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GRUPOS DE INDIVÍDUOS TRATADOS E DE NÃO INFECTADOS

4 POPULAÇÃO ESTUDADA, MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 GRUPOS DE INDIVÍDUOS TRATADOS E DE NÃO INFECTADOS

Os pacientes participantes neste estudo, num total de 81 indivíduos, foram reunidos

aleatoriamente, ambos os gêneros, entre aqueles atendidos no ambulatório Paulo Araújo

Magalhães, no Município de Caratinga (MG), com diagnóstico de LTA. Como grupo

controle, foram avaliados moradores da mesma região, sem história clínica de LTA e com

sorologia negativa para leishmaniose. O critério de inclusão neste estudo foi a positividade

para o teste de Montenegro e, ou parasitológico para Leishmaniose e indicação de tratamento.

Estes indivíduos foram tratados quando apresentaram diagnóstico clínico para LTA,

confirmado por, pelo menos, um diagnóstico laboratorial: teste parasitológico ou teste de

Montenegro. Os indivíduos positivos foram divididos e submetidos a diferentes tratamentos:

Glucantime®, Leishvacin® e Glucantime® associado ao Leishvacin®. Alguns destes

pacientes foram tratados nos anos 1992 e 1993 (denominados de Grupo Antigo), os outros

4.1.1 Grupo de pacientes tratados com Glucantime® (Quimioterapia)

O Glucantime® foi administrado na dose diária de 1mL/5Kg/peso, sem exceder a dose de

10mL/dia, em séries de dez dias. A série foi repetida após o intervalo de dez dias até a cura

clínica. O período de 10 dias de tratamento e 10 dias de intervalo foi considerado como uma

série de tratamento.

4.1.1.1 Pacientes tratados em 2001/2002 (Grupo Recente)

Este grupo constituiu-se de dez pacientes tratados com o antimonial pentavalente (SbV) o

N-metilglucamine (Glucantime® da Rhodia, Santo André, SP) contendo 85 mg do antimonial

por mL, por via intramuscular profunda. O grupo compôs-se de três pacientes do sexo

feminino e sete do masculino, com a média de idade 29 anos; intervalo de 12 a 71 anos; com

lesões localizadas nos membros inferiores. O teste parasitológico para o diagnóstico foi

negativo em oito pacientes e o teste Montenegro foi positivo em nove pacientes. O tempo

médio da evolução da lesão, antes do tratamento, foi de 65 dias, com intervalo de 12 a 90

dias. Lesão única foi observada em seis dos pacientes deste grupo. O número de séries de

Glucantime® aplicadas aos pacientes variou de dois a oito, equivalentes a 40 a 160 dias de

tratamento.

4.1.1.2 Pacientes tratados em 1992/1993 (Grupo Antigo)

Glucantime® via intramuscular, na dose de 1mL/5Kg/peso, sem exceder 10 mL /dia. Sendo

cinco pacientes do sexo feminino e três do masculino. A média de idade foi de 39 anos, com

intervalo de 12 a 42 anos, apresentando lesões localizadas nos membros inferiores, teste

parasitológico para o diagnóstico negativo em três casos. Nestes casos, o diagnóstico foi

realizado pelo teste de Montenegro –TM e exame clínico. O tempo médio da evolução da

lesão, antes do tratamento, foi de 118,5 dias, com intervalo de 38 a 210 dias. Todos

apresentaram lesão única, com exceção de um paciente que apresentou cinco lesões. Neste

grupo de pacientes, o esquema de tratamento foi o mesmo descrito para o grupo dos tratados

com Glucantime®. Os pacientes foram tratados com duas a seis séries, variando de 40 a 120

dias.

4.1.2 Grupo de pacientes tratados em 2001/2002 com Leishvacin® (Imunoterapia Seriada)

Os pacientes deste grupo foram tratados com Leishvacin® aplicado por via subcutânea. Este grupo

incluiu três pacientes do sexo feminino e quatro do masculino, com média de idade de 44 anos e

intervalo de 20 a 65 anos. As lesões foram observadas no abdome, membros superiores e inferiores.

No teste parasitológico para o diagnóstico, o resultado foi negativo em dois casos e para o teste de

Montenegro, positivo em quatro pacientes, o tempo médio da evolução da lesão, antes do

tratamento de 89 dias, com intervalo de 15 a 240 dias. Observou-se lesão única em quatro dos

pacientes estudados.

Dentro deste grupo de sete pacientes, a vacina (concentração nitrogênio total 240 µg/mL) foi administrada por via subcutânea, no quadrante superior externo do antebraço (Oliveira-Lima

informação pessoal ao Prof. Wilson Mayrink), de acordo com o esquema estabelecido por

Mayrink et al. (1991), resumido a seguir:

Primeiro dia 100µL

Segundo dia 200µL

Terceiro dia 300µL

Quarto dia 400µL

Quinto ao décimo dia 500µL

Após o intervalo de 10 dias, a medicação na dose diária de 500µL foi repetida até a cura clínica do paciente.

O número de séries de Leishvacin® para o tratamento dos pacientes deste grupo, variou de 2 a

7, ou ainda de 40 a 140 dias.

O tratamento foi realizado com Leishvacin® preparada pelo Laboratório de Leishmanioses do

Departamento de Parasitologia, ICB – UFMG, utilizando-se promastigotas mortas de

Leishmania L. amazonensis cepa IFLA/BR/67/PH8, seguindo a técnica proposta por Mayrink

et al. (1979) e sob o controle de qualidade da Escola de Farmácia da Universidade Federal de

4.1.3 Grupo de pacientes tratados com a associação de Glucantime® com Leishvacin®

(Imunoquimioterapia)

4.1.3.1 Pacientes tratados em 2001/2002 (Grupo Recente)

Deste grupo, participaram sete pacientes tratados com a vacina contra-LTA via subcutânea,

como já descrito, aplicando-se, simultaneamente, o Glucantime® por via intramuscular, na

dose de 1mL/5Kg/peso como detalhado para o grupo de pacientes tratados com Glucantime®.

O grupo foi composto por um paciente do sexo feminino e seis pacientes do sexo masculino. A

média de idade foi de 27 anos, com intervalo de 16 a 41 anos com lesões localizadas no abdome,

pescoço, cabeça, membros superiores, membros inferiores e do teste parasitológico para

diagnóstico, foi negativo em um caso, enquanto o teste de Montenegro foi positivo em cinco

pacientes. O tempo médio da evolução da lesão, antes do tratamento, foi de 67 dias, com intervalo

de 30 a 90 dias. Com exceção de um dos pacientes, que teve o material após o tratamento coletado

1825 dias após o diagnóstico de cura clínica. Dentre os pacientes deste grupo, quatro apresentavam

lesão única.

O número de séries da associação Leishvacin® e Glucantime® dos pacientes deste grupo

4.1.4 Pacientes tratados em 1992/1993 (grupo antigo)

Este grupo foi representado por sete pacientes tratados com Leishvacin® via subcutânea e,

simultaneamente, com o Glucantime® via intramuscular. Entre eles, cinco pertenciam ao sexo

feminino e dois ao masculino. A média de idade foi de 28 anos, com intervalo entre 13 e 64

anos. Nestes pacientes a lesão era única, localizada nos membros inferiores. Em apenas um

caso a lesão foi dupla. Nestes sete pacientes, o teste parasitológico foi positivo para todos. O

tempo aproximado da evolução das lesões, antes do tratamento, foi em média 75 dias, com

intervalo de 45 a 90 dias. O esquema de tratamento foi o mesmo apresentado para os

pacientes do grupo tratado com a associação de Glucantime® e Leishvacin®.

Os pacientes deste grupo foram tratados diferentemente quanto ao número de séries (três a

oito). Cada série correspondeu a 20 dias, sendo dez dias de tratamento e dez dias de

intervalo. Mesmo após a última série, o paciente só recebeu alta depois da conclusão

do período de observação (dez dias de intervalo). O tratamento variou, portanto de 60

4.1.5 Grupo de indivíduos controle

Este grupo era composto de pessoas não portadoras de leishmaniose, identificadas por reações

sorológicas negativas (RIFI, e ELISA). Destes indivíduos, foi coletado apenas sangue

periférico para o estudo do fenótipo de suas células mononucleares. Este grupo serviu como

controle para as análises fenotípicas de células mononucleares sangüíneas, que foram

realizadas nos pacientes dos grupos anteriores.

Este grupo foi dividido em subgrupos, de acordo com as características e resultado de exames

de cada pessoa.

4.1.5.1Grupo Controle 1 – (C1)

Composto por dezessete pessoas moradoras na área endêmica, sem história clínica e com

sorologia negativa, para LTA, destas pessoas foram coletadas amostras de sangue, que foram

processadas para citometria de fluxo, com os mesmos marcadores utilizados para os outros

grupos de pacientes.

4.1.5.2 Grupo Controle – C2

Composto por dezenove pessoas, doadoras de sangue do Banco de Sangue da Fundação

Hemominas, em Belo Horizonte, portanto não residente de área endêmica e igualmente

4.1.5.3 Grupo Controle – C3

O grupo foi composto por seis indivíduos, moradores de área endêmica, que apresentaram

lesão não leishmaniótica. Este diagnóstico foi feito após o resultado negativo para LTA em

cinco testes: parasitológico, Montenegro, sorologia (RIFI e ELISA) e PCR.

Não foi observada nenhuma diferença estatística entre a idade dos pacientes dos grupos

tratados quando comparados entre si (Teste Kruskal-Wallis, CONOVER 1980).

4.1.6 Diagnósticos

Os indivíduos com lesões cutâneas típicas foram clinicamente diagnosticados com LTA. O

diagnóstico clínico foi confirmado pelo exame parasitológico positivo e, ouMontenegro (TM)

positivo.

4.1.7 Exame Parasitológico

Foi realizado através da identificação das formas amastigotas do parasita, em biópsias de pele

obtidas das lesões. O exame por aposição foi realizado através da compressão do tecido

sangue com papel de filtro. O material coletado foi fixado em metanol, corado pelo método de

Giemsa e examinado ao microscópio óptico (1000X) para identificação de formas

amastigotas.

4.1.8 Teste Montenegro (TM)

O antígeno de Montenegro foi produzido sob condições estéreis a partir da cultura de

promastigotas do clone I-III-D de L. m. amazonensis, mortas, sonicadas e mantidas em

solução mertiolatada 1/10000 (MAYRINK et al. 1993B). O volume de 0,1 mL do antígeno com 40 µg/mL de nitrogênio (MELO et al., 1977 e MAYRINK et al. 1993A) foi injetado intradermicamente na face interna do antebraço. A positividade foi indicada pela formação de

um nódulo, independentemente do seu diâmetro, observado 48 horas após o teste sem,

contudo, considerarmos área eritematosa.

4.1.9 Reações sorológicas

As reações sorológicas apenas complementam o quadro de exames laboratoriais. Para que o

paciente possa receber o tratamento, além do diagnóstico clínico positivo, o mesmo tem que

4.1.9.1 RIFI

O processamento da RIFI foi realizado de acordo com a técnica descrita por CAMARGO,

1969, com a finalidade de detectarmos anticorpos IgG nos soros dos pacientes aqui

analisados.

A técnica foi realizada descongelando-se, à temperatura ambiente, as lâminas contendo o antígeno. Aos poços das lâminas foram adicionados 5µL de plasma, de maneira a se obter um título final de 1:40, como descrito por Costa (1991). Em seguida, foram adicionadas as

amostras ou testemunhos negativos e positivos. As lâminas foram incubadas em câmara

úmida, em estufa à 37°C por 30 minutos, lavadas com PBS ficando cobertas por 5 minutos e

em seguida, lavadas com água destilada. Posteriormente, adicionou-se a cada poço das

lâminas o conjugado total anti-Ig G humano (conjugado na diluição 1:60 + azul de Evans na

diluição 1:50, a partir de uma solução estoque de 1% + PBS Tween) sendo, a seguir,

incubadas por 30 minutos em estufa à 37°C. As lâminas foram lavadas e cobertas com PBS

por 5 minutos; lavadas novamente com água destilada e secas à temperatura ambiente. Por

último, foram colocadas sobre as lâminas, glicerina tamponada e lamínula. A leitura das

lâminas foi realizada ao microscópio de imunofluorescência. Pacientes com títulos de IgG

iguais ou superiores a 1:40 foram considerados positivos. Os resultados foram expressos em

títulos de anticorpos, obtidos por diluição seriada do plasma, utilizando-se fator de diluição

dois, até a obtenção do resultado negativo ou ponto de titulação segundo Genaro et al.( 1993).

Como conjugado para a RIFI, foi utilizada uma anti-imunoglobulina humana, fração IgG,

coelho.

4.1.10 Teste Imunoenzimático (ELISA)

Foi realizada a padronização do teste de ELISA com os antígenos lisados de promastigotas de

L. amazonensis para verificar qual a concentração do antígeno, titulação do conjugado e do

plasma, que melhor discriminassem as amostras dos pacientes positivos e negativos para

LTA, de acordo com a técnica descrita por Rajasekariah et al. (2001).

Os antígenos lisados foram testados nas concentrações de 8,0, 4,0, 2,0 e 0,5 µg por orifício da placa. O conjugado Ig G foi utilizado nas diluições de 1:2000, 1:8000 e 1:16000.

Foram determinados os pontos de corte discriminantes (X + 2 desvios-padrão) para antígenos

brutos de L. amazonensis, em 60 amostras de plasma. Nesta etapa, foram utilizados antígenos,

soros e conjugados nas diluições que apresentaram nítida diferença entre os plasmas dos

pacientes.

4.1.11 Critério de Cura

O critério de cura utilizado para todos os pacientes foi o clínico, ou seja, a cicatrização total

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