Padronização da PCR e clonagem gênica 1 Gene do spliced leader

Para a amplificação do gene do spliced leader (SL) foram utiliza- dos dois pares de iniciadores previamente descritos na literatura. O pr i- meiro, ME-L e ME-R (FERNANDES; TEIXEIRA; STURM et al., 1997), é dirigido ao exon do gene SL, e o segundo, TR5S-L e TR5S-L (GRISARD; CAMPBELL; ROMANHA, 1999), ao gene da subunidade 5S do RNAr. Ambos os pares tem por objetivo a amplif icação de uma unidade completa do gene SL (de aproximadamente 900pb), já que o mesmo é organizado por repetições em tandem e os inic iadores apresen- tam uma região sobreposta. Havia uma preferência na utilização dos in i- ciadores TR5S a fim de se evitar que a região de interesse para análise de SNP, o exon, se localizasse nas extremidades da sequência, as quais tendem a ter qualidade inferior nos sequenciadores em geral.

Esta sobreposição entre os iniciadores de um mesmo par, apesar de garantir a amplificação do gene completo, apresentou-se como uma dificuldade para a padronização da PCR já que a tendência à formação de dímeros era muito forte. Para tentar contornar esta dificuldade, já que esquemas padrões de amplif icação não funcionaram, foram testadas vá- rias condições, inic ialmente com uma Taq DNA polimerase padrão (LGC Biotecnologia®): - diferentes concentrações de MgCl2 (1,5 e 3,5mM); - diferentes concentrações de KCl (25, 50 e 75mM); - diferentes faixas de pH (8,3, 8,8 e 9,2); - curva de iniciadores (1 a 10µM); - curva de dNTP (200 a 500µM); - curva de DNA (1 a 100ng/reação).

Dentre estas condições, a amplif icação do gene SL, com os inic i- adores ME-L e ME-R, foi alcançada com uma reação de 10µl contendo tampão em pH 8,8, 1,5mM de MgCl2, 25mM de KCl, 1µM de cada um

dos iniciadores, 200µM de dNTP, 50ng de DNA da cepa Choachí e 1U de Taq DNA polimerase (LGC Biotecnologia®). Foi utilizada a cicla- gem descrita no item III.3.1, que apresenta 5 ciclos iniciais com tempe- ratura de anelamento elevada (60ºC), justamente para favorecer a espe- cificidade de ligação dos iniciadores com a sequência alvo, minimizando a formação de dímeros (Figura III.3, canaletas 2 e 4).

Nos testes realizados, a concentração de KCl parece ser crítica na amplificação do gene SL já que outros tampões com diferentes faixas de pH e concentração de MgCl2 foram testados com sucesso, desde que

mantida a concentração de KCl em 25mM, a qual é 2x inferior à utiliza- da no tampão da enzima (dados não mostrados).

Vale ressaltar que em nenhuma das condições testadas, mesmo posteriormente, houve sucesso na amplif icação do gene SL utilizando os iniciadores TR5S, os quais foram descartados do presente estudo (Figu- ra III.3, canaletas 6,7,8 e 9).

Figura III.3 - Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo mostrando os

produtos de PCR obtidos com os iniciadores ME-L / ME-R (2 a 5) e TR5S-L / TR5S-R (6-9) obtidos com a cepa Choachí de Trypanosoma rangeli, com (3, 5, 7 e 9) e sem (2, 4, 6 e 8) a adição de uma polimerase de alta fidelidade. 1 – Pa- drão de Peso Molecular (PM = DNA de fago lambda clivado com HindIII e E-

coRI); 10 – Controle negativo.

A análise de SNP exige um máximo de cuidado na geração das sequências através da utilização de um material biológico bem caracteri- zado (descrito no capítulo I) e de polimerases de alta f idelidade. Estas polimerases apresentam atividade de conferência da base incorporada e atividade exonucleásica 3´→5´ (chamada de atividade proofreading), ausentes na maioria das polimerases empregadas comumente nos labora- tórios. Isso posto, as enzimas proofreading são capazes de reconhecer e corrigir erros advindos de pareamento incorreto das bases de DNA ou da própria atividade enzimática. Por causa disto apresentam alta especif ici- dade e taxas de erros muito infer iores às polimerases comuns: de 5x10-6 (polimerases de alta f idelidade) até 2,5x10-5 (polimerases sem atividade proofreading) (CHA; THI LLY, 1993).

Neste sentido, a fim de reduzir custos, foram testadas inicialmen- te misturas enzimáticas em diferentes proporções contendo DNA poli- merase com e sem atividade exonucleásica (4:1, 2:1 e 1:1). Entretanto, a adição, mesmo que de pequenas quantidades, de uma polimerase de alta fidelidade não permitiu a amplif icação do produto de tamanho esperado de aproximadamente 900pb (Figura III.3, canaletas 3 e 5).

Posteriormente, foram avaliados diferentes sistemas enzimáticos de alta f idelidade de acordo com as especificações do fabricante ( Plati- num Taq DNA Polymerase High Fidelity – Invitrogen®, Kapa HiFi DNA Polymerase - KAPABiosystems®, Real Hi DNA Polymerase - RBC®, Phusion High-Fidelity DNA Polymerase – Finnzymes/NEB®, HotStar HiFidelity - Qiagen®). Os resultados mais reprodutíveis, e que permiti- ram a amplif icação de todas as cepas propostas, foi o sistema HotStar HiFidelity® da Qiagen nas seguintes condições: reação de 25µl contendo tampão HiFi 1x (Tris-HCl pH 8,7, 300µM de dNTP ultrapuro, soro al- bumina bovina, Triton® X-100 e 1,5mM de MgSO4), 1µM de cada um

dos iniciadores, 50ng de DNA da cepa Choachí e 1U de HotStar HiFide- lity DNA polimerase (Qiagen®) em água livre de RNases, utilizando a ciclagem descrita no item III.3.1. A figura III.4 mostra os resultados ob- tidos após a purificação dos produtos de PCR com o kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification® (GE) para remoção de dímeros.

Este sistema, além de se mostrar eficaz e reprodutível na amplif icação do gene SL com os iniciadores ME, também permitiu a clonagem direta do produto de PCR no vetor pGEM-T easy, pois apresenta atividade terminal transferase. Além disso, com as sequências de várias cepas dis- poníveis, é possível o desenho de iniciadores mais específicos e com melhores e mais simples características de amplif icação.

Figura III.4 - Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo representativo

dos produtos de PCR obtidos com os iniciadores ME-L / ME-R e 50ng de DNA de diferentes cepas de Trypanosoma rangeli, obtidos com o sistema HotStar HiFidelity DNA polimerase® (Qiagen), após a purificação com o kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification® (GE) . PM – Padrão de Peso Molecular (PM = DNA de fago lambda clivado com HindIII e EcoRI); 1 – Cepa 1545; 2 – Cepa C23; 3 – Cepa TRE; 4 – Cepa 5048; 5 – Cepa Palma-2; 6 – Cepa D3493; 7 – Cepa H8GS; 8 – Cepa R1625; 09 – Cepa Choachí; 10 – Cepa Macias, 11 – Con- trole negativo.