Identificação das frações enriquecidas com o proteassoma 20S submetidas à

5.2.1. Ensaios de atividade peptidásica quimotripsina-símile

Os extratos de proteínas solúveis obtidas de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni, pré-enriquecidos como descrito no item 4.2, foram submetidos à cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400, resina com faixa de resolução de 20 a 8000 kDa. Após a determinação do intervalo de frações no qual as proteínas estavam presentes pela medida da absorbância a 280 nm, as frações foram ensaiadas quanto à atividade peptidásica quimotripsina-símile em três diferentes condições: substrato; substrato e SDS 0,02%; substrato e MG-132 20 µM. Realizando-se ensaios de atividade peptidásica quimotripsina-símile nestas diferentes condições, é possível identificar quais frações estão enriquecidas com o proteassoma 20S (figura 14).

46

Figura 14: Cromatogramas a 280 nm e medidas da atividade peptidásica quimotripsina-símile dos extratos

proteicos de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni submetidos à cromatografia em Sephacryl S-400. As frações, coletadas em um volume aproximado de 4 mL, foram ensaiadas quanto à atividade peptidásica quimotripsina-símile em três diferentes condições: substrato; substrato + SDS 0,02%; substrato + MG-132 20 µM. Alíquotas de 10 µL das frações eluídas para os extratos de fígado de camundongo e eritrócitos humanos e de 50 µL para o de vermes adultos de Schistosoma mansoni foram utilizadas nas reações de atividade peptidásica. As setas em vermelho indicam as frações enriquecidas com o proteassoma 20S, ou seja, frações ativadas por baixas concentrações de SDS e fortemente inibidas pelo MG-132. Substrato: Suc-LLVY-MCA. UAF: Unidades Arbitrárias de Fluorescência.

47

Baixas concentrações de SDS são capazes de ativar a atividade quimotripsina-símile in

vitro. Embora o mecanismo de ativação não esteja claro, sugere-se que agentes caotrópicos como o SDS ou o calor podem seletivamente desnaturar a região N-terminal das subunidades α, facilitando o acesso do peptídeo ao núcleo catalítico (Kimura et al., 2000). Além disso, observa-se, in vivo, que os proteassomas interagem com várias proteínas intracelulares denominadas PIPs (Proteasome Interacting Proteins), responsáveis por regular a proteólise. A ruptura destas interações pelo SDS pode favorecer a entrada do peptídeo no núcleo catalítico, aumentando, assim, a taxa de hidrólise (Verma et al., 2000).

O MG-132, assim como outros peptídeos aldeídicos, são inibidores clássicos da atividade quimotripsina-símile do proteassoma. Apesar da alta seletivade para o proteassoma, o MG-132 também é capaz de inibir certas cisteíno-proteases lisossomais e calpaínas (Lee

and Goldberg, 1998).

A análise dos gráficos permitiu a identificação das frações enriquecidas com proteassoma 20S (ativadas por baixas concentrações de SDS e fortemente inibidas pelo MG- 132): fração 15 para o extrato de fígado de camundongo Swiss, fração 16 para o extrato de eritrócitos humanos e frações 17 a 19 para o extrato de vermes adultos de S. mansoni (setas indicativas em vermelho). Observa-se que essas frações correspondem ao início dos picos cromatográficos, o que proporcionou uma separação satisfatória do proteassoma 20S das demais proteínas e proteases de menor massa molecular. Além disso, o fato dos 3 proteassomas apresentarem picos em frações aproximadamente equivalentes, indica que no enriquecimento predomina a forma 20S, de massa molecular altamente conservada entre os eucariotos.

Nas frações das amostras de eritrócitos humanos e S. mansoni, observa-se um menor conteúdo e heterogeneidade de proteases, uma vez que as mesmas foram fortemente inibidas pelo MG-132. Por outro lado, é possível notar que na amostra de fígado de camundongo, entre as frações 16 a 18, há uma maior proporção de outras proteases citossólicas, dado que a presença de SDS 0,02% no meio reacional diminuiu a atividade peptidásica e o MG-132 não a inibiu totalmente.

As frações enriquecidas com proteassoma 20S foram submetidas à SDS-PAGE e ensaios de Western Blotting para as análises dos perfis proteicos e do enriquecimento das preparações de proteassoma 20S.

48

5.2.2. Análise dos perfis proteicos e ensaios de Western Blotting

Os perfis eletroforéticos e os ensaios de Western Blotting das frações enriquecidas com proteassoma 20S de fígado de camundongo Swiss, eritrócitos humanos e vermes adultos de Schistosoma mansoni são apresentados na figura 15.

Figura 15: SDS-PAGE 10% e ensaios de Western Blotting das frações enriquecidas com proteassoma 20S

identificadas pela medida da atividade quimotripsina-símile (item 5.2.1). Amostras: FC – fígado de

camundongo; EH – eritrócitos humanos; SM – vermes adultos de S. mansoni. PMM: Padrão de Massa

Molecular. Fr: fração.

A análise por Western Blotting das amostras detectaram bandas proteicas na região compreendida entre 20 e 30 kDa, compatíveis com as massas moleculares de subunidades α do proteassoma 20S. A produção do soro policlonal contendo anticorpos para a detecção do proteassoma foi induzida utilizando-se como antígeno imunogênico o peptídeo sintético TVWSPQGRLHQVEYAMEA. Esta sequência representa um motivo filogeneticamente conservado comum a seis tipos de subunidades α (α1, α2, α3, α5, α6 e α7), embora não necessariamente idêntico em todas (Hendil et al., 1995).

49

O enriquecimento com proteassoma 20S pela cromatografia de filtração molecular é demonstrado na figura 16. Quantidades equivalentes de proteínas (cerca de 10 μg) do extrato total e da fração enriquecida de fígado de camundongo foram utilizadas para tal procedimento. A análise densitométrica pelo software Quantity One da área correspondente às subunidades α do proteassoma 20S, detectadas pela técnica de Western Blotting, demonstrou um enriquecimento aproximado de 33%. O percentual alcançado foi considerado satisfatório, tendo em vista a utilização de uma única etapa cromatográfica e a separação do proteassoma 20S de outras proteases citosólicas (conforme discutido no item 5.2.1).

Figura 16: Perfil de enriquecimento com proteassoma 20S da amostra de fígado de camundongo submetido à

cromatografia de filtração molecular em Sephacryl S-400. Quantidades equivalentes de proteínas (cerca de 10μg) do extrato total (ET) e da fração enriquecida (FE) foram utilizadas para tal procedimento. As análises densitométricas realizadas no SDS-PAGE 10% e na membrana de Western Blotting pelo software Quantity One indicaram um enriquecimento aproximado de 33%. PMM: Padrão de Massa Molecular. Fr: fração.

50

5.3. Medida da atividade peptidásica com os inibidores PR-11 e análogos