Materiais e Métodos

I.3.1 Parasitos

As diferentes cepas de T. rangeli analisadas no presente estudo encontravam-se criopreservadas no Laboratório de Protozoologia (http://www.proto.ufsc.br) da Universidade Federal de Santa Catar ina. Seus hospedeiros e suas origens geográficas são apresentados na tabela I.1.

I.3.2 Descongelamento

Formas epimastigotas das cepas de T. rangeli foram descongela- das em banho-maria a 37ºC, prontamente transferidas em tubo contendo 3 ml de meio LIT (Liver Infusion Tryptose) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF - Cultilab ) e centrifugadas a 2.250 x g / 10 min. O sobrenadante foi descartado e ao sedimento de parasitos adicionados 3 ml de meio LIT. A viabilidade celular foi avaliada por microscopia antes e após a centrifugação. Todo o volume da cultura foi transferido para um tubo contendo ágar sangue e incubado a 27ºC por quatro dias. Após este período, a viabilidade celular e a morfologia foram novamente ava- liadas por microscopia.

As cepas de T. cruzi já eram rotineiramente mantidas no laborató- rio e não houve necessidade de descongelamento.

I.3.3 Manutenção das cepas

Após o descongelamento em meio ágar-sangue, formas epimasti- gotas dos parasitos foram cultivadas a 27°C com passagens semanais em meio definido suplementado com 10% SBF. Na sequência, tanto o T. rangeli quanto o T. cruzi foram cultivados em meio LIT através de pas- sagens semanais.

Tabela I.1- Cepas de Trypanosoma rangeli e de T. cruzi utilizadas no

presente estudo, seus hospedeiros originais, sua origem geográfica e sua classificação quanto à presença (+) ou ausência (-) de mini-círculos tipo KP1.

Espé cie Cepa Hospedeiro Origem KP1

T. rangeli

Choachí Rhodnius prolixus Colômbia + SC-58 Echimys dasythrix Brasil -

SC-58 clone 1 - - -

SC-58 clone 11 - - -

SC-61 Echimys dasythrix Brasil - SC-68 Panstrongylus m egistus Brasil - SC-75 Panstrongylus m egistus Brasil - SC-76 Panstrongylus m egistus Brasil - PIT -10 Panstrongylus m egistus Brasil -

T RE ND Colômbia -

C23 Aotus sp. Colômbia -

50481 _{Homo sapiens Colômbia -}

D3493 Rhodnius prolixus Colômbia + B450 Rhodnius brethesi Brasil +

H8GS Homo sapiens Honduras +

R1625 Homo sapiens El Salvador + Macias Homo sapiens Venezuela + San Agustín Homo sapiens Colômbia +

H9 Homo sapiens Honduras +

H14 Homo sapiens Honduras +

1545 Rhodnius colombiensis Colômbia + Palma-2 Rhodnius prolixus Venezuela +

T. cruzi

Y Homo sapiens Brasil NA

CL Triatoma infestans Brasil NA SC-28 Didelphis aurita Brasil NA NA – não se aplica

I.3.4 Infecção do hospedeiro invertebrado

Quinze a vinte ninfas de I V e/ou V estádios, e/ou adultos de bar- beiros das espécies Rhodnius domesticus e R. prolixus, de ambos os se- xos, foram inoculados pela via intracelômica com 103 parasitos (5 μ l) com cada uma das cepas de T. rangeli (Tabela I.1), utilizando uma se- ringa Hamilton de 50 μl com agulha gengival 30G curta (Becton & Dic- kinson). As espécies de barbeiros foram gentilmente cedidas pelo Dr. Carlos José de Carvalho Pinto do Laboratório de Transmissores de He- matozoários (MIP/CCB/UFSC) e pela Drª. Alessandra Aparecida Guar-

1 _{A cepa 5048 não estava disponível no laboratório, portanto, as análises referem -se}

ao DNA cedido pela Drª. Concepción Puerta do Laboratorio de Parasitología Molecular, da Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colômbia.

neri do Laboratório de Triatomíneos do Centro de Pesquisas René Ra- chou (FIOCRUZ).

Dois dias após a inoculação, os insetos foram alimentados em camundongos imobilizados até completo engurgitamento. Uma semana após a infecção a hemolinfa foi coletada (por secção de uma das patas medianas) e examinada para verif icar a infecção. Quinze dias após a i- noculação, as glândulas salivares de dois barbeiros foram gentilmente removidas com auxílio de uma pinça através da decapitação dos insetos e examinadas para ver ificar a presença de parasitos no inter ior da g lân- dula. Em caso negativo, novos insetos foram analisados em 20, 25 e 30 dias após a infecção.

I.3.5 Infecção do hospedeiro vertebrado

Foram utilizadas duas fêmeas pós-reprodução de camundongos Swiss (Mus musculus) por cepa estudada. Os camundongos foram infec- tados através da picada repetitiva dos barbeiros experimentalmente in- fectados durante repasto sanguíneo por 10 a 30 min. Para garantir que a via de infecção foi exclusivamente inoculativa, ou seja, através da saliva e não de fezes, os barbeiros e os camundongos estavam fisicamente se- parados por uma tela impermeável.

Os camundongos foram examinados diariamente por 20 a 30 dias através de secção caudal para análise da presença e do número de parasi- tos (parasitemia).

O presente projeto teve aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC (155/CEUA/2004) para a realização dos exper i- mentos com camundongos.

I.3.6 Reisolamento das cepas de T. rangeli

As cepas de T. rangeli submetidas à passagem cíclica foram rei- soladas a partir dos camundongos infectados conforme o descrito no i- tem I.3.5. O isolamento foi realizado através de hemocultura pela pun- ção retro-orbital asséptica dos camundongos previamente sedados com éter etílico. Aproximadamente 1 ml de sangue foi coletado em tubo pre- viamente preparado com 2 ml de LIT suplementado com 10% de SBF e 100U de PS (Penicilina-Estreptomicina). Os tubos foram incubados por até 30 dias a 27ºC e as amostras examinadas diariamente ao microscópio até ser detectada a presença de parasitos. Dos tubos positivos foram rea- lizadas passagens semanais em meio LIT conforme descrito no item I.3.3 para axenização e estabilização da cultura.

I.3.7 Curva de crescimento

Após o reisolamento das cepas estudadas por hemocultura, a cur- va de crescimento parasitár ia foi determinada para as condições de cul- tura axênica descritas no estudo. Para tanto, uma cultura de cada cepa

contendo 5x106 parasitos/ml foi preparada e a concentração parasitária foi diar iamente determinada através da contagem em câmara de Neu- bauer até decaimento da cultura.

Nos experimentos subsequentes foram utilizadas formas epimas- tigotas obtidas na fase exponenc ial de crescimento celular de cada cepa reisolada.

I.3.8 Extração de DNA

Foram utilizadas duas metodologias distintas para extração e pu- rificação de DNA. O método de Lise Hipotônica, o qual apresenta maior rendimento pois utiliza uma grande quantidade de material biológico i- nicial, foi utilizado para as cepas Choachí e SC-58. Estas cepas foram utilizadas em todos os experimentos de padronização necessitando, por- tanto uma quantidade maior de material inicial. O método de fenol- clorofórmio foi utilizado para extração e purificação de DNA das de- mais cepas utilizadas no estudo por se tratar de um método mais rápido que o primeiro e não necessitar de um excesso de material biológico in i- cial.

- Método da Lise Hipotônica

Uma quantidade de 5x1010 formas epimastigotas das cepas Choa- chí e SC-58 foram centrifugados a 8.000 x g por 15 min a 4ºC. O sobre- nadante foi descartado e o sedimento lavado uma vez com PBS estér il pH 7,4 e novamente centrifugado a 8.000 x g por 15 min a 4ºC. O so- brenadante foi descartado e o sedimento homogeneizado, sob forte agi- tação, em quatro a cinco volumes de tampão de lise hipotônico (Tris - HCl 10mM, MgCl2.6H2O 10mM, NaCl 10mM, β-mercaptoetanol

5mM), sendo incubado por dois minutos em banho de gelo. Uma alíquo- ta foi retirada e observada ao microscópio para constatação da forma ar- redondada dos parasitos. As células foram então lisadas com TRITON X-100, a uma concentração final de 1%, por dois a três minutos através de forte agitação em agitador orbital. A lise foi acompanhada ao micros- cópio e quando 80% dos parasitos estavam lisados, a reação foi inter- rompida imediatamente pela adição de sacarose a uma concentração fi- nal de 0,25M. Nova alíquota foi observada ao microscópio para confir- mar a interrupção da lise. A amostra foi centrifugada a 2.100 x g por 15 min a 4ºC e o sobrenadante descartado. A seguir, o sedimento foi homo- geneizado com uma pipeta em aproximadamente cinco volumes de tam- pão de lise de núc leo (Tris-HCl 10mM, EDT A 10mM, NaCl 100mM, SDS 0,2%, Proteinase K 100mg/ml) e incubado a 56°C por 12h. À a- mostra foi adicionado um volume de fenol saturado, homogeneizada por inversão durante cinco minutos e centrifugada a 9.000 x g por 5 min à temperatura ambiente. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e

adicionada de um volume de fenol/clorofórmio (1:1), novamente homo- geneizada por inversão durante cinco minutos e centrifugada a 9.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. A extração com fenol/clorofórmio foi repetida até que a interface estivesse límpida. Finalmente foi adicio- nado à fase aquosa um volume de clorofórmio/álcool isoamílico (25:1), homogeneizada por inversão durante 5 min e centrifugada a 9.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. A fase aquosa foi dialisada em 1.000 volumes de TE a 4°C. A solução de diálise foi trocada até comple- ta remoção do fenol. A amostra foi transferida para um novo tubo e ar- mazenada a 4ºC.

- Método do Fenol-Clorofórmio

A extração do DNA das demais cepas foi realizada a partir de amostras do parasito em fase exponencial de crescimento utilizando-se o método fenol-clorofórmio de acordo com protocolo padrão (SAMBRO- OK; RUSSEL, 2001) após tratamento prévio das células com proteinase K (20 µg/ml) a 56°C por 12h. A concentração do DNA foi realizada por precipitação com isopropanol a 70%. Após lavagem do precipitado com etanol 70% e secagem a 37ºC por 30 min, o mesmo foi hidratado em 50 μl de água ultrapura autoclavada e eluído à temperatura ambiente por 12h. Após extração, as amostras foram tratadas com 200 μg/ml de RNa- se A a 37ºC por 1h.

I.3.9 Dosagem de DNA

As amostras de DNA obtidas por ambas as metodologias foram dosadas e avaliadas quanto à pureza através de espectrofotometria em equipamento BioPhotometer® (Eppendorf, Hamburg) através da absor- bância a 260 e 280nm, e das relações 260/280nm e 260/230nm. Além disso, as amostras extraídas foram resolvidas em gel de agarose 1% para verificação da integridade do DNA e da presença de contaminação com RNA. Para tanto, cada amostra foi diluída em igual volume de tampão 2X (azul de bromofenol 0,25%; xilenocianol 0,25% e 30% glicerol) e submetidos à eletroforese (aproximadamente 1h a 10V/cm de gel) em tampão TBE 1X (Tris HCL 89mM, ácido bórico 89mM, EDT A 2mM, pH 8,0). A visualização das amostras foi realizada com o auxílio do transiluminador MacroVue UV 20® ( Hoefer Pharmacia Biotech, San Francisco) após coloração do gel em solução de brometo de etídio (1 μ- g/ml). Os resultados foram fotodocumentados em um equipamento Di- giDocIt® (UVP).

I.3.10 Caracterização molecular das cepas de T. rangeli

A presença dos diferentes tipos de mini-círculos de kDNA carac- terísticos de T. rangeli foi avaliada nas cepas estudadas através da am- plificação via PCR. Para tanto, foi utilizada uma PCR com os inic iado-

res senso S-35 (5´ AAA TAA TGT ACG GGT GAG ATG CAT GA 3´) e antissenso S-36 (5´ GGG TTC GAT TGG GGT TGG TGT 3´) (STURM; DEGRAVE; MOREL et al., 1989) e senso KP1-L (5´ ATA CAA CAC TCT CT A TAT CAG G 3´) (VALLEJO; MACEDO; CHI- ARI et al., 1994).

A amplif icação foi realizada em um volume f inal de 10 μl contendo 10mM de Tris-HCl pH 8,5, 50mM de KCl, 1,5mM de MgCl2, 200μM de

dNTP, 10μM de cada inic iador, 1ng/μl de DNA e 1U de Taq DNA po- limerase (LGC Biotecnologia). A reação foi realizada em um termoc i- clador Mastercycler Gradient (Eppendorf) com o seguinte protocolo: desnaturação inic ial de 95ºC/5 min, 35 ciclos de amplificação nas se- guintes condições : 95ºC/1 min, 60ºC/1 min e 72ºC/1 min e extensão f i- nal a 72ºC/5 min. Os produtos foram resolvidos por eletroforese em gel de agarose 1,5%, conforme descrito no item 1.3.9.

I.3.11 Congelamento

Todas as cepas submetidas à passagens cíclicas foram nova- mente criopreservadas. Os parasitos, na fase exponencial de crescimen- to, foram criopreservados em meio LIT suplementado com 20% de SBF e 10% de DMSO. Os criotubos permaneceram em freezer –80ºC por 24h e em seguida foram transferidos para container de nitrogênio líquido pa- ra armazenamento permanente.