et al., 1994

Zea mays L.

(Milho) Rp1 Puccinia sorghi ? Collins et al., 1999

Solanum tuberosum L. (Batata) Rx Gpa2 PVX (Potato virus X) Globodera pallida Proteína do capsídeo ? Bendahmane et al., 1999 van der Vossen et al., 2000

II.2. OBJECTIVOS

Q. suber é um hospedeiro do fungo fitopatogénico P. cinnamomi o qual exerce a sua acção invadindo, colonizando e destruindo os tecidos radiculares das raízes mais finas. O processo infeccioso é denunciado pela presença de necroses no local da infecção que reflectem uma resposta hipersensível por parte do hospedeiro e/ou a acção de toxinas libertadas pelo fungo. Os aspectos moleculares da interacção entre o sobreiro e P. cinnamomi são desconhecidos.

Pretendeu-se com este trabalho, identificar e caracterizar genes de Q. suber relacionados com o processo infeccioso. A comparação das estruturas das proteínas codificadas por estes genes com as de proteínas homólogas, já caracterizadas noutras espécies de plantas, teve como objectivo elucidar as suas funções relacionadas com a