Teste de Aberrações Cromossômicas

Em certos momentos durante a divisão celular são observadas alterações na estrutura cromossômica normal, as chamadas aberrações cromossômicas (AC). As AC podem ser classificadas como aberrações intra e inter-cromossômicas. A primeira classe

45 compreende aberrações dentro de um único cromossomo, tais como deleções terminais e intersticiais e inversões; A segunda classe compreende rearranjos entre dois ou mais cromossomos, tais como translocações e dicentrics (PFEIFFER; GOEDECKE; OBE, 2000).

Em geral, as AC são analisadas em mitose numa fase semelhante à metáfase induzida pela colchicina, primeiramente postulado por Levan (1938). A fusão de células mitóticas com células interfásicas induz a condensação prematura de cromossomos, o que permite a análise de cromossomos em estádios nos quais eles normalmente não são visíveis (CORNFORTH, 1998).

A coloração de cromossomos com Giemsa permite a análise de diferentes tipos de AC, tais como cromossomos policêntricos, cromossomos em anel, intercâmbios de cromátides e fragmentos cromossômicos. Outros tipos de AC, tais como translocações e inversões recíprocas, não são normalmente reconhecíveis com a coloração por Giemsa, mas podem ser visualizados por hibridização fluorescente in situ (FISH) (SIMPSON et al., 1999). Além disso, pontos de quebra em cromossomos podem ser localizados por bandas coradas por Giemsa ou com a ajuda de técnicas especiais, como o FISH (JOHANNES; CHUDOBA; OBE, 1999; BERARDINELLI et al., 2015).

Nas células somáticas "normais", a frequência de AC espontâneas é bastante reduzida, com ~ 1/1000 linfócitos humanos. A exposição de células a agentes clastogênicos, no entanto, pode aumentar a frequência de formação das AC. Embora certos tipos de AC sejam letais, outras podem levar à transformação oncogênica, como por exemplo mediante inativação de um gene supressor de tumor, ou ativação de um proto-oncogene em oncogene, gerando novas proteínas capazes de iniciar a carcinogênese (PIEROTTI et al., 1992).

De fato, as frequências elevadas de AC estão frequentemente correlacionadas com risco elevado de câncer (HAGMAR et al., 1998) e certas neoplasias humanas estão associadas com AC bem definidas (MITELMAN et al., 1997). Por conseguinte, as AC são consideradas uma marca em todas as células tumorais e a formação contínua de AC nestas células reflete a instabilidade genômica associada à progressão do câncer.

A agência reguladora Food and Drug Administration (US) recomenda a integração dos resultados de estudos toxicogenéticos em relação à análise de metáfases de linfócitos do sangue periférico em estudos com ratos, como ensaio adicional in vivo

46 útil no esclarecimento dos resultados positivos de instabilidade genética in vitro. A utilização de linfócitos a partir do Teste de Aberrações Cromossômicas, como biomarcadores em testes de genotoxicidade crônica, são bastante comuns, considerando que estas células estão expostas a níveis sanguíneos da substância investigada e os possíveis danos ocasionados pela acumulação de metabólitos podem ser visualizados, a partir de um determinado período de exposição. A vida útil de linfócitos varia entre espécies, mas, em ratos, o tempo médio de viabilidade é de ~1 mês e >5% têm uma vida útil de ~9 meses (DOHERTY, et al., 2012).

Atualmente, os ensaios de aberrações cromossômicas in vitro são amplamente reconhecidos por proporcionar evidências que indicam ocorrência de ataque direto ao DNA por agentes de caráter aneugênico/clastogênico. Estes resultados são correlacionados às aberrações cromossômicas evidenciadas em linhagens celulares de hamster (CHO e CHL), em linfócitos de sangue periférico humano em cultura e em ratos (HILLIARD et al., 2007; DOHERTY, et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2016). As aberrações cromossômicas mais frequentemente analisadas em linfócitos de ratos consistem nos cromossomos dicêntricos, formações de cromossomos em anéis e micronúcleos (CLARE, 2011).

Estas aberrações ocorrem quando as células expostas aos agentes mutagênicos sofrem ataques ao DNA cromossomal, dando origem a fragmentos. Estes fragmentos cromossômicos se reagrupam de forma incorreta e caracterizam as figuras aberrantes observadas no teste (Figura 6). Estudos tem apontado que a frequência de aberrações cromossômicas está relacionada à dose absorvida pelas células expostas aos agentes indutores de instabilidade genômica (OLIVEIRA et al., 2016).

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Figura 6. Linfócitos de Rattus norvegicus avaliados pelo teste de aberrações cromossômicas. (A) ideograma dos cromossomos de ratos n=42. (B) cariótipo de ratos sem danos cromossômicos. (C) anel cromossômico (seta). (D) cromossomo dicêntrico (seta).

Fonte: adaptado de Doherty e al. (2012).

Os cromossomos dicêntricos ocorrem quando há uma troca entre os fragmentos de dois cromossomos separados, resultando em um cromossomo aberrante com dois centrômeros (OHNO et al., 2015). O anel cromossômico, ou anel central, se forma a partir da troca entre duas quebras em braços separados do mesmo cromossomo e é também acompanhada de um fragmento acêntrico (cromossomo sem centrômero) (JI et al., 2015). Já os micronúcleos são formados por meio de quebras cromossômicas em fragmentos menores (danos clastogênicos), ou mesmo de cromossomos inteiros em anáfase (danos aneugênicos), que não estão incluídos no núcleo das células filhas (WALDRON, 2015).

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2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Avaliar os possíveis efeitos genotóxicos e carcinogênicos da exposição de Rattus

norvegicus machos ao pó de cromo trivalente atmosférico.

2.2 Específicos

 Verificar os efeitos genotóxicos e reparo de danos ao DNA em células de sangue

periférico de Rattus norvegicus em exposição aguda ao pó de Cr (III) atmosférico;

 Investigar a possível mutagenicidade em células de medula óssea de Rattus

norvegicus em exposição aguda ao pó de Cr (III) atmosférico;

 Avaliar o nível de clastogenicidade/aneugenicidade em eritrócitos

policromáticos de medula óssea de Rattus norvegicus em exposição aguda ao pó de Cr (III) atmosférico;

 Analisar os tecidos pulmonar e hepático dos Rattus norvegicus em exposição subcrônica ao pó de Cr (III) atmosférico.

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais experimentais

Foram utilizados 36 ratos Wistar (Rattus norvegivus), albinos, machos, adultos (8 semanas de idade), com peso aproximado de 200 g ± 40 g, obtidos do Biotério da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual do Piauí. Os animais foram mantidos em caixas (máximo de 5 animais/caixa) de polipropileno com maravalha e em condições controladas de temperatura (22 ± 2ºC) e umidade (40-60%), ciclo claro/escuro de 12 h. Todos os animais tiveram acesso ad libitum a pellets de Purina® e água. A quantidade de animais seguiu a regulamentação do Comitê de Ética da Universidade Federal do Ceará, bem como do guia OECD n° 489 de 2014, que preconiza o número mínimo de 5 animais para avaliação genotóxica. Foram escolhidos animais machos a fim de minimizar viés de interferência hormonal no estudo de carcinogênese (KADEKAR et al., 2012).

Todos os procedimentos relacionados ao uso de animais como modelo experimental foram realizados segundo as normas preconizadas no “Guide for the Care

and Use of Laboratory Animals” (Institute of Laboratory Animals Resoruces, National

Academy of Science, Washington, D.C., 1996), pelos Princípios Éticos estabelecidos

pela Experimentação Animal do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA (2008) e pela Lei Federal 11.794 de 08 de outubro de 2008. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Faculdade DeVry Facid (#24/2013).

3.2 Reagentes químicos

Os reagentes e demais insumos químicos foram obtidos da Sigma-Aldrich Brasil.

3.3 Desenho do estudo

A investigação foi dividida em duas etapas. Para a primeira (Figura 7), os animais foram separados aleatoriamente em 4 grupos de 5 animais, sendo realizadas avaliações genotóxicas (cometa, micronúcleo e aberrações cromossômicas). Para isso, dois grupos de animais foram expostos de forma aguda ao pó de Cr (III), Sigma ref.

50 266299, em concentrações diferentes do metal (250 e 500 μg/m3, v.n.) em câmara de exposição. Compuseram o grupo controle negativo animais tratados com água destilada 10 mL/kg, v.o., e o grupo controle positivo animais tratados com ciclofosfamida 50 mg/kg, i.p., conforme regulamenta a OECD nº 474 de 1997. Os animais do grupo controle negativo e positivo não foram inseridos na câmara de exposição.

Figura 7. Ilustração do método para avaliar a genotoxicidade aguda do Cr (III) em Rattus norvegicus.

Análise estatística

Fonte: Leal, SRMD.

No segundo momento, dois grupos (Figura 8) foram utilizados para verificação dos efeitos subcrônicos do Cr (III). O primeiro grupo, controle negativo (exposto ao ar filtrado HEPA) e o segundo grupo exposto de forma atmosférica ao pó de Cr (III) 500 µg/m3, 1h e 30 min por dia, durante 45 dias em câmara de exposição. Ao fim do experimento fez-se um estudo histopatológico dos tecidos pulmonar e hepático.

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Figura 8. Desenho experimental do tratamento subcrônico.

Fonte: Leal, SRMD.