4 POPULAÇÃO ESTUDADA, MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 GRUPOS DE INDIVÍDUOS TRATADOS E DE NÃO INFECTADOS
Os pacientes participantes neste estudo, num total de 81 indivíduos, foram reunidos
aleatoriamente, ambos os gêneros, entre aqueles atendidos no ambulatório Paulo Araújo
Magalhães, no Município de Caratinga (MG), com diagnóstico de LTA. Como grupo
controle, foram avaliados moradores da mesma região, sem história clínica de LTA e com
sorologia negativa para leishmaniose. O critério de inclusão neste estudo foi a positividade
para o teste de Montenegro e, ou parasitológico para Leishmaniose e indicação de tratamento.
Estes indivíduos foram tratados quando apresentaram diagnóstico clínico para LTA,
confirmado por, pelo menos, um diagnóstico laboratorial: teste parasitológico ou teste de
Montenegro. Os indivíduos positivos foram divididos e submetidos a diferentes tratamentos:
Glucantime®, Leishvacin® e Glucantime® associado ao Leishvacin®. Alguns destes
pacientes foram tratados nos anos 1992 e 1993 (denominados de Grupo Antigo), os outros
4.1.1 Grupo de pacientes tratados com Glucantime® (Quimioterapia)
O Glucantime® foi administrado na dose diária de 1mL/5Kg/peso, sem exceder a dose de
10mL/dia, em séries de dez dias. A série foi repetida após o intervalo de dez dias até a cura
clínica. O período de 10 dias de tratamento e 10 dias de intervalo foi considerado como uma
série de tratamento.
4.1.1.1 Pacientes tratados em 2001/2002 (Grupo Recente)
Este grupo constituiu-se de dez pacientes tratados com o antimonial pentavalente (SbV) o
N-metilglucamine (Glucantime® da Rhodia, Santo André, SP) contendo 85 mg do antimonial
por mL, por via intramuscular profunda. O grupo compôs-se de três pacientes do sexo
feminino e sete do masculino, com a média de idade 29 anos; intervalo de 12 a 71 anos; com
lesões localizadas nos membros inferiores. O teste parasitológico para o diagnóstico foi
negativo em oito pacientes e o teste Montenegro foi positivo em nove pacientes. O tempo
médio da evolução da lesão, antes do tratamento, foi de 65 dias, com intervalo de 12 a 90
dias. Lesão única foi observada em seis dos pacientes deste grupo. O número de séries de
Glucantime® aplicadas aos pacientes variou de dois a oito, equivalentes a 40 a 160 dias de
tratamento.
4.1.1.2 Pacientes tratados em 1992/1993 (Grupo Antigo)
Glucantime® via intramuscular, na dose de 1mL/5Kg/peso, sem exceder 10 mL /dia. Sendo
cinco pacientes do sexo feminino e três do masculino. A média de idade foi de 39 anos, com
intervalo de 12 a 42 anos, apresentando lesões localizadas nos membros inferiores, teste
parasitológico para o diagnóstico negativo em três casos. Nestes casos, o diagnóstico foi
realizado pelo teste de Montenegro –TM e exame clínico. O tempo médio da evolução da
lesão, antes do tratamento, foi de 118,5 dias, com intervalo de 38 a 210 dias. Todos
apresentaram lesão única, com exceção de um paciente que apresentou cinco lesões. Neste
grupo de pacientes, o esquema de tratamento foi o mesmo descrito para o grupo dos tratados
com Glucantime®. Os pacientes foram tratados com duas a seis séries, variando de 40 a 120
dias.
4.1.2 Grupo de pacientes tratados em 2001/2002 com Leishvacin® (Imunoterapia Seriada)
Os pacientes deste grupo foram tratados com Leishvacin® aplicado por via subcutânea. Este grupo
incluiu três pacientes do sexo feminino e quatro do masculino, com média de idade de 44 anos e
intervalo de 20 a 65 anos. As lesões foram observadas no abdome, membros superiores e inferiores.
No teste parasitológico para o diagnóstico, o resultado foi negativo em dois casos e para o teste de
Montenegro, positivo em quatro pacientes, o tempo médio da evolução da lesão, antes do
tratamento de 89 dias, com intervalo de 15 a 240 dias. Observou-se lesão única em quatro dos
pacientes estudados.
Dentro deste grupo de sete pacientes, a vacina (concentração nitrogênio total 240 µg/mL) foi administrada por via subcutânea, no quadrante superior externo do antebraço (Oliveira-Lima
informação pessoal ao Prof. Wilson Mayrink), de acordo com o esquema estabelecido por
Mayrink et al. (1991), resumido a seguir:
Primeiro dia 100µL
Segundo dia 200µL
Terceiro dia 300µL
Quarto dia 400µL
Quinto ao décimo dia 500µL
Após o intervalo de 10 dias, a medicação na dose diária de 500µL foi repetida até a cura clínica do paciente.
O número de séries de Leishvacin® para o tratamento dos pacientes deste grupo, variou de 2 a
7, ou ainda de 40 a 140 dias.
O tratamento foi realizado com Leishvacin® preparada pelo Laboratório de Leishmanioses do
Departamento de Parasitologia, ICB – UFMG, utilizando-se promastigotas mortas de
Leishmania L. amazonensis cepa IFLA/BR/67/PH8, seguindo a técnica proposta por Mayrink
et al. (1979) e sob o controle de qualidade da Escola de Farmácia da Universidade Federal de
4.1.3 Grupo de pacientes tratados com a associação de Glucantime® com Leishvacin®
(Imunoquimioterapia)
4.1.3.1 Pacientes tratados em 2001/2002 (Grupo Recente)
Deste grupo, participaram sete pacientes tratados com a vacina contra-LTA via subcutânea,
como já descrito, aplicando-se, simultaneamente, o Glucantime® por via intramuscular, na
dose de 1mL/5Kg/peso como detalhado para o grupo de pacientes tratados com Glucantime®.
O grupo foi composto por um paciente do sexo feminino e seis pacientes do sexo masculino. A
média de idade foi de 27 anos, com intervalo de 16 a 41 anos com lesões localizadas no abdome,
pescoço, cabeça, membros superiores, membros inferiores e do teste parasitológico para
diagnóstico, foi negativo em um caso, enquanto o teste de Montenegro foi positivo em cinco
pacientes. O tempo médio da evolução da lesão, antes do tratamento, foi de 67 dias, com intervalo
de 30 a 90 dias. Com exceção de um dos pacientes, que teve o material após o tratamento coletado
1825 dias após o diagnóstico de cura clínica. Dentre os pacientes deste grupo, quatro apresentavam
lesão única.
O número de séries da associação Leishvacin® e Glucantime® dos pacientes deste grupo
4.1.4 Pacientes tratados em 1992/1993 (grupo antigo)
Este grupo foi representado por sete pacientes tratados com Leishvacin® via subcutânea e,
simultaneamente, com o Glucantime® via intramuscular. Entre eles, cinco pertenciam ao sexo
feminino e dois ao masculino. A média de idade foi de 28 anos, com intervalo entre 13 e 64
anos. Nestes pacientes a lesão era única, localizada nos membros inferiores. Em apenas um
caso a lesão foi dupla. Nestes sete pacientes, o teste parasitológico foi positivo para todos. O
tempo aproximado da evolução das lesões, antes do tratamento, foi em média 75 dias, com
intervalo de 45 a 90 dias. O esquema de tratamento foi o mesmo apresentado para os
pacientes do grupo tratado com a associação de Glucantime® e Leishvacin®.
Os pacientes deste grupo foram tratados diferentemente quanto ao número de séries (três a
oito). Cada série correspondeu a 20 dias, sendo dez dias de tratamento e dez dias de
intervalo. Mesmo após a última série, o paciente só recebeu alta depois da conclusão
do período de observação (dez dias de intervalo). O tratamento variou, portanto de 60
4.1.5 Grupo de indivíduos controle
Este grupo era composto de pessoas não portadoras de leishmaniose, identificadas por reações
sorológicas negativas (RIFI, e ELISA). Destes indivíduos, foi coletado apenas sangue
periférico para o estudo do fenótipo de suas células mononucleares. Este grupo serviu como
controle para as análises fenotípicas de células mononucleares sangüíneas, que foram
realizadas nos pacientes dos grupos anteriores.
Este grupo foi dividido em subgrupos, de acordo com as características e resultado de exames
de cada pessoa.
4.1.5.1Grupo Controle 1 – (C1)
Composto por dezessete pessoas moradoras na área endêmica, sem história clínica e com
sorologia negativa, para LTA, destas pessoas foram coletadas amostras de sangue, que foram
processadas para citometria de fluxo, com os mesmos marcadores utilizados para os outros
grupos de pacientes.
4.1.5.2 Grupo Controle – C2
Composto por dezenove pessoas, doadoras de sangue do Banco de Sangue da Fundação
Hemominas, em Belo Horizonte, portanto não residente de área endêmica e igualmente
4.1.5.3 Grupo Controle – C3
O grupo foi composto por seis indivíduos, moradores de área endêmica, que apresentaram
lesão não leishmaniótica. Este diagnóstico foi feito após o resultado negativo para LTA em
cinco testes: parasitológico, Montenegro, sorologia (RIFI e ELISA) e PCR.
Não foi observada nenhuma diferença estatística entre a idade dos pacientes dos grupos
tratados quando comparados entre si (Teste Kruskal-Wallis, CONOVER 1980).
4.1.6 Diagnósticos
Os indivíduos com lesões cutâneas típicas foram clinicamente diagnosticados com LTA. O
diagnóstico clínico foi confirmado pelo exame parasitológico positivo e, ouMontenegro (TM)
positivo.
4.1.7 Exame Parasitológico
Foi realizado através da identificação das formas amastigotas do parasita, em biópsias de pele
obtidas das lesões. O exame por aposição foi realizado através da compressão do tecido
sangue com papel de filtro. O material coletado foi fixado em metanol, corado pelo método de
Giemsa e examinado ao microscópio óptico (1000X) para identificação de formas
amastigotas.
4.1.8 Teste Montenegro (TM)
O antígeno de Montenegro foi produzido sob condições estéreis a partir da cultura de
promastigotas do clone I-III-D de L. m. amazonensis, mortas, sonicadas e mantidas em
solução mertiolatada 1/10000 (MAYRINK et al. 1993B). O volume de 0,1 mL do antígeno com 40 µg/mL de nitrogênio (MELO et al., 1977 e MAYRINK et al. 1993A) foi injetado intradermicamente na face interna do antebraço. A positividade foi indicada pela formação de
um nódulo, independentemente do seu diâmetro, observado 48 horas após o teste sem,
contudo, considerarmos área eritematosa.
4.1.9 Reações sorológicas
As reações sorológicas apenas complementam o quadro de exames laboratoriais. Para que o
paciente possa receber o tratamento, além do diagnóstico clínico positivo, o mesmo tem que
4.1.9.1 RIFI
O processamento da RIFI foi realizado de acordo com a técnica descrita por CAMARGO,
1969, com a finalidade de detectarmos anticorpos IgG nos soros dos pacientes aqui
analisados.
A técnica foi realizada descongelando-se, à temperatura ambiente, as lâminas contendo o antígeno. Aos poços das lâminas foram adicionados 5µL de plasma, de maneira a se obter um título final de 1:40, como descrito por Costa (1991). Em seguida, foram adicionadas as
amostras ou testemunhos negativos e positivos. As lâminas foram incubadas em câmara
úmida, em estufa à 37°C por 30 minutos, lavadas com PBS ficando cobertas por 5 minutos e
em seguida, lavadas com água destilada. Posteriormente, adicionou-se a cada poço das
lâminas o conjugado total anti-Ig G humano (conjugado na diluição 1:60 + azul de Evans na
diluição 1:50, a partir de uma solução estoque de 1% + PBS Tween) sendo, a seguir,
incubadas por 30 minutos em estufa à 37°C. As lâminas foram lavadas e cobertas com PBS
por 5 minutos; lavadas novamente com água destilada e secas à temperatura ambiente. Por
último, foram colocadas sobre as lâminas, glicerina tamponada e lamínula. A leitura das
lâminas foi realizada ao microscópio de imunofluorescência. Pacientes com títulos de IgG
iguais ou superiores a 1:40 foram considerados positivos. Os resultados foram expressos em
títulos de anticorpos, obtidos por diluição seriada do plasma, utilizando-se fator de diluição
dois, até a obtenção do resultado negativo ou ponto de titulação segundo Genaro et al.( 1993).
Como conjugado para a RIFI, foi utilizada uma anti-imunoglobulina humana, fração IgG,
coelho.
4.1.10 Teste Imunoenzimático (ELISA)
Foi realizada a padronização do teste de ELISA com os antígenos lisados de promastigotas de
L. amazonensis para verificar qual a concentração do antígeno, titulação do conjugado e do
plasma, que melhor discriminassem as amostras dos pacientes positivos e negativos para
LTA, de acordo com a técnica descrita por Rajasekariah et al. (2001).
Os antígenos lisados foram testados nas concentrações de 8,0, 4,0, 2,0 e 0,5 µg por orifício da placa. O conjugado Ig G foi utilizado nas diluições de 1:2000, 1:8000 e 1:16000.
Foram determinados os pontos de corte discriminantes (X + 2 desvios-padrão) para antígenos
brutos de L. amazonensis, em 60 amostras de plasma. Nesta etapa, foram utilizados antígenos,
soros e conjugados nas diluições que apresentaram nítida diferença entre os plasmas dos
pacientes.
4.1.11 Critério de Cura
O critério de cura utilizado para todos os pacientes foi o clínico, ou seja, a cicatrização total