Os animais dos grupos de exposição foram segregados em regime de tratamento agudo (N = 5/grupo) e subcrônico (N = 8/grupo) ao pó de Cr (III) atmosférico (Figuras
7 e 8).
3.5.1 – Exposição aguda – avaliação genotóxica
Para avaliação dos efeitos da exposição aguda ao pó de Cr (III) atmosférico nas concentrações de 250 e 500 µg/m3, os animais foram mantidos em caixa de inalação por 8 h. Após 4 e 24 h da exposição, amostras de sangue periférico foram colhidas para processamento do ensaio cometa mediante pequena incisão na cauda dos animais, seguida de assepsia com solução de álcool 70%. Ao final do tratamento agudo, os animais foram eutanasiados por sobredose de tiopental e componentes da medula óssea de ambos os fêmures de cada animal foram colhidos por punção para processamento dos testes de Micronúcleos e Aberrações Cromossômicas.
3.5.1.1 Ensaio cometa alcalino
Para realização do ensaio cometa, foi utilizado o procedimento padrão alcalino descrito por Tice et al. (2000), conforme esquema apresentado na Figura 10. Após cada coleta de sangue periférico dos animais, cinco µL de células sanguíneas (sangue total heparinizado) foram pipetados e misturados a 95 µL de agarose Low Mellting e espalhados sobre lâminas embebidas em gel de agarose e cobertas com lamínulas. Foram confeccionadas 2 lâminas por animal, em cada coleta. As lâminas foram inseridas em solução de lise por 2 horas. Após este período, as lâminas foram imersas em tampão de pH alcalino (>13), durante 25 minutos. Este processo permitirá o desenovelamento das cadeias de DNA por meio do rompimento das estruturas secundária e terciária, presentes no núcleo celular. Após o desenovelamento, as lâminas foram submetidas a uma corrente elétrica em cuba de eletroforese, que induziu a migração dos fragmentos de DNA no sentido do ânodo, durante 25 minutos, a 25 volts e 300 mA. Todas estas etapas foram realizadas sob luz indireta, fraca para evitar danos adicionais ao DNA. As lâminas foram neutralizadas logo após a eletroforese com tampão Tris 0,4 M, pH 7.5, fixadas, lavadas com água destilada e secas por 12 h. Após
53 hidratação durante 5 minutos em água destilada, as lâminas foram coradas com Gelred e analisadas ao microscópio de fluorescência. Foram avaliados os parâmetros de tail
moment, que reflete a extensão dos danos ao DNA, mensurado por meio do
comprimento da distância de migração do DNA a partir do centro do nucleoide, percentagem de DNA na cauda e comprimento da cauda por meio do software
Opencomet v.1.3.1 (GYORI et al., 2014).
Figura 10. Esquema representativo do procedimento experimental para realização do ensaio cometa alcalino.
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3.5.1.2 Teste de Micronúcleos em medula óssea
O procedimento para a realização do teste de Micronúcleos foi realizado de acordo com Mavournin et al. (1990) com adaptações, conforme esquema apresentado na
Figura 11. Componentes de medula óssea foram coletados de ambos os fêmures dos
animais, após o sacrifício. Os fêmures foram retirados e limpos com auxílio de tesoura e pinça de dissecação e papel-toalha absorvente áspero. Para expor o canal da medula, a extremidade final proximal do fêmur foi cortada. Uma agulha histológica foi inserida firmemente na abertura do fêmur para possibilitar a extração da medula, que foi misturada a 0,3 mL de soro fetal bovino previamente colocado sobre uma das extremidades de uma lâmina de microscopia codificada. Com uma espátula curva, a amostra de medula óssea foi homogeneizada em soro, obtendo-se uma suspensão de células. Foi realizado esfregaço da suspensão celular sobre a lâmina com auxílio de lâmina extensora. Duas lâminas foram preparadas por animal. Após secagem da preparação por aproximadamente 30 minutos, as lâminas foram tratadas com metanol à temperatura ambiente por 10 minutos para fixação do material biológico. Após secagem por 30 minutos, foi realizada a coloração utilizando corante de Giemsa (Merck) diluído em tampão fosfato 0,2 M, pH 5.8 (proporção de 1:9). Após 7 minutos nesta solução de coloração, as lâminas foram enxaguadas em água destilada, secas e guardadas em caixas de lâminas até a análise. Para contagem dos eritrócitos normocromáticos (ENC), eritrócitos policromáticos (EPC) e micronúcleos em EPC, foi utilizado microscópio de luz com auxílio de objetiva de imersão. Até 2.000 EPC foram analisados por animal. A relação EPC/ENC foi determinada pela avaliação da frequência de EPC em 500 eritrócitos por animal.
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Figura 11. Esquema representativo do procedimento experimental para realização do teste de micronúcleos.
Fonte: Adaptado de Mavournin et al. (1990).
3.5.1.3 Teste de Aberrações Cromossômicas
As preparações metafásicas para a análise convencional de aberrações cromossômicas (AC) foram efetuadas em componentes de medula óssea, de acordo com Sram et al. (2007), com algumas adaptações (Figura 12). Foram adicionadas 18 gotas de homogenato de medula óssea em frascos de cultura contendo 5 mL de meio RPMI 1640 (composição: 15% de soro bovino fetal, aminoácidos e 2% de fitohemaglutinina (Cultilab), para estimular a divisão celular). As culturas foram incubadas em estufa comum a 37ºC por 72 h. Em seguida, foi adicionado colchicina (16 g/mL, Sigma), 2 horas antes de completar 48 horas de incubação, para obtenção de células em metáfase. Após 72 horas de incubação, as culturas de linfócitos foram transferidas para um tubo falcon de 10 mL estéril e centrifugadas a 1.000 rpm por 5 minutos, seguido por lavagem com solução hipotônica KCl (0,075 M) para rompimento das membranas celulares. Em seguida, foi adicionado 5 mL de solução fixadora (metanol: ácido acético 3:1) (Merck)
56 em cada tubo. As lâminas foram preparadas pelo método de Moorhead et al. (1960) modificado e as metáfases foram coradas com Giemsa (10%) diluído em tampão Sorensen para posterior visualização ao microscópio. Foram analisadas 100 metáfases/animal bem espalhadas e sem sobreposição, em microscópio de luz, com auxílio de objetiva de imersão. As aberrações cromossômicas foram avaliadas em 100 metáfases, considerando os cromossomos dicêntricos e tricêntricos, cromossomos em anéis e em anéis acêntricos, fragmentos cromossômicos, deleções terminais e deleções intersticiais, identificados segundo Tolbert et al. (1991).
Figura 12. Esquema representativo do procedimento experimental para realização do teste de aberrações cromossômicas.
Fonte: Adaptado de Sram et al. (2007).
3.5.2 – Exposição subcrônica – avaliação histopatológica
Para a exposição subcrônica ao pó de Cr (III) atmosférico na concentração de 500 µg/m3, os animais foram mantidos em câmara de inalação por 1h30m/dia, durante 45 dias de tratamento. Ao final do tratamento subcrônico, os animais foram
57 eutanasiados por sobredose de tiopental e amostras de tecido hepático e pulmonar foram colhidas para processamento histopatológico.
3.5.2.1 Análise histopatológica
Amostras de tecido hepático e pulmonar dos animais foram fixadas em formalina 10%, durante 72 h. Para o exame de alterações morfológicas em microscópio óptico (aumento de 200X e 400X), pequenos fragmentos do fígado e do pulmão dos ratos foram processados, incorporados em parafina e seccionados (3-5 µm) para preparação de lâminas e coloração com hematoxilina-eosina (H-E). Os scores utilizados para avaliar o tecido pulmonar quanto às alterações observadas foram – 0 = negativo; 1 = muito leve; 2 = leve; 3 = moderado; 4 = grave. Para o tecido hepático, os scores
utilizados na avaliação das alterações observadas foram – 0 = ausente; 1 = aumento discreto; 2 = aumento moderado; 3 = aumento marcadamente presente; 4 = aumento fortemente presente. O sistema de pontuação para classificar lesões pulmonares e hepáticas foram baseados nos critérios estabelecidos pela Sociedade Brasileira de Patologia e pela Sociedade Brasileira de Hepatologia (1999).