Implicações da análise de microssatélites do estudo da estru tura populacional do T rangel

Vár ios parâmetros populacionais foram calculados para acessar as características genéticas das cepas de T. rangeli estudadas. Quando solicitado pelos programas de análise, duas populações foram definidas: KP1+ e KP1-. Isto porque, por enquanto, a classificação das cepas de T. rangeli de acordo com o tipo de mini-círculo de kDNA é a única bem estabelecida e aceita ( VALLEJO; GUHL; CARRANZA et al., 2003; VALLEJO; MACEDO; CHI ARI et al., 1994). As análises foram reali- zadas para todos os 18 loci validados no capítulo II.

O cálculo do equilíbr io de Hardy Weinberg ( HWE) e as heteroz i- gosidades observadas e esperadas já foram discutidas no item II.4.5. Como esperado para populações de or igem clonal, as amostras não se encontram em HWE, apresentando baixos níveis de heterozigosidade. Na verdade, o teste exato para o HWE não é o adequado para este tipo de organismo (estrutura predominantemente clonal), já que a reprodução sexuada com acasalamento randômico (panmixia) não ocorre (FREE- LAND, 2005).

A baixa heterozigosidade também influencia outros parâmetros como o coeficiente de endocruzamento (FIS). O FIS foi calculado para cada população como medida do endocruzamento de indivíduos dentro de uma subpopulação que produz desvios do modelo de panmixia como resultado de genótipos não randômicos. Os valores de FIS tipicamente variam entre -1 (onde todos os loci são heterozigotos), 0 (onde os alelos são randomicamente distribuídos entre os indivíduos, ou seja, em equilí- brio de Hardy Weinberg) e +1 (onde todos os loci são homozigotos) (DE MEEUS; LEHMANN; BALLOUX, 2006). Para os loci estudados, dentro das duas populações, os valores de FIS foram de +1, corroborando com o elevado grau de homozigosidade encontrado entre as amostras.

Outra característica de populações que não estão em HWE é o desequilíbrio de ligação entre os pares de alelos, ou seja, os mesmos não estão distribuídos ao acaso e apresentam algum tipo de ligação. No caso dos loci estudados, em ambas as populações foram encontradas altas

porcentagens de loci com desequilíbrio positivo (Tabela I V.1); entretan- to, entre as populações, uma grande diferença foi observada. Para a po- pulação de amostras KP1-, 82% dos loci estão em desequilíbrio de liga- ção, enquanto que na população KP1+ somente 48%. Novamente estes valores são reflexo da maior homozigos idade observada entre as cepas KP1- (0,2321) em relação às KP1+ (0,2874), mas principalmente do menor número de loci polimórficos em cada população (10 para cepas KP1+ e somente 3 para cepas KP1-). A estrutura de uma população, a qual varia de acordo com a espécie estudada, provavelmente terá influ- ência no número de marcadores a serem utilizados para a resolução do problema, mas neste caso, tão poucos quanto três marcadores micross a- télites hipervariáveis foram suficientes para distinguir as populações KP1+ e KP1- (TR_Di-04, TR_Di-07, TR_Di-09).

O nível de subdivisão populacional foi estimado através do FST entre os pares populacionais, e representa a proporção de var iação en- contrada pela subdivisão entre duas populações pela comparação com o nível total de variação nas populações. O FST, fornece valores entre 0 (se não há subdivisões) e 1 (se houver uma subdivisão total). Na prática, va- lores extremos (0 ou 1) nunca são obtidos. Porter (1990) sugere um guia geral para interpretação do FST na natureza, onde FST < 0,2 indica subdi- visão populacional negligenciável, 0,2 < FST < 0,3 indica subdivisão moderada e valores de FST > 0,3 são indicativos de isolamento efetivo (pouco ou nenhum fluxo gênico). Entretanto, deve-se considerar que o FST não considera qualquer hipótese sobre o mecanismo de mutação ge- nética.

Estes dados confirmam não só que a classificação de acordo com o tipo de mini-círculo de kDNA é real, como também o isolamento de vetores observado na natureza, impedindo o f luxo gênico entre as cepas KP1+ e KP1- (STEINDEL; PINTO; TOMA et al., 1991; VALLEJO; GUHL; CARRANZA et al., 2007). Além disso, considerando a origem geográfica mais dispersa, as cepas do tipo KP1+ apresentam também uma diversidade gênica quase duas vezes maior (0,4718 ± 0,2652) do que as cepas KP1- (0,2572 ± 0,1981).

A AMOVA é uma análise hierárquica que descreve como a vari- ância molecular é dividida dentro de um conjunto de dados. Os níveis de hierarquia podem ser definidos dentro dos indivíduos dentro das popula- ções (para haplótipos), entre indivíduos dentro das populações, entre populações e entre grupos de populações. Neste estudo a AM OVA foi realizada em dois níveis: entre indivíduos dentro da população e entre as populações em si, e a maior variação ocorreu a nível intrapopulacional (69,72%) e não interpopulacional (30,38%). Esta observação ajuda a ex-

plicar a falta de resolução dentro dos ramos principais das árvores filo- genéticas (Figura I V.3 e I V.4). O FST global é calculado como a var iân- cia atribuída para diferenciar populações sobre o total de variação pr e- sente, e foi de 0,30380, sugerindo uma provável subdivisão populacio- nal (p<=0,05).

As probabilidades desta subdivisão foram avaliadas pelo progra- ma STRUCT URE através de 100.000 iterações do algor itmo da cadeia de Markov, considerando um modelo de ancestralidade mista (Admixtu- re Model) e de frequências alélicas correlacionadas. Como os marcado- res microssatélites são muito var iáveis, o programa calculou de duas a 20 populações (uma população diferente para cada cepa), entretanto, o signif icado biológico deste achado deve ser interpretado com cuidado. Considerando a provável subdivisão clássica em duas populações (KP1+ e KP1-), os valores de FST encontrados pelo programa para cada popula- ção foram de 0,2632 para a população de cepas KP1+ e de 0,4138 para as cepas KP1-. Utilizando os mesmos critérios discutidos anter iormente (PORTER, 1990), estes valores revelam uma clara subdivisão da popu- lação KP1- (FST >0,3). Estes dados são consistentes com o observado no agrupamento das amostras nas árvores filogenéticas, onde as cepas KP1- são agrupadas em dois ramos: as cepas isoladas na Colômbia e as cepas isoladas no Brasil (Figuras IV.2, IV.3 e IV.4). Na população KP1+ pa- rece existir algum grau subdivisão, mas em um nível mais sutil (0,2< FST>0,3).

Para as inferências f ilogenéticas foi escolhido o modelo stepwise mutation (SMM), pois em organismos com estrutura populacional clo- nal, como o T. rangeli, é pouco provável um aumento ou diminuição brusca no número de repetições de um microssatélite, já que estas ocor- reriam não por deslize da DNA polimerase, mas por outro processo c o- mo crossing-over desigual (JARNE; LAGODA, 1996). As análises filo- genéticas sugerem que a estrutura populacional do T. rangeli possa ser explicada em parte pela classificação baseada na presença ou ausência do mini-círculo tipo KP1. Entretanto, dois ramos altamente signif icati- vos foram observados entre as cepas KP1-: um agrupando as cepas bra- sileiras (PIT-10, SC-58, SC-61, SC-68, SC-74, SC-75 e SC-76) e outro as cepas colombianas (C23, 5048 e TRE), corroborando os resultados de uma possível subdivisão populacional entre as cepas KP1- evidenciada pelo FST discutido anteriormente.

Figura IV.2 – Rede de Wagner calculada por Máxima Parcimônia, através dos

programas do pacote Phylip, utilizando os genótipos obtidos com 18 marcad o- res microssatélites em 20 cepas de Trypanosoma rangeli. Considerando cada a- lelo microssatélite como um estado de um caráter multiestado, a distância gené- tica entre duas cepas quaisquer foi estimada como o número de passos mutacio- nais necessários para transformar uma em outra. Os valores entre parênteses in- dicam o número de vezes que um ramo foi observado em 1.000 bootstraps.

IV.4.2 Implicações da análise de SNP do estudo da estrutura popu-