ANÁLISE
DE
MARCADORES
FENOTÍPICOS
DAS
POPULAÇÕES
CELULARES
NO
EXSUDATO
INFLAMATÓRIO
DA
LESÃO
E
NO
SANGUE
PERIFÉRICO
DE
PACIENTES
PORTADORES
DE
LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR
AMERICANA
(LTA)
ANTES
E
APÓS
DIFERENTES
TRATAMENTOS
Ana Cristina de Carvalho Botelho
Belo Horizonte
ANÁLISE
DE
MARCADORES
FENOTÍPICOS
DAS
POPULAÇÕES
CELULARES
NO
EXSUDATO
INFLAMATÓRIO
DA
LESÃO
E
NO
SANGUE
PERIFÉRICO
DE
PACIENTES
PORTADORES
DE
LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR
AMERICANA
(LTA)
ANTES
E
APÓS
DIFERENTES
TRATAMENTOS
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientadores: Wilson Mayrink
Rodrigo Correa-Oliveira
Belo Horizonte
INSTITUIÇÕES ENVOLVIDAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS – UFMG
CENTRO DE PESQUISAS RENÊ RACHOU - CPqRR
LABORATÓRIO PAULO ARAUJO DE MAGALHÃES
Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG – COEP em 05 de
abril de 2001, sob o parecer número ETIC 037/01.
Aos
Mestres Wilson Mayrink, Rodrigo Correa-Oliveira, Maria José Morato e Mauricio Souza Filho;
“De tudo, ficaram três coisas.
A certeza de que estamos sempre começando... A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar... Portanto, devemos
Fazer da interrupção um caminho novo... Da queda um passo de dança...
Do medo, uma escada... Do sonho, uma ponte... Da procura, um encontro..."
Para a realização deste trabalho, contamos com a colaboração de muitos amigos.
A eles nossos agradecimentos.
Aos professores Wilson Mayrink e Rodrigo Correa-Oliveira, agradeço a oportunidade de realizar este trabalho e o incentivo na busca de novas oportunidades;
Ao prof. Giovanni Gazzinelli, pela disponibilidade, colaboração e sugestões;
A Roberto Vieira de Souza, pelo companheirismo, incentivo, convivência e aprendizado;
Á Iramaya Rodrigues Caldas, pela grande amizade;
A Álvaro Romanha, pelas lições e paciência;
Ao prof. Washington Luiz Tafuri, pelas lições acadêmicas e de vida e Wagner Tafuri, pela atenção e disponibilidade;
Ao prof. George Lins, pela atenção;
Às professoras Marilene Michalick e Maria Norma, pelo carinho e pela amizade;
À profa. Débora Dávila Reis, pela prestimosa colaboração;
A Olindo Martins, pela atenção e ajuda na citometria;
quem dividi momentos deste trabalho, por toda amizade e estímulo;
À minha mãe, Mathilde e minhas tias Rosa, Odete e Nahia, pelo grande apoio;
À minha irmã Kátia, aos meus irmãos e minha família pelo incentivo e convivência;
Ao meu pai Walter Carvalho pelo apoio e compreensão;
À Clari Gandra e Maria Beatriz (Tiza), por toda amizade, profissionalismo e preciosa ajuda;
À Sumara, pela cooperação, amizade e profissionalismo;
A Marcos Marques, pela amizade;
Aos Professores do Departamento de Parasitologia, pela colaboração;
Aos professores do Departamento de Patologia Geral, pela colaboração;
Ao professor Giovanni Cassali, pela colaboração na imunoistoquímica;
Ao Alexandre Barcelos, pela colaboração nas análises morfométricas;
Ao Dr. Roberto Sena, pela possibilidade e oportunidade de realizar este trabalho;
Ao Centro de Pesquisas René Rachou, que possibilitou a realização deste trabalho;
Aos amigos do laboratório de Imunologia Celular e Molecular do Centro de Pesquisas
René Rachou, pelo inestimável apoio;
Ao Edmar Martins, Adhemar e Matheus, pela atenção e suporte técnico na informática;
inúmeras nas viagens à Caratinga;
À Ana Pacheco, pela ajuda e amizade;
À Eliane Leo Moreira, pelo Carinho;
À Anna Carolina Lustosa e ao prof. Ivan Sampaio pela colaboração na análise dos dados estatísticos;
A Jefrey Bethony, pela atenção;
Ao amigo, Roberto Teodoro, pela atenção;
Aos amigos Solange, Vanessa, Andrea, Juliana, Ana Carolina, Vladimir, Glenda, Diana
Taboada, Lorena, Isabela Ribeiro, Isabela Gusmão, Lisiane Gomes, Fernanda, Simone, Fabrício, Ceyla, Ramon, Haroldo, Elaine, Denise Rejane, Denise Lemos, Ariane, Alex, Wesley, Jaqueline, Luciana e Antônio, pelos grandes momentos;
Ao Dr. Alfredo, pelo atendimento aos pacientes;
Às Professoras Dilma Martins e Débora... , pelas correções gramaticais e normalização;
Em especial ao Sr. Jair Cecílio de Paula, pela amizade e colaboração, pelo carinho, pelas lições e pela consideração;
Aos pacientes, objeto e objetivo deste trabalho;
E a todos aqueles que, por ventura, não tenha mencionado, pois não são, contudo, menos importantes, nosso sincero agradecimento.
RESUMO
As leishmanioses são doenças causadas por várias espécies de protozoários digenéticos do
gênero Leishmania, que acometem o Homem e diferentes espécies animais silvestres e
domésticos. A transmissão da doença para o Homem ocorre pela picada das fêmeas dos
insetos vetores - gênero Lutzomyia - que, ao picar o hospedeiro vertebrado parasitado, suga as
amastigotas. No tubo digestivo do inseto multiplicam-se e transformam-se em promastigotas:
forma infectante para o Homem. No Brasil, as leishmanioses polarizam-se em dois grandes
grupos: a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e a Leishmaniose Visceral Americana
(LVA) ou Calazar Americano. Nos últimos 20 anos, a incidência de LTA no Brasil tem
aumentado, em praticamente todos os Estados. Surtos epidêmicos têm ocorrido nas regiões
Sudeste, Centro-Oeste, Nordeste, sendo um problema de saúde pública. Entre 1981 e l991, em
Minas Gerais foram notificados, pela Secretaria de Estado de Saúde e pela Fundação Nacional
de Saúde, 8.303 casos de LTA. Muitos destes casos ocorreram na população rural do Norte,
Nordeste e Sudeste do Estado.O Município de Caratinga, localizado no Vale do Rio Doce, é
área endêmica para a LTA.
Atualmente, o tratamento de primeira escolha constitui-se dos antimoniais pentavalentes e no
Brasil, o Glucantime® (antimoniato de N-metilglucamina) é o fármaco disponível. Por ainda
não ser considerado satisfatório, inúmeros estudos vêm sendo realizados em busca do melhor
fármaco e do melhor esquema terapêutico, pois mesmo para o Glucantime® vários são os
esquemas propostos. A imunoterapia é uma alternativa promissora para o tratamento das
leishmanioses e vem sendo utilizada, juntamente com o Glucantime®, no tratamento da LTA
interações entre linfócitos e macrófagos, daí a grande importância de se conhecer melhor estas
interações. Por imunoistoquímica, caracterizamos o fenótipo das populações celulares do
infiltrado inflamatório e, por citometria de fluxo, o das populações celulares no sangue
periférico, antes e depois de diferentes esquemas terapêuticos (Glucantime®, Leishvacin® e
Glucantime® associado ao Leishvacin®). Após análises dos nossos resultados, observamos
diferenças estatisticamente significativas no percentual das populações celulares CD3+,
CD57+, CD16+, CD14+ e CD68+ depois do tratamento. Para confirmação da cura clínica e
parasitológica, realizamos a PCR do material da lesão e encontramos positividade em 69%
dos 39 pacientes avaliados antes do tratamento e em 23% deles após o tratamento.
No sangue periférico não observamos diferenças estatisticamente significativas no percentual
das populações celulares CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+, CD56+ e razões CD4/CD8,
CD3/CD19 depois de cada tratamento.
Ao verificarmos se o sangue refletia o observado na lesão, constatamos diferenças
estatisticamente significativas na análise comparativa do percentual das populações celulares
CD4+, CD8+, Linfócitos B e razão CD4/CD8 no sangue periférico e na lesão, antes e depois
do tratamento. Sendo assim, em nosso estudo, o percentual de células do sangue periférico
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 16
1.1 LEISHMANIA E LEISHMANOSES... 16
1.2 DIAGNÓSTICO... 21
1.3 TRATAMENTO... 23
1.4 HISTOPATOLOGIA E CRITÉRIO DE CURA... 29
2 JUSTIFICATIVA ... 43
3 OBJETIVO ... 47
3.1 OBJETIVO GERAL... 47
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 47
4 POPULAÇÃO ESTUDADA, MATERIAIS E MÉTODOS... 49
4.1 GRUPOS DE INDIVÍDUOS TRATADOS E DE NÃO INFECTADOS... 49
4.1.1 GRUPO DE PACIENTES TRATADOS COM GLUCANTIME® (QUIMIOTERAPIA)... 50
4.1.1.1 Pacientes tratados em 2001/2002 (Grupo Recente)... 50
4.1.1.2 Pacientes tratados em 1992/1993 (Grupo Antigo) ... 50
4.1.2 Grupo de pacientes tratados em 2001/2002 com Leishvacin® (Imunoterapia Seriada)... 51
4.1.3 GRUPO DE PACIENTES TRATADOS COM A ASSOCIAÇÃO DE GLUCANTIME® COM LEISHVACIN® (IMUNOQUIMIOTERAPIA)... 53
4.1.3.1 Pacientes tratados em 2001/2002 (Grupo Recente)... 53
4.1.4 Pacientes tratados em 1992/1993 (grupo antigo) ... 54
4.1.5 Grupo de indivíduos controle ... 55
4.1.5.1Grupo Controle 1 – (C1) ... 55 4.1.5.2 Grupo Controle – C2... 55 4.1.5.3 Grupo Controle – C3... 56 4.1.6 Diagnósticos ... 56 4.1.7 Exame Parasitológico... 56 4.1.8 Teste Montenegro (TM) ... 57 4.1.9 Reações sorológicas ... 57
4.1.10 Teste Imunoenzimático (ELISA)... 59
4.1.11 Critério de Cura ... 59
4.2 MATERIAIS E MÉTODOS... 60
4.2.1 Determinação Fenotípica por Citometria de Fluxo em Sangue Total ... 60
4.2.1.1Ensaio de Imunofluorescência. ... 60
4.2.1.2 Aquisição e análise dos dados no citômetro de fluxo... 61
4.2.2 Obtenção de sangue e fragmento de pele ... 63
4.2.3 Imunoistoquímica em tecidos congelados... 63
4.2.3.1Metodologia para contagem das células... 65
4.2.4 Morfometria... 65
5 RESULTADOS ... 69
5.1 RESULTADOS DOS TESTES DIAGNÓSTICOS EM INDIVÍDUOS SUBMETIDOS A DIFERENTES TRATAMENTOS. ... 69
5.2 ANÁLISE DOS TESTES DIAGNÓSTICOS QUE CARACTERIZARAM A POPULAÇÃO E ESTÃO APRESENTADOS NOS QUADROS 3 A 8 ... 77
5.3 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS PRESENTES NO INFILTRADO INFLAMATÓRIO DE PACIENTES PORTADORES DE LTA, ANTES E DEPOIS DOS TRATAMENTOS E COM DIAGNÓSTICO DE CURA CLÍNICA. ... 79
5.3.1 Análise comparativa do fenótipo das células MN do infiltrado inflamatório de LTA antes e depois do tratamento... 80
5.4 ANÁLISE DO PERFIL FENOTÍPICO DE CÉLULAS SANGÜÍNEAS, LINFÓCITOS T E B EM INDIVÍDUOS NÃO PORTADORES DE LTA ... 94
5.4 ANÁLISE DO PERFIL FENOTÍPICO DE CÉLULAS SANGÜÍNEAS, LINFÓCITOS T E B EM INDIVÍDUOS NÃO PORTADORES DE LTA ... 95
5.4.1 Análise de linfócitos T e B ... 95
5.4.2 Análise de células “Natural Killer” (NK)... 102
5.5 ANÁLISE DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO ANTES E APÓS DO TRATAMENTO COM GLUCANTIME® ... 103
6 DISCUSSÃO ... 132
6.1 ANÁLISE DOS EXAMES DIAGNÓSTICOS COMPLEMENTARES... 133 6.2 CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL FENOTÍPICO DE CÉLULAS DO INFILTRADO INFLAMATÓRIO
6.3 ESCOLHA DO GRUPO CONTROLE... 139
6.4 COMPARAÇÃO DO PERFIL FENOTÍPICO DE CÉLULAS SANGÜÍNEAS ANTES E APÓS CADA TRATAMENTO... 140
7 RESUMO DE RESULTADOS ... 143
8 CONCLUSÕES... 144
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Leishmania e Leishmanioses
As leishmanioses são doenças causadas por várias espécies de protozoários digenéticos do
gênero Leishmania, que acometem o Homem e diferentes espécies animais, silvestres e
domésticos.
O gênero Leishmania, criado por Ross (1903), compreende protozoários parasitos
obrigatórios com um ciclo de vida digenético (heteroxênico), vivendo alternativamente em
hospedeiros vertebrados e insetos vetores. Estes últimos são responsáveis pela transmissão
dos parasitos de um mamífero a outro e pertencem ao gênero Lutzomyia (Díptera,
Psychodidae, Phlebotominae) Os hospedeiros vertebrados são mamíferos de diversos gêneros
(Proechimys, Dusicyon, Didelphis e Saguinus ) incluindo o Homem.
Segundo Shaw (1987), as espécies de Leishmania encontradas nos mamíferos pertencem a
dois sub-gêneros: Leishmania e Viannia.
A transmissão da doença para o Homem ocorre pela picada das fêmeas dos insetos vetores.
Ao picar o hospedeiro vertebrado parasitado, o inseto ingere sangue e macrófagos parasitados
por amastigotas formas de Leishmania arredondadas ou ovaladas, apresentando núcleo,
cinetoplasto (mitocôndria, com funções especiais, facilmente evidenciada nas colorações
binária se transformam em promastigotas. Estas são alongadas e têm o cinetoplasto situado na
porção anterior de onde emerge o flagelo, geralmente mais longo do que o corpo.
Nas espécies pertencentes ao "complexo braziliensis" (sub-gênero Viannia), as formas
promastigotas migram para as regiões anterior, média e posterior do intestino, colonizando o
inseto. Nas espécies pertencentes ao "complexo mexicana" (sub-gênero Leishmania) as
formas promastigotas multiplicam-se nas regiões média e anterior do intestino. As formas
flageladas paramastigotas estão aderentes pelo flagelo ao trato digestivo dos flebotomíneos e
são encontradas em ambos os sub-gêneros. Elas são ovais ou arredondadas, com o
cinetoplasto margeando o núcleo. Após quatro a cinco dias do repasto infectante, as
promastigotas migram para o aparelho picador-sugador do flebótomo. São conhecidas como
causadoras da LTA no Brasil, as espécies: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania
(Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni e Leishmania (Leishmania) amazonensis.
Segundo Killick (1990), as formas flageladas, adaptadas à infecção do hospedeiro vertebrado,
são as promastigotas metacíclicas, encontradas na probóscida do inseto. Estas formas são de
grande motilidade e não aderem à parede intestinal do inseto. Apresentam o corpo menor do
que o das outras promastigotas e um flagelo de comprimento aproximadamente duas vezes o
do seu corpo.
Durante a alimentação, o inseto inocula no hospedeiro vertebrado as formas flageladas, as
metacíclicas, que são interiorizadas por um processo de fagocitose induzida, logo se
transformando em amastigotas, que são formas intracelulares obrigatórias. Estas se
liberadas em conseqüência da ruptura da célula para serem novamente fagocitadas.
No ensinamento de (HANDMAN, 2000; BOGDAN, 2000; BOGDAN, 1996) a
susceptibilidade ou resistência do hospedeiro vertebrado à infecção está relacionada com a
espécie de Leishmania, com os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro, assim como a
imunidade adquirida por exposições anteriores, o que acarreta diferentes quadros clínicos da
doença. A propósito, o macrófago célula altamente eficaz da imunidade inata torna-se uma
célula hospedeira da Leishmania devido a mecanismos de sobrevivência do parasito, que o
torna hábil para escapar da resposta imune do hospedeiro.
Devemos considerar também, que uma mesma espécie de Leishmania pode eventualmente
determinar no Homem um amplo espectro de manifestações clínicas citando Barral (1991),
que vão desde as formas frustras ou sub-clínicas até lesões disseminadas de pele, nas
mucosas, ou, a forma visceral (MARZOCHI,1992). Seja como for, é importante assinalar que
as formas da leishmaniose no Brasil polarizam-se em dois grandes grupos clínicos: a
Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) ea Leishmaniose Visceral Americana (LVA) ou
Calazar Americano.
A LTA é uma doença polimorfa da pele e das mucosas, com lesões ulceradas, únicas ou
múltiplas (forma cutânea simples), nodulares (forma difusa) ou lesões cutâneo-mucosas
(forma cutâneo-mucosa), que afetam regiões nasofaríngeas concomitantemente ou após uma
infecção cutânea inicial. Esta variação está intimamente ligada ao estado imunológico do
paciente e às espécies de Leishmania. A LTA tem grande importância para a saúde pública,
A Organização Mundial de Saúde estima entre 1 e 2 milhões de novos casos de LTA
anualmente, segundo Who (1999).
Segundo Gontijo (2003) a LTA ocorre nas Américas desde o sul dos Estados Unidos até o
norte da Argentina. É endêmica desde o México, na maior parte da América Central e em
todos os países da América do Sul, exceto no Chile e Uruguai. Nas Américas Central e do
Sul, as formas tegumentares são causadas por espécies de ambos os complexos, Leishmania
mexicana e Leishmania braziliensis.
No Brasil, os primeiros relatos datam de 1855, quando foram encontradas lesões de pele no
Homem, similares às descritas na Ásia Central, conhecidas como botão-do-Oriente. Em 1908,
durante a construção da Estrada de Ferro Noroeste do Brasil, em São Paulo, ocorreram
inúmeros casos, principalmente na cidade de Bauru, ficando a doença conhecida por
úlcera-de-Bauru. Os parasitos mais tarde foram nominados por Gaspar Vianna em 1911, como
Leishmania braziliensis.
A incidência de LTA no Brasil tem aumentado, nos últimos 20 anos, em praticamente todos
os Estados. Surtos epidêmicos têm ocorrido nas regiões Sudeste, Centro-Oeste, Nordeste e,
mais recentemente, na região Amazônica, sendo estes relacionados ao processo predatório de
colonização. Nos últimos anos, o Ministério da Saúde registrou uma média anual de 35 mil
novos casos de LTA no país - Centro Nacional de Epidemiologia (CENEPI), 1999.
Não só no Brasil, mas também em outros países das Américas Central e do Sul, a LTA
constitui problema de Saúde Pública. Sua importância reside não somente na sua alta
que podem determinar lesões destrutivas, desfigurantes e também incapacitantes, com grande
repercussão no campo psicossocial do indivíduo conforme Gontijo (2003).
A forma cutâneo-mucosa (LCM) já foi assinalada em quase todo o hemisfério ocidental,
principalmente no Peru e Brasil. No Brasil, é encontrada em todo o território nacional, sendo
mais prevalente na região Norte. Em algumas localidades, a população exposta ao risco de
infecção é numerosa, incluindo crianças, enquanto que, em outras, a enfermidade está restrita
a grupos ocupacionais, tais como os que trabalham em zonas florestais rurais.
Segundo Genaro (1993) entre 1981 e l991, em Minas Gerais, foram relatados pela Secretaria
de Estado de Saúde e pela Fundação Nacional de Saúde a ocorrência de 8.303 casos de LTA.
Muitos destes casos afetaram a população rural do Norte, Nordeste e Sudeste do Estado.
A transmissão em áreas periurbanas têm sido relatada nos municípios de Belo Horizonte,
Divinópolis, Sabará, Neves, entre outros. Merece menção que a incidência da doença tem
aumentado em alguns municípios de Minas Gerais nos últimos anos.
O mesmo autor ensina que o município de Caratinga, localizado no Vale do Rio Doce, é área
endêmica para a LTA. Como se trata de município de colonização antiga e estabelecido em
áreas não florestais, com o cultivo de café, a manutenção do ciclo de transmissão parece
envolver flebotomíneos com hábitos peridomiciliares, roedores e animais domésticos como
1.2 Diagnóstico
Segundo Kar (1995), diferentes técnicas são utilizadas para o diagnóstico das leishmanioses,
tais como:
• sinais e sintomas clínicos e epidemiológicos;
• detecção do parasito em material de biópsia, diretamente com pesquisa do parasito em esfregaços de pele, corados com Giemsa ou indiretamente por meio de cultura e inoculação
em animais susceptíveis;
• intradermorreação de Montenegro - IRM; • exames histopatológicos;
• imunodiagnóstico, com detecção de anticorpos contra Leishmania ou detecção de antígenos do parasita;
• imunoistoquímica;
• detecção do DNA do parasito pela Reação em Cadeia da Polimerase – PCR.
O diagnóstico de certeza da leishmaniose requer detecção do parasito em sítios de infecção.
Freqüentemente, a associação de alguns desses elementos é necessária para se chegar ao
diagnóstico final.
Para (CAMARGO, 1996; KAGAN, 1974) o teste sorológico, utilizado para substituir a RFC
para diagnóstico das leishmanioses é a reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Este
método apresenta a vantagem da fácil preparação do antígeno e é amplamente utilizada em
levantamentos epidemiológicos para detecção de leishmaniose visceral em cães e
leishmaniose tegumentar em humanos conforme ensinamento de (BRAY, 1976; POZIO et al.
a RIFI apresenta reatividade cruzada com soros de pacientes com outros tripanosomatídeos e
outros protozoários segundo (COSTA et al., 1991; CARDOSO e CABRAL, 1998).
O método de ELISA foi introduzido para diagnóstico da leishmaniose por HOMMEL em
1976. Este método vem sendo utilizado desde então e vários autores têm utilizado diferentes
antígenos, visando a obtenção de maior sensibilidade e especificidade em consonância com os
autores (BADARÓ et al., 1986; REED et al. 1990; CABRERA et al. 1999). Para (TEIXEIRA
et al., 1996; COSTA et al. 1991) antígenos brutos são menos específicos permanecendo o
problema da reação cruzada, principalmente para o antígeno de T. cruzi.
Outra técnica sorológica que tem recebido atenção em ensaios de diagnóstico é o Western
blot. Esta técnica tem se mostrado promissora para o diagnóstico das leishmanioses e tem sido
importante na detecção e no isolamento de antígenos potenciais tanto para o diagnóstico como
também para outros estudos epidemiológicos.
O Western blot, apresenta, também, reações cruzadas quando se utilizam soros de pacientes
com leishmaniose e Doença de Chagas. Esta reatividade, no entanto, é dependente do
antígeno utilizado no ensaio segundo Teixeira et al (1996).
A utilização da biologia molecular em métodos de diagnóstico e controle de doenças
infecciosas têm aumentado significativamente. Informações das seqüências de DNA têm sido
muito exploradas para o desenvolvimento de ensaios baseados na PCR para o diagnóstico de
leishmanioses e para a identificação da espécie dos parasitos. Piarroux et al. em 1993
utilizaram a técnica da PCR para amplificar uma seqüência repetida do genoma de
leishmaniose nos quais a suspeita da infecção era avaliada através de exame físico, foi
comparada com exame direto de aspirados de medula óssea, mielocultura e testes sorológicos.
De 73 pacientes analisados, apenas 10 apresentaram diagnóstico indiscutível de calazar. De
acordo com os autores, nenhum dos testes apresentou 100% de sensibilidade para o
diagnóstico da doença, mas dentre todos eles, a PCR foi o teste mais sensível, apresentando
sensibilidade acima de 82%. Os testes sorológicos foram os de maior sensibilidade e
especificidade para os novos casos da doença porém, eram menos eficientes nos casos de
recidiva, quando comparados com a PCR.
A PCR tem sido considerada erramenta complementar em métodos diagnósticos segundo
(BRECELJ et al., 2000; ANDRADE et al., 2001.) de diferentes enfermidades, e no caso das
leishmanioses, amplamente usada na detecção do DNA do parasito após o tratamento
(SCHUBACH et al. 1998, PIRMEZ et al. 2000).
1.3 Tratamento
Os clínicos ligados a órgãos oficiais de Saúde Pública, no Brasil e no mundo, têm se
preocupado sobremaneira tanto com o tratamento quanto com a prevenção das leishmanioses.
Embora sejam enormes as dificuldades em se compreender os fenômenos biológicos
envolvidos no combate da infecção pelo hospedeiro, vários pesquisadores têm se dedicado a
Até 1912 a quimioterapia era insatisfatória, quando o tratamento sistêmico das leishmanioses
com antimoniais foi introduzido pelo médico brasileiro Gaspar Vianna (VIANA, 1912),
utilizando o tártaro emético a 1%. Nesta mesma época, Row (1912) relatava estudos sobre o
valor curativo das promastigotas de cultura de Leishmanias utilizadas como vacina no
tratamento do botão do Oriente.
Durante anos, o tártaro emético constituiu o único recurso terapêutico para as leishmanioses.
Em face a sua toxidez, dificuldade de aplicação e eficácia insatisfatória (reincidências
freqüentes), acabou sendo substituído por antimonial pentavalente segundo Furtado (1968),
substância menos tóxica e de rápida eliminação renal. Embora contra indicada em casos de
pacientes cardiopias, nefropatias, senilidade e gravidez, representa terapêutica válida,
constituindo, mesmo no ocaso do século XX, a terapêutica padrão para as leishmanioses.
Atualmente, são utilizados dois antimoniais pentavalentes: o Estibogluconato de Sódio (Pentostan® da Wellcome Foundation, London, UK) e o Antimoniato de N-metilglucamina (Glucantime®® do Rhone Poulenc, Paris, France). Segundo Herwaldt e Berman (1992), o primeiro é mais usado em países de língua inglesa. Na orientação do Ministério da Saúde do
Brasil, estes dois medicamentos são de primeira linha na terapêutica de casos humanos de
leishmanioses. No entanto o Glucantime® é o único antimonial pentavalente disponível no
Brasil, onde representa a droga de escolha para o tratamento de casos humanos como ensina
Furtado (1968), conforme cita o Manual de Controle da leishmaniose tegumentar americana
(COSTA et al. 2000).
Pentamidina). Entre os antibióticos, a Anfotericina B e a Rifampicina são os mais
recomendados. A notar que em Furtado (1968), a Anfotericina B constituia a droga mais
efetiva no tratamento da LCM, inclusive em casos resistentes a outros agentes terapêuticos,
embora seja tóxica e requeira hospitalização do paciente durante o tratamento. A Rifampicina
foi testada por JOSHI et al. (1989), para Leishmaniose Cutânea (LC) e, por consideração dos
autores, deve ter lugar de destaque nesta terapêutica. As Pentamidinas, por sua vez, têm
poder curativo inferior ao do Glucantime®, além de sua maior toxicidade.
Por considerar que a quimioterapia para a Leishmaniose está longe de ser satisfatória,
Albanese et al. (1989) trataram a forma cutânea com um agente antifungal, o Itraconazole oral
(Ketoconazole). Os autores julgaram quimioterapia eficaz, além de assinalar ausência de
efeitos colaterais. Saenz et al. (1990), testando a mesma droga contra a Leishmania
braziliensis, equipararam a eficácia desta droga com a do Pentostan® e confirmam os
resultados obtidos por Albanese et al. (1989).
A infiltração do Pentostan® diretamente na lesão já foi testada e considerada método seguro e efetivo de tratamento por SHARQUIE et al. (1988). O uso do Pentostan® em cápsulas de lipossomas no tratamento de animais de laboratório, infectados com Leishmania foi testado por
Alving et al. (1978), tendo mostrado eficácia 200 vezes maior que a do medicamento livre. A eficácia do Pentostan® é também maior, quando a droga é usada em combinação com a crioterapia superficial, como descrito por El Darouti e Al Rubaie (1990).
Desde a introdução dos antimoniais na terapêutica das leishmanioses, inúmeros estudos vêm
sendo realizados para se estabelecer o melhor esquema terapêutico. Ainda hoje, a eficácia
BASSIOUNY et al., 1982; OSTER et al., 1985; DAN et al. , 1986; CONVIT et al. ,1987;
SAENZ et al., 1990; RODRIGUEZ et al., 1990; RZANY et al., 1990; GUDERIAN et al., 1991;
MARTINEZ e MARR, 1992; HERWALDT e BERMAN, 1992; SOTO-MANCIPE et al., 1993;
HEPBURN et al., 1994; OLIVEIRA NETTO et al. ,1997; SALDANHA et al., 1999). Portanto,
apesar da existência de tratamento, a quimioterapia para leishmaniose, não é ainda
satisfatória. Existem, hoje, vários fármacos e esquemas terapêuticos em teste, inclusive
ensaios de vacinação conjugados à terapêutica (FURTADO 1974; ALVING et al. ,1978;
MAYRINK et al., 1991; OSTER et al., 1985; SHARQUIE et al., 1988; ALBANESE et al.,
1989; ELDAROUTI e ALRUBAIE, 1990; SAENZ et al., 1990; MARTINEZ e MARR,
1992; SOTO MANCIPE et al., 1993; GENARO et al., 1996; PINTO, 2001).
As drogas e os esquemas terapêuticos são variáveis e sem concordância, (OSTER et al., 1985;
SOTO-MANCIPE et al., 1993; MARTINEZ e MARR, 1992; HERWALDT e BERMAN,
1992; GUDERIAN et al., 1991; RODRIGUEZ et al., 1990; RZANY et al., 1990; SAENZ
et al., 1989; DAN et al., 1986; BASSIOUNY et al., 1982; FURTADO, 1974; CONVIT et
al., 1987). Um esquema terapêutico que merece menção pelos seus bons resultados é o
desenvolvido pelo Dr. Paulo de Araújo de Magalhães (SUCAM-MG) para o uso do
Glucantime®, onde se usou 17 mg/Sb/Kg (equivalente a 1 mL da solução comercial por 5Kg
de peso), por via intramuscular, em séries de dez dias, com intervalo de dez dias entre cada
série, até a cura clínica do paciente. Dentro do esquema citado, deve-se notar que a dose diária
máxima injetável não deve ser superior a 10 mL, independentemente do peso do paciente e
que o número de séries deve variar de acordo com a resposta ao tratamento. As recaídas nos
casos tratados com o antimônio são raras e não passíveis de previsões, como constataram
Desde a década de 70, métodos imunoterápicos têm sido estudados no Ambulatório Paulo
Araújo de Magalhães, situado o município de Caratinga segundo Mayrink et al. (1991). A
imunoterapia é uma alternativa terapêutica promissora para o tratamento das leishmanioses,
tendo sido introduzida por Row (1912) e logo abandonada, dada a eficácia do tártaro emético,
introduzido por Gaspar Viana na mesma época. Em 1939, Salles-Gomes utilizou um extrato
antigênico de promastigotas obtidas a partir da cultura de fragmentos das lesões dos pacientes
com Leishmaniose, forma cutânea para tratar casos de LTA. O autor obteve resultados
significativos nos casos em que empregou a via endovenosa.
Em estudos de Mayrink em 2002, observamos que a associação do antimônio com a vacina
(imunoquimioterapia) induziu semelhantes índices de cura do tratamento padrão, e com a
vantagem de reduzir a dosagem e o tempo de uso do antimônio trabalho submetido à Vaccine
conseqüentemente reduzindo os efeitos colaterais.
Uma vez que pouco se conhece sobre o mecanismo de ação destes esquemas terapêuticos, nos
propusemos, nesse trabalho, a analisar, antes e após o tratamento, o perfil fenotípico de
células mononucleares da lesão e do sangue de pacientes, na expectativa de se obter
informações sobre a resposta imune induzida nos indivíduos portadores de LTA, tratados por
quimioterapia (Glucantime®), por imunoterapia (Leishvacin®) e imunoquimioterapia
(associação de Glucantime® com Leishvacin®).
No ambulatório de leishmanioses, que funciona há trinta e dois anos no município de
Caratinga, MG, com a assistência técnico-científica do Departamento de Parasitologia do ICB
Relatório Caratinga 1989-1992). Na década de 1980, foram desenvolvidos estudos visando
obter uma conduta alternativa para a terapêutica da LTA, com o objetivo primeiro de
solucionar aqueles casos em que a metodologia clássica era inadequada e, depois, para
oferecer um avanço no tratamento da LTA.
Michalick et al. (1987) apresentaram resultados de imunoterapia, utilizando a vacina descrita
por Mayrink et al. (1979) aplicada por via subcutânea, no tratamento das formas cutânea e
cutâneo-mucosa - 22 casos: 18 forma cutânea e 4 da forma cutâneo-mucosa. Foi observado
77,7% de cura para casos de lesões cutâneas e 75,0% para lesões mucosas. Em outro ensaio
clínico, relatado por Hermeto et al. (1992), o índice de cura atingiu 95%.
Convit et al. (1987), utilizando como antígeno promastigotas mortas de L. m. mexicana,
associadas ao BCG, trataram 52 pacientes portadores da forma cutânea. A taxa de cura obtida
foi de 94,23%. Esta taxa de cura foi semelhante àquela obtida pelos autores que utilizaram a
quimioterapia convencional com Glucantime® em 42 pacientes, 95,24%.
Mayrink et al. (1991), relatam o sucesso terapêutico, com a percentagem de 75,8%, no
tratamento de 62 pacientes portadores da forma cutânea, utilizando como agente
imunoterápico, a vacina desenvolvida por Mayrink et al. (1979) associada ao Glucantime ®.
O uso da quimioterapia associada a imunoterapia tem demonstrado em alguns casos ser
efetiva no tratamento de pacientes com Leishmaniose difusa (MAYRINK et al., 1992;
SILVEIRA e MAYRINK, 1993).
A imunoterapia combinada com BCG, primeiramente realizada por CONVIT e colaboradores
obtidos através do tratamento padrão com Glucantime®.
Entretanto, cabe ter em vista que as drogas in casu estão longe de serem ideais para a
terapêutica da Leishmaniose, já que os resultados obtidos por diversos pesquisadores, são
contraditórios e variações do esquema têm levado a registros de resistência ao uso dos
antimoniais com observações in vitro de diferentes níveis de sensibilidade das amostras de
Leishmania aos antimoniais pentavalentes como observa Grogl ( 1992).
Apesar de vários relatos comentando a eficácia do tratamento, a ausência de resposta aos
compostos antimoniais tem sido reconhecida como um sério problema clínico.
Segundo, ainda, Grogl (1992) acredita-se que fatores ligados ao hospedeiro, a aspectos
imunofisiológicos, ou ainda, ao parasita e a resistência à droga, inerente ou desenvolvida,
possam contribuir, separada ou associadamente, para a ineficácia da terapêutica.
1.4 Critério de cura e histopatologia
O melhor esquema terapêutico, a falta do melhor critério de cura é um ponto ainda bastante
controverso no tratamento da LTA. A completa cicatrização da lesão, do ponto de vista
macroscópico, tem sido critério clínico de cura adotado por vários autores (CONVIT et al.,
1987; RAKCHEEV et al., 1989; MAYRINK et al., 1991; HERWALDT e BERMAN, 1992;
Contudo, o critério clínico pode ser falho. Este caráter falaz do critério de cura foi relatado
por D'ultra e Silva (1915) que, nas observações dos primeiros pacientes com leishmaniose,
tratados pelo tártaro emético, observou que a cicatrização das lesões poderia não ser indício
de cura completa. Este autor considera que enquanto houver exuberância do tecido cicatricial
haverá possibilidade de recidiva. Schubach et al. (1987), reforçam a afirmação de D’ultra e
Silva relatando um caso de leishmaniose, de 1979 em que tendo sido tratado com 75 doses de
antimônio pentavalente, oito anos após a cura, teve na cultura de material colhido na cicatriz,
resultado positivo para Leishmania sp. Os autores concluíram que tal informação pode ser de
grande importância para o entendimento da relação parasito-hospedeiro e do próprio critério
de cura. Neste contexto, o encontro do parasito na mucosa nasal íntegra, em pacientes com
lesão cutânea, tem sugerido um estado de equilíbrio local entre o parasito e o hospedeiro,
(GUERRA et al. 1985).
Guerra et al. (1985) não encontraram parasitos no exame histológico e no de impressão do
material colhido na mucosa nasal de 13 indivíduos da área rural endêmica para LTA, que
apresentavam IRM positiva. Estes indivíduos, no entanto, não apresentavam história de LTA.
O teste de Montenegro (TM) ou intradermorreação de Montenegro (IRM) traduz a resposta de
hipersensibilidade celular tardia e é um importante instrumento diagnóstico de LTA, uma vez
que é comum a escassez de parasitos nas lesões, o que torna difícil o diagnóstico
parasitológico. A IRM positiva em indivíduos procedentes de área endêmica de LTA exige
um diagnóstico diferencial, com relação a outros testes diagnósticos, uma vez que poderia se
tratar de um caso de infecção subclínica (GUERRA et al, 1985). Estes achados têm sido
evocados para sustentar a hipótese de infecções subclínicas, provavelmente devido a um
positividade da IRM segundo Pessoa e Pestana (1941).
A ruptura de tal equilíbrio condicionaria o aparecimento das lesões. Segundo estes autores a
IRM positiva em indivíduos sem lesões e/ou cicatrizes compatíveis com Leishmaniose é
atribuído às formas abortivas da Leishmaniose que não deixam vestígios na pele, mas são
suficientes para tornar os pacientes imunes.
Marsden et al. (1986) relataram um caso da forma mucosa da Leishmaniose causada pela
Leishmania braziliensis braziliensis, após tratamento pelo Pentostan® (durante 85 dias com
dose diária de 20mg/Sb). Trinta e um meses depois do tratamento, ao exame clínico do nariz e
da boca evidenciou-se sinais de reincidência. A inoculação em hamster, de macerado do
fragmento da mucosa obtido deste indivíduo resultou no isolamento do parasito. Os autores
concluem, que alguns pacientes não chegam à cura parasitológica, apesar da terapêutica haver
sugerido a cura clínica. Outro estudo realizado pelo mesmo grupo Marsden et al. (1977)
confirmou o isolamento de amastigotas na mucosa nasal, aparentemente normal, de pacientes
portadores de leishmaniose cutânea. Outro relato, ainda, foi apresentado por Schubach (1990),
que isolou Leishmanias de material colhido em cicatriz de pacientes, após oito anos de cura
clínica. Baseado no exposto, constata-se que após longo tempo da cura clínica, pode haver
reativação da lesão e que, em outros casos, mesmo com a constatação de cura clínica, ainda
evidencia-se a presença do parasito (PESSOA e BARRETO, 1948; NADIM, 1984; e NETTO
et al., 1986).
Um dos poucos estudos realizados com o objetivo de determinar o provável mecanismo de
permanência do parasito é o de Bogdan et al. (2000), que mostram que a persistência do
autores mostram que, em 40% dos casos, a persistência do parasito estava associada com
Leishmanias em fibroblastos de camundongos.
O critério de cura, adotado por Sampaio et al. (1988) em casos da forma mucosa tratados com
Pentamidina, foi a cicatrização das lesões com ausência de amastigotas, verificada por meio
de biópsia após o tratamento. Na avaliação da ação do Allopurinol no tratamento da LTA,
Martinez et al. (1992) aceitaram como critério de cura a completa cicatrização da lesão; o
desaparecimento dos sinais da inflamação e a cultura negativa de material obtido da cicatriz
três meses após o tratamento. O critério de cura definitiva, segundo esses autores, constitui-se
pelo acompanhamento do paciente por um ano, sem a ocorrência de reativação. No entanto,
estes são procedimentos complexos e laboriosos para aplicação em estudos de grandes
populações, onde apenas critérios clínicos e sorológicos são passíveis de aplicação prática no
controle de cura da LTA segundo Llanos et al. (1982).
O estudo histopatológico da leishmaniose tegumentar surgiu com a identificação da doença no
Brasil. Vários autores (AZULAY et al., 1960; MAGALHÃES et al., 1980; AZOUGUE et al.,
1983; MAGALHÃES et al., 1993), desde então, vêem contribuindo significativamente para o
esclarecimento do perfil histopatológico das lesões, estabelecendo padrões morfológicos da
doença.
O quadro histopatológico varia desde um infiltrado inflamatório de células mononucleares e
neutrófilos até reações granulomatosas com ou sem necrose segundo Bittencourt e Barral
(1991).
tegumentares como essencialmente o mesmo nas suas diversas variedades observadas em
diferentes partes do mundo. Para Azogue (1983), aquele aspecto não se modifica no curso
evolutivo da lesão. Não obstante, Magalhães et al. (1980), em seus estudos de LTA nas
regiões Amazônica e Centro-Oeste, demonstraram diferenças clínicas e histopatológicas
distintas, numa e noutra região. No entanto, a histopatologia avaliada durante o processo de
cura na LTA está ainda pouco estudada, e que biópsias de lesões curadas mostraram-se ainda
com abundante infiltrado celular, embora sem parasitos segundo Magalhães et al. (1993).
Em estudos anteriores, Botelho et al. (1998) avaliaram histopatologicamente lesões de casos
humanos de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), antes e após o tratamento, com
diferentes métodos terapêuticos. Neste estudo, foi avaliado o padrão histopatológico da
cicatriz, 30 dias após as seguintes modalidades terapêuticas: Leishvacin® + Glucantime®;
Leishvacin® + BCG e, 15 dias depois da aplicação do Glucantime®; Leishvacin® + BCG e
Glucantime® de pacientes da região do município de Caratinga – M.G com diagnóstico
comprovado para LTA (esfregaços por aposição e, ou Teste Montenegro). Destes pacientes
foram colhidos fragmentos das lesões, através de biópsias, antes, durante e 30 dias após o
encerramento do tratamento com diagnóstico clínico de cura. Após análise das biópsias antes
e depois do tratamento, foi criada uma "classificação" com doze momentos da inflamação,
nomeados de acordo com a predominância e significância dos fenômenos alterativos,
exsudativos e produtivos-reparativos. Com esta “classificação”, mostrou-se com maior
clareza, o momento inicial e final da lesão, descrevendo-se, assim, o quadro histopatológico
da lesão antes do tratamento e após, quando o clínico considerou o paciente curado. A
“classificação” adotada no trabalho em questão teve por finalidade, exclusivamente, verificar
a evolução de cura das lesões, a partir dos primeiros momentos do tratamento até a cura
Demonstrou-se, com este estudo sistemático, que a avaliação histopatológica da cicatriz é de
grande importância para a análise da cura pois, após a análise dos fragmentos de lesões,
observou-se que o quadro histopatológico apresentado antes (AT) e depois do tratamento
(DT) nem sempre correlacionava-se com a cura anátomo-clínica. Ou seja, em alguns casos,
mesmo após o tratamento e com o paciente considerado clinicamente curado, as lesões
dérmicas continuam em atividade com a persistência do processo inflamatório, apesar da
epitelização da cicatrização.
Portanto, nem sempre o critério de cura histopatológica e clínica coincidem, uma vez que o
clínico pode considerar cura, uma cicatrização da úlcera. Todavia, nesta mesma cicatriz o
patologista por vezes observa fenômenos exsudativos. O mesmo, conforme já referido, pode
ser observado pelo parasitologista, pois mesmo na cicatriz, já se encontrou parasitos após
análise em cultura (BOTELHO et al. 1998).
Os autores acreditam que, o critério de cura ideal, deve considerar os conceitos de cura
clínica, histopatológica e parasitológica em conjunto.
1.5 RESPOSTA IMUNE
A infecção experimental de camundongos com promastigotas de Leishmania major talvez
seja o melhor modelo estudado da infecção. Algumas cepas de camundongos (C57BL6, C3H,
auto-limitante e a cura foi determinada pela resolução da infecção mediada por células do tipo Th1, predominando a produção de IFNγ. Em contraste, uma outra cepa de camundongo, BALB/c, quando infectados por L. major, desenvolve uma resposta do tipo Th2, com progressão da
infecção, e a principal citocina produzida é a IL-4. A IL-4 é produzida pelos linfócitos T
CD4+, sendo responsável pela susceptibilidade ao parasito e progressão da doença. segundo
Rogers et al. (2002).
Estudos clínicos e experimentais mostram que a resposta imune celular específica é necessária
para a cura e proteção contra a doença e que fatores ligados ao vetor, ao parasito e ao
hospedeiro, definem, em conjunto, a evolução da infecção e as dificuldades em se controlar o
avanço da doença (SACKS e PERKINS 1984 e 1985; DA SILVA e SACKS ,1987; LIEWS e
O’DONNEL, 1992).
Estudos in vitro e in vivo demostraram que as citocinas presentes no início do processo de
resposta imune são determinantes na diferenciação das células precursoras Th0 em Th1 ou
Th2 (O’GARRA e MURPHY, 1994).
O avanço do conhecimento das diferentes formas de leishmaniose foi possível através do uso
de cepas isogênicas, de camundongos susceptíveis ou resistentes a várias espécies de
Leishmania. Sabe-se, hoje, que quando um camundongo é infectado por alguma espécie de Leishmania, basicamente, duas situações distintas podem acontecer, dependendo da
constituição genética do animal. No animal geneticamente resistente, ocorre a indução preferencial de uma subpopulação de linfócitos T CD4+, que produzem interferon-γ (INF-γ) e interleucina-2 (IL-2). Esta população, denominada Th1, ou do tipo 1, é capaz de ativar os
macrófagos pela síntese de INFγ, levando os mesmos a destruírem os parasitos através de um aumento da produção de radicais de oxigênio, principalmente do óxido nítrico. Além disso, o INF-γ induz os macrófagos a produzirem IL-12, que por sua vez, atua sobre os linfócitos e sobre células “Natural Killer” (NK) aumentando a produção de INF-γ num mecanismo de ampliação da resposta (MOSSMANN e COFFMAN, 1989). Ghalib et al. em 1995,
observaram que a IL-12 interage com as células T e NK e tem um papel central no estímulo e manutenção da resposta Th1 através da produção do INF-γ. A estimulação das células NK é responsável pelo início da diferenciação de células Th1 na leishmaniose e no controle da
resistência inicial a infecção por L. major (SCHARTON-KERTSEN e SCOTT, 1993). Tem
sido demonstrado, também, que células T CD8+ desempenham papel importante na redução
da proliferação de L. major em camundongos infectados segundo os autores (MILLON et al.
1986; MILLON e LOUIS 1993).
Nos animais geneticamente susceptíveis, predominam as células da sub-população Th2, cujos
linfócitos produzem, preferencialmente, IL-4 e IL-10, inibindo assim, a ativação dos
macrófagos.
Kane et al. (2001) mostraram que a IL10, produzida por macrófagos infectados, diminui a produção de IL-12 e TNFα, confirmando, in vitro, que este tipo de resposta favorece o parasito e permite a sua sobrevivência dentro dos macrófagos.
Existem, todavia, resultados controversos sobre o papel das citocinas na evolução das leishmanioses. Diversos estudos, in vitro e in vivo, mostraram que o INF-γ, produzido por células Th1, apresenta função efetora contra Leishmania de acordo com os autores
doses de INF-γ a camundongos susceptíveis BALB/c, após infecção experimental com L.
major e não observaram quaisquer modificações na evolução da doença nestes animais.
Estudos de (COUTINHO et al. 1984; CARVALHO et al., 1985; MENDONÇA et al., 1986;
CONCEIÇÃO-SILVA et al., 1990 e PIRMEZ et al., 1990), mostraram que a imunidade
celular desempenha um papel importante na cura das leishmanioses tegumentares. Esses
estudos nos permitem compreender melhor os mecanismos de imunorregulação nas
leishmanioses, a partir de infecções experimentais. Vários estudos sugerem que a imunidade
mediada pelos linfócitos T pode ser responsável pela resolução da lesão, por ativação de
macrófagos com morte dos parasitos ou pelo agravamento das lesões com a inibição da
função dos macrófagos (BERTHO et al., 2000).
A cura estaria relacionada com o perfil Th1 e a susceptibilidade à doença ao desenvolvimento
de resposta do tipo Th2. Tal dicotomia existente entre a resposta imune protetora ou não,
provavelmente, se encontra sob a influência dos padrões de citocinas produzidas pelas
diferentes subpopulações de linfócitos, sobretudo, durante a fase inicial da doença segundo
Mendonça et al. (1995). Sub-populações de células T CD4+, são também, encontradas em
humanos. No Homem, ocorre a combinação das respostas tipo 1 e 2 (Th1 e Th2), com
predomínio de um dos tipos, dependendo da manifestação da Leishmaniose (tegumentar,
cutânea ou difusa) (ROMAGNANI, 1991).
Para Esterre et al., (1992) a interação do parasito com o sistema imune do hospedeiro é
complexa. O mecanismo da resposta imune celular, envolvendo interações entre linfócitos T e
macrófagos, é considerado de grande importância na imunorregulação da Leishmaniose
As técnicas de imunoistoquímica, usando anticorpos monoclonais, nos permitem investigar,
diretamente na lesão, as células presentes no infiltrado inflamatório e associá-las às
observações clínicas e histopatológicas.
Alguns autores como Kenner et al (1999) utilizaram a imunoistoquímica (IHC) para
identificar Leishmanias em tecidos fixados, já que o diagnóstico definitivo se faz com a
observação do parasito. Estes autores consideraram a IHC, utilizando o anticorpo monoclonal
anti-Leishmania – G2D10 - para identificação do parasito, melhor, quando comparada com o
método convencional de hematoxilina-eosina (HE). Isto, porque os parasitos podem ser
identificados mais facilmente e em menor aumento (X20-40) na imunoistoquímica (IHC), do
que no HE, que necessita do uso da objetiva com óleo de imersão, além de muita experiência
por parte do patologista.
A IHC e histopatologia lesões de pacientes com Leishmaniose Cutânea Localizada (LCL),
causada por Leishmania panamensis na Colômbia, foram utilizadas para análise de biópsias
de pele congeladas em nitrogênio líquido. Os autores caracterizaram fenotipicamente as
células do infiltrado inflamatório e concluíram que as células, nas lesões destes pacientes,
possuíam marcadores de ativação apropriados para uma resposta imune, além de sinais
acessórios para a célula imunocompetente efetuar uma resposta com eliminação dos parasitos
(ISAZA et al., 1996). Na caracterização das células do infiltrado inflamatório de lesão de
LTA, por imunoistoquímica descrita por Lima et al. (1994), os autores encontram 37 % de
células T e 2,3% de células B. Já Vieira e et al. (2002) registramque as células T são mais
freqüentes (34,8%) que macrófagos CD68+ (21,6%) do que células B CD20+ (10,3%).
ISAZA et al. em 1996 relatam a presença de 31% de células T CD8+ e 23% de células T
Na análise do infiltrado inflamatório, antes do tratamento Gaafar e colaboradores (1999)
encontram um número maior de células T CD8+ nas lesões analisadas, antes do tratamento,
quando comparada à lesão durante a cura. Coutinho et al. (2002) citam uma proporção similar
em termos de células T CD4+ e de células T CD8+ no infiltrado inflamatório sendo que, após
o tratamento, ocorre um aumento de células CD8+ e uma redução das células CD4+.
O estudo do infiltrado inflamatório em lesões de leishmaniose, feito por Amaral e
colaboradores (2000) em macacos, revela um percentual de 17,5% de células T CD4+ e 30%
de CD8 antes do tratamento contra 18,7% de CD4 e 23% de CD8 após a cura.
Castes e colaboradores (1983), após caracterizarem a resposta celular imune na LCL
consideraram necessário estudar, em maior detalhe, a resposta celular, para esclarecer melhor
os mecanismos de resistência e patologia desta doença.
A infecção por Leishmania é caracterizada por um espectro de fenótipos, resistentes ou
susceptíveis, que são dependentes da resposta imune associada à atividade de linfócitos. Estes
fenótipos foram amplamente estudados em camundongos, são poucos os estudos voltados
para a infecção humana. (LIEW ,1990; CABRAL et al., 1992; PERSON e SOUSA, 1996).
Coutinho et al. (1998) e Da-Cruz et al. (1994 e 2002), analisando células mononucleares do
sangue periférico (PBMC) de pacientes de área endêmica de leishmaniose cutânea,
estimuladas com antígenos de promastigotas de L. braziliensis, antes e após tratamento com
antimônio, relatam um aumento de linfócitos T CD8+ e diminuição das células T CD4+ e da razão CD4/CD8. Também foi observado aumento do IFNγ depois do tratamento. Por outro
lado, Ajdary et al. (2000), estudando PBMC estimuladas com antígenos de Leishmania de
pacientes com leishmaniose cutânea, relatam ter encontrado valores similares de células
CD4+ em pacientes com lesão ativa e pacientes já curados, em contraste com os estudos de
Coutinho et al. (1998) E Da-Cruz et al. (1994 e 2002).
Linfócitos T CD8+ também apresentam papel importante na resposta imune, levando à cura
da Leishmaniose em camundongo como ensina (BERTHO et al., 1994; MULLER et al., 1993). Estes linfócitos ativados por antígenos produzem IFNγ e podem ter efeito citolítico para macrófagos para os autores (MULLER et al., 1993; CONCEIÇÃO-SILVA et al., 1994). Young E Hardy (1995) mostraram que, dentre os seus diversos efeitos, o IFNγ e o TNFα atuam como os principais estimuladores de macrófagos, ativadores de células “Natural Killer”
(NK) e da diferenciação de linfócitos T e B. Segundo Junior et al. (2002), os níveis iniciais de TNFα foram semelhantes antes da terapia, com antimoniais diminuindo, significativamente, após o tratamento.
As células NK também são decisivas na resposta de cura e eliminação dos parasitos pela sua capacidade de produção de IFNγ e pela sua capacidade citotóxica contra macrófagos infectados com Leishmania segundo os autores (LASKAY et al., 1995; MAASHO et al.,
1998; SALAIZA-SUAZO et al., 1999).
A análise celular local e sistêmica, feita por Esterre e colaboradores em 1992, considerando a
lesão e o PBMC, revelou no tecido uma razão CD4/CD8 (1,05) menor do que no sangue
(1,48). Em análise semelhante, Castes et al. 1998 encontraram 43,5% de células T CD4+ no
sangue e 38,9% delas na lesão; 23,8% de células T CD8+ no sangue e 33,5% no tecido. Já a
O mecanismo imune envolvido no processo de cura pode ser provavelmente diferente em
cada tipo de tratamento. Células de pacientes tratados com a associação de Glucantime®® e Leishvacin® produzem, significativamente, menos INFγ in vitro do que aquelas de pacientes tratados apenas com Glucantime®. A interleucina 12 estimula a produção de INFγ por NK e células T (PRUSSIN e METCALFE, 1995) e está envolvida na resistência à infecção pela
Leishmania (BACELLAR et al., 1996; MATTNER et al., 1996). A interleucina 10 diminui
depois do tratamento por imunoquimioterapia, quando comparada com quimioterapia. PBMC
de pacientes não tratados, em resposta a antígenos específicos, apresentam maior número
células T CD4+. Entretanto, depois do tratamento de grupos distintos por quimioterapia ou
imunoquimioterapia,a razão CD4/CD8 diminuiu em ambos os grupos indicado pelo aumento
de células T CD8+ nos dois grupos como ensina Toledo et al. ( 2001).
Vários estudos foram conduzidos, tanto em modelo experimental como em seres humanos, no
intuito de se conhecer melhor as leishmanioses e assim poder atuar com mais eficiência no
seu controle. O material experimental tem a vantagem de permitir o controle de variáveis que
interferem no processo, além de permitir o planejamento para colheita do material. Não
obstante, os resultados obtidos nem sempre podem ser extrapolados para o Homem. Assim
sendo, os estudos em humanos adquirem especial importância.
Os mecanismos envolvidos na resposta imune de portadores de LTA não estão claramente
elucidados. Sabe-se que o sistema imunológico do Homem é capaz de desenvolver tanto
resposta celular como humoral durante a infecção por Leishmania. Contudo devido às
Além disso, esse trabalho se justifica também pela necessidade de buscarmos indicadores de
cura por terapêutica. Em trabalho anterior, vimos que Botelho (1998) utilizando análises
histopatológicas de biópsias de lesão e de cicatriz pós-tratamento de pacientes atendidos no
Ambulatório Paulo Araújo de Magalhães, mostrou a permanência de um infiltrado
inflamatório nas cicatrizes de pacientes clinicamente curados.Este estudo sugere, que mesmo
após a cura clínica, ainda ocorre inflamação no local da lesão, que pode estar relacionado à
2 JUSTIFICATIVA
Através de análise histopatológica, realizada em fragmentos de lesões antes e após o
tratamento de pacientes com LTA, submetidos a quatro diferentes esquemas terapêuticos,
mostramos que em alguns pacientes, mesmo após o tratamento e com diagnóstico de cura
anátomo-clínica, as lesões dérmicas continuaram em atividade, apesar da epitelização
resultante da cicatrização segundo Botelho et al. (1998). O critério de cura histopatológica,
quando comparado à cura anátomo-clínica, não coincidiu da mesma forma para cada um dos
grupos estudados. Apesar do processo de cicatrização ser o mesmo nos diferentes tratamentos,
nem sempre os critérios de cura coincidem.
O clínico considera cura anátomo-clínica, a completa cicatrização da úlcera. Todavia, o
patologista, por vezes, nesta mesma cicatriz observa fenômenos exsudativos. A persistência
de algumas espécies de Leishmanias por longos períodos no hospedeiro é um fato comum
(VILLELA et al. 1939; SCHUBACH et al. 1987 e 1998; AEBISCHER, 1994), despertando
grande interesse de imunologistas.
Acredita-se que a persistência do parasito em lesões consideradas clinicamente curadas seria
responsável por metástases em mucosa ou reativação da lesão, nos casos em que o hospedeiro
torna-se imunodeprimido por doença ou medicamento conforme os autores (COURA et al.,
1987; ROSSELL et al., 1992; AEBISCHER, 1993 e 1994; RAMÍREZ e GUEVARA, 1997;
Schubach et al. (1987), analisando biópsias de tecidos, mostraram a presença de parasitos em
cultura de tecido da cicatriz de pacientes considerados clinicamente curados. No mesmo ano
(1987), estes autores estudaram 33 biópsias de cicatrizes de vários pacientes clinicamente
curados e encontraram 3,2% de culturas positivas em meio NNN.
Utilizando-se da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em fragmentos de biópsias de
cicatrizes de pacientes curados (de 1 mês a 8 anos após o tratamento) detectou-se ainda DNA
de Leishmania, (SCHUBACH et al., 1998). Estes mesmos autores, em 1998, encontraram
parasitos nas biópsias de cicatrizes de dois pacientes com cura clínica há mais de 8 anos,
sendo que, em um dos casos, foi possível demonstrar a viabilidade dos parasitos através de
infecção de hamster. Em um estudo onde se avaliou a persistência do parasito em lesões
clinicamente curadas de pacientes com leishmaniose tegumentar, em 31 pacientes com cura
clínica variando de 1 a 11 anos, foi detectado, por PCR em biópsias de cicatrizes, a presença
de DNA do parasito em 93,5% dos indivíduos para Mendonça (2000). Vários trabalhos
utilizando PCR vêm demonstrando uma elevada percentagem de positividade em biópsias de
cicatrizes muitos anos após a cura (HADDAD et al., 1996; SCHUBACH et al. ,1998;
PIRMEZ, 2000).
A persistência da presença do parasito nos leva a pensar numa possível falha na detecção da
cura do paciente. Este caráter falaz foi relatado por D'ultra e Silva (1915) nas observações dos
primeiros pacientes com leishmaniose, tratados pelo tártaro emético, quando chamaram a
atenção para o fato de que a cicatrização das lesões pode não ser indício de cura completa.
Schubach et al. (1987) confirmaram esses achados, relatando um caso de leishmaniose,
tratado em 1979 com 75 doses de antimônio pentavalente, em que, oito anos após a cura, teve
Existem novas avaliações a respeito da importância epidemiológica do Homem como
reservatório potencial. Nos casos de persistência do parasito após a cura clínica em pacientes
que migraram para áreas onde previamente, não existia a doença, mas que apresente uma
grande população de flebotomíneos segundo os autores (AEBISCHER , 1994; MARZOCHI ,
1994; SCHUBACH et al., 1998). Outras considerações são aquelas relacionadas à
transmissão em áreas não endêmicas por transfusão sangüíneas ou através de doação de
órgãos como salienta Ramírez e Guevara (1997).
Por se tratar de uma doença que potencialmente pode gerar lesões graves, destrutivas e
incapacitantes, o possível encontro de parasitos em pacientes clinicamente curados para
leishmaniose, além de fornecer subsídios para uma melhor compreensão da relação
parasito-hospedeiro, poderá ajudar a identificar indivíduos com risco de apresentar recorrência da
doença, quando em situações de imunossupressão. Como mencionado acima, este tipo de
estudo tem ainda grande importância epidemiológica quando se avalia transmissão.
Novas pesquisas são necessárias para determinar a real importância da persistência do
parasito em cicatrizes cutâneas na transmissão da doença, na patofisiologia da forma mucosa
da leishmaniose e nas recidivas.
O estudo da imunidade celular e molecular poderá permitir uma melhor avaliação da cura do
paciente, após análise comparativa e associativa do perfil das células mononucleares do
sangue periférico, com os da lesão e da cicatriz de fragmentos de pele de pacientes com LTA.
O perfil imunofenotípico corrobora para a compreensão do desempenho do sistema imune do
citados por vários autores (VILELA et al.,1939; FURTADO, 1968; NADIM, 1984;
WEIGLE et al.,1985; NETO et al., 1990; SARAIVA et al., 1990). Os dados adquirem ainda,
especial importância, por se tratar de material humano, cujos resultados são a expressão dos
fenômenos ocorridos naquele momento, dispensando correlações interespécies.
Considerando o exposto, acredita-se que o estudo da resposta imune humana analisada pelo
sangue periférico e sua correlação com os achados imuno-histopatológicos contribuirá para o
entendimento da evolução da doença em indivíduos submetidos aos diferentes tratamentos e
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Identificar os fenótipos das populações celulares do exsudato inflamatório nas lesões de
pacientes com LTA antes do tratamento e nas cicatrizes após diferentes tratamentos,
associados aos estudos fenotípicos das células sanguíneas.
3.2 Objetivos Específicos
• Caracterizar a população estudada, quanto à idade, ao sexo e a diagnósticos positivos para LTA;
• Confirmar a cura clínica e parasitológica através da pesquisa do DNA do parasito em biópsias de tecidos das lesões dos pacientes com LTA, antes e após o tratamento,
através da Reação em Cadeia da Polimerase – PCR;
• Avaliar, através de imunoistoquímica, a percentagem de células CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD16+, CD57+, CD14+, CD68+ e as razões CD3/CD4, CD3/CD19 nas
• Avaliar, através de citometria de fluxo, a percentagem de células CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+CD56+ e as razões CD3/CD4, CD3/CD19 nas subpopulações de
células mononucleares do sangue periférico de pacientes com LTA, antes e após
diferentes tratamentos;
• Comparar os percentuais das populações e subpopulações de células mononucleares do sangue periférico, com as presentes no exsudato inflamatório de lesões de LTA,
4 POPULAÇÃO ESTUDADA, MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Grupos de indivíduos tratados e de não infectados
Os pacientes participantes neste estudo, num total de 81 indivíduos, foram reunidos
aleatoriamente, ambos os gêneros, entre aqueles atendidos no ambulatório Paulo Araújo
Magalhães, no Município de Caratinga (MG), com diagnóstico de LTA. Como grupo
controle, foram avaliados moradores da mesma região, sem história clínica de LTA e com
sorologia negativa para leishmaniose. O critério de inclusão neste estudo foi a positividade
para o teste de Montenegro e, ou parasitológico para Leishmaniose e indicação de tratamento.
Estes indivíduos foram tratados quando apresentaram diagnóstico clínico para LTA,
confirmado por, pelo menos, um diagnóstico laboratorial: teste parasitológico ou teste de
Montenegro. Os indivíduos positivos foram divididos e submetidos a diferentes tratamentos:
Glucantime®, Leishvacin® e Glucantime® associado ao Leishvacin®. Alguns destes
pacientes foram tratados nos anos 1992 e 1993 (denominados de Grupo Antigo), os outros
4.1.1 Grupo de pacientes tratados com Glucantime® (Quimioterapia)
O Glucantime® foi administrado na dose diária de 1mL/5Kg/peso, sem exceder a dose de
10mL/dia, em séries de dez dias. A série foi repetida após o intervalo de dez dias até a cura
clínica. O período de 10 dias de tratamento e 10 dias de intervalo foi considerado como uma
série de tratamento.
4.1.1.1 Pacientes tratados em 2001/2002 (Grupo Recente)
Este grupo constituiu-se de dez pacientes tratados com o antimonial pentavalente (SbV) o
N-metilglucamine (Glucantime® da Rhodia, Santo André, SP) contendo 85 mg do antimonial
por mL, por via intramuscular profunda. O grupo compôs-se de três pacientes do sexo
feminino e sete do masculino, com a média de idade 29 anos; intervalo de 12 a 71 anos; com
lesões localizadas nos membros inferiores. O teste parasitológico para o diagnóstico foi
negativo em oito pacientes e o teste Montenegro foi positivo em nove pacientes. O tempo
médio da evolução da lesão, antes do tratamento, foi de 65 dias, com intervalo de 12 a 90
dias. Lesão única foi observada em seis dos pacientes deste grupo. O número de séries de
Glucantime® aplicadas aos pacientes variou de dois a oito, equivalentes a 40 a 160 dias de
tratamento.
4.1.1.2 Pacientes tratados em 1992/1993 (Grupo Antigo)
