Síntese em fase sólida e purificação em sistema HPLC

As sínteses do peptídeo PR-11 e de outras 13 estruturas análogas foram realizadas conforme especificado em materiais e métodos (item 4.1). Os peptídeos W12, F8W12 e G9 são análogos já descritos na literatura, os quais apresentaram um potencial de inibição superior ao PR-11 sobre o proteassoma 20S de humanos (Anbanandam et al., 2008). Os demais peptídeos foram propostos baseados na estrutura desses análogos, através da substituição conservativa de aminoácidos e a introdução de pares de cisteína para obtenção de peptídeos cíclicos. Assim sendo, alterou-se uma série de aminoácidos na região C-terminal: substituições de triptofano (W) por fenilalanina (F); leucina (L) por isoleucina (I); tirosina (Y) por alanina (A) e fenilalanina; tirosina, leucina e prolina (P) por cisteína (C) para a síntese de análogos cíclicos. As modificações concentraram-se na região C-terminal dos peptídeos, dado que a região N-terminal é importante para a manutenção da atividade inibitória sobre o proteassoma 20S (Gaczynska et al., 2003; Anbanandam et al., 2008).

As sínteses dos 14 peptídeos foram realizadas em fase sólida utilizando a via Fmoc. A estratégia Fmoc foi escolhida por apresentar consideráveis vantagens em relação à estratégia t-Boc, como um maior percentual de rendimento e pureza do peptídeo esperado. Na estratégia Fmoc, além das condições reacionais serem menos agressivas, as remoções dos protetores do N-terminal e das cadeias laterais dos aminoácidos ocorrem em meios completamente distintos (o grupo Fmoc é clivado em meio básico, enquanto os protetores permanentes das cadeias laterais são removidos em meio ácido juntamente com a dissociação do peptídeo da resina) (Fields and Noble, 1990). As condições fortemente ácidas da estratégia t-Boc (uso de TFA para a remoção do protetor t-Boc e HF - ácido fluorídrico - para a clivagem dos protetores permanentes das cadeias laterais) podem produzir alterações na integridade estrutural de peptídeos contendo sequências lábeis (Amblard et al., 2006).

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Após a síntese em fase sólida, todos os peptídeos foram submetidos à cromatografia de fase reversa em sistema HPLC para a análise de pureza (figura 9).

Figura 9: Perfis cromatográficos iniciais em sistema HPLC dos peptídeos sintetizados (fase estacionária: coluna

C18 - 250 mm x 4,6mm - Shim-pack CLD-ODS). As separações cromatográficas foram realizadas em gradiente de ACN de 0 a 80% e TFA 0,1% durante 30 minutos sob um fluxo de 1 mL/min.. Os peptídeos que apresentaram um componente principal facilmente purificável (picos indicados pelas setas vermelhas) foram recolhidos para a caracterização em espectrômetro de massas. Os demais foram submetidos a novas condições cromatográficas até que a purificação fosse alcançada.

40 Figura 9: Continuação.

Conforme observado na figura 9, os peptídeos sintetizados apresentaram diferentes perfis cromatográficos, dado que o rendimento e a pureza de síntese são dependentes do tamanho e da própria natureza da sequência de aminoácidos. As sínteses de peptídeos com um número elevado de aminoácidos ou envolvendo sequências que geram agregações justificam a maior impureza nos produtos de síntese e os cromatogramas mais complexos. A agregação impede uma completa solvatação do peptídeo ligado à resina e a acessibilidade de reagentes para permitir o acoplamento com os grupos amino N-terminais (Chan and White, 2000).

Os cromatogramas dos peptídeos PR-11, G9, G9F12, A8F12, F12 e I9F12 demonstraram um grau satisfatório de pureza, visto que houve a predominância de um único componente principal (picos indicados pelas setas vermelhas). Os demais peptídeos demonstraram perfis cromatográficos menos homogêneos e, consequentemente, apresentaram

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maiores dificuldades na etapa de purificação. Todavia, tal fato não impediu que todos os peptídeos fossem satisfatoriamente purificados.

Observou-se que todas as sínteses envolvendo o resíduo triptofano apresentaram cromatogramas complexos. Há duas reações laterais principais que ocorrem com esse aminoácido: oxidação durante a síntese e a alquilação do anel indólico por carbocátions gerados durante a etapa de clivagem (Stewart and Young, 1984). O grupo protetor Pbf liberado durante a desproteção de argininas pode alquilar a cadeia lateral do triptofano gerando subprodutos sulfonados (Fields and Fields, 1993). A figura 10 ilustra os aminoácidos derivatizados arginina e triptofano utilizados durante a síntese.

Figura 10: Estrutura dos aminoácidos derivatizados arginina e triptofano, destacando-se os respectivos

protetores das cadeias laterais Pbf e Boc.

Os cromatogramas dos análogos C8C15 e C9C15 apresentaram-se ainda mais complexos com a introdução dos pares de resíduos de cisteína, uma vez que grupos sulfidrila (SH) das cadeias laterais desse aminoácido podem estar nas formas reduzidas ou oxidadas. O processo de oxidação envolve ligações dissulfeto que podem resultar na agregação das sequências peptídicas. Além disso, nas sínteses envolvendo resíduos de cisteína protegidos com Trt (tritil) (figura 11), a remoção desse grupamento durante a desproteção pode ser incompleta, dada a reversibilidade da ligação. Esse processo ocorre pela elevada reatividade do grupo tiol e a alta estabilidade do cátion Trt (Chan and White, 2000). Problemas com a desproteção incompleta de Cys(Trt) podem ser resolvidos pelo emprego de trialquilsilanos na solução de clivagem, os quais removem os cátions Trt (Pearson et al., 1989).

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Figura 11: Estrutura do aminoácido derivatizado cisteína com o protetor da cadeia lateral Trt.

As sínteses dos peptídeos contendo cisteína no C-terminal apresentam, frequentemente, baixos rendimentos. Desta maneira, as sínteses dos análogos C8C15 e C9C15 foram iniciadas com um resíduo de glicina para facilitar a adição de cisteína, sem alterar, presumidamente, a atividade dos peptídeos (Chan and White, 2000). Logo, a introdução de um aminoácido pouco volumoso (glicina) funciona apenas como um espaçador entre a sequência peptídica e a resina.

Os análogos S9S15 e S1S14 mimetizam as estruturas de peptídeos cíclicos pelas substituições de resíduos de cisteína por serina. Esses aminoácidos podem ser considerados equivalentes quanto ao volume e hidrofilicidade, diferindo-se apenas quanto aos grupos funcionais das cadeias laterais. As alterações de cisteínas por serinas visam à obtenção de peptídeos semelhantes aos cíclicos, porém com um arranjo estrutural estendido. Os análogos S9S15 e S1S14 também tiveram as sínteses iniciadas por um resíduo de glicina.

Os peptídeos W12, F8W12, G9W12, I9W12, C8C15, C9C15, S9S15 e S1S14 foram purificados sob diferentes condições cromatográficas, as quais permitiram a purificação do componente principal de cada síntese (picos indicados pelas setas vermelhas na figura 12). Após o processo de purificação, os peptídeos foram submetidos à identificação por espectrometria de massas.

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Figura 12: Perfis cromatográficos em sistema HPLC (fase estacionária: coluna C18 - 250 mm x 4,6mm - Shim-

pack CLD-ODS) dos peptídeos nas condições cromatográficas que permitiram a purificação (conforme especificado). Os componentes principais foram purificados (picos indicados pelas setas vermelhas) e destinados à identificação por espectrometria de massas.

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