Localização citoquímica da urease mediante Microscopia Ótica e Eletrônica de

Na figura 49 se apresentam células isoladas de fotobiontes procedentes de talos de

C. verticillaris que foram previamente incubadas durante 4 horas em ureia 40 mM e no 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0 5 10 15 20 25 µ mo ls amo n ia/ mg p ro te ín a/ mi n Tempo (horas) ATIVIDADE UREASE LUZ

Talo ureia Talo controle Meio com ureia Meio controle 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 5 10 15 20 25 µmols am on ia/m g pr ote ína/m in Tempo (horas) FENÓIS LUZ Talo Meio de incubação

Talitha Lucena de Vasconcelos

escuro. As micrografias A, C e E correspondem a células lavadas superficialmente com acetona antes de realizar a reação citoquímica, para evitar a presença de fenóis fúngicos incrustatos sobre a superfície da parede celular da alga, como muitas vezes acontece em isolamentos celulares em meio aquoso (AHMADJIAN, 1993; VICENTE et al., 1987). As micrografias B, D e F correspondem a células não lavadas com acetona. A figura 49A mostra um controle de incubação histoquímica de células lavadas com acetona e incubadas em ausência de ureia e cloreto de cobalto, enquanto que na figura 49B se observam as células lavadas com o solvente orgânico e incubadas exclusivamente em tampão.

Tanto em A como em B se observam as paredes celulares perfeitamente translúcidas e a célula ocupada por um grande cloroplasto (setas verdes). As setas vermelhas indicariam a presença de cloreto de cobalto solúvel ou, alternativamente, como carbonato insolúvel, que não reagiu com o ânion sulfúrico já que este, durante 1 minuto de contato com as células, não chegariam a atravessar a grossa parede celular. A figura 49C apresenta um novo controle de clorobiontes lavados com acetona e incubados em tampão com cloreto de cobalto em ausência de ureia. A figura 49D mostra o mesmo controle sem lavar previamente as células com o solvente orgânico. Estes controles revelariam se o cobalto pode se unir a componentes celulares em ausência do produto da hidrólise da ureia. Tanto em C como em D aparece um ligeiro depósito negro na parede celular (setas vermelhas) e algumas células plasmolizadas (setas azuis).

Por último, na figura figura 49E (células lavadas com acetona antes da reação citoquímica) e F (clorobiontes não lavados com acetona) se apresentam células as quais devem ter realizado a sequência completa se é que essas células continham urease induzida. O depósito negro se intensifica nas fotografias 49E e 49F, o que indica que foi na parede celular onde se formou o CO2 que houve reação com o cobalto. Idênticos resultados foram obtidos com células isoladas procedentes de talos incubados em tampão TPNa+ durante 4 h no escuro (figura 50) talvez, mostrando estas últimas uma menor densidade de depósito negro em suas paredes.

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Figura 49 - Micrografias obtidas a partir de Microscopia Ótica de clorobiontes isolados procedentes de talos de C. verticillaris incubados em escuro por 4 h em ureia a 40mM.

Legenda:A- controle de incubação histoquímica de células lavadas com acetona e incubadas em ausência de ureia e cloreto de cobalto; B- células lavadas com o solvente orgânico e incubadas exclusivamente em tampão; C- controle de clorobiontes lavados com acetona e incubados em tampão com cloreto de cobalto em ausência de ureia; D- controle de clorobiontes não lavados com acetona e incubados em tampão com cloreto de cobalto em ausência de ureia; E- clorobiontes submetidos à reação completa e lavados com acetona; F- clorobiontes submetidos à reação completa e não lavados com acetona. Escala: 20µm.

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Figura 50 - Micrografias obtidas a partir de Microscopia Ótica de clorobiontes isolados procedentes de talos de C. verticillaris incubados em escuro por 4 h em TPNa+.

Legenda: A- controle de incubação histoquímica de células lavadas com acetona e incubadas em ausência de ureia e cloreto de cobalto; B- células lavadas com o solvente orgânico e incubadas exclusivamente em tampão; C- controle de clorobiontes lavados com acetona e incubados em tampão com cloreto de cobalto em ausência de ureia; D- controle de clorobiontes não lavados com acetona e incubados em tampão com cloreto de cobalto em ausência de ureia; E- clorobiontes submetidos à reação completa e lavados com acetona; F- clorobiontes submetidos reação completa e não lavados com acetona. Escala: 20µm.

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A localização de urease nas paredes celulares do clorobionte foi confirmada mediante microscopia eletrônica de transmissão. Na figura 51A é mostrada uma célula controle (não incubada em ureia e cloreto de cobalto), em que é perfeitamente distinguível uma parede celular transparente dos elétrons (CW), do citoplasma (CP) restrito a uma estreita franja polar, contendo abundantes vesículas de armazenamento (VA) e um pirenoide (PY) bem definido. Nas células que sofreram reação histoquímica para urease (figura 51B), a estrutura celular não sofreu modificações salvo os densos depósitos negros localizados na parede celular, devido a depósitos de CoS (setas vermelhas na figura 51).

Figura 51 - localização de urease nas paredes celulares do clorobionte isolado de C. verticillaris através de microscopia eletrônica de transmissão.

Legenda:A- célula controle não incubada em ureia e cloreto de cobalto; B- célula incubada em ureia e cloreto de cobalto.

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O município de Mamanguape na Paraíba, local de ocorrência do líquen C.

verticillaris, tem seu território localizado numa unidade de paisagem conhecida como

Tabuleiros Costeiros, caracterizada por suaves ondulações e constituída de mantos residuais da Formação Barreiras. Esta unidade constitui-se de uma cobertura sedimentar terrígena continental e marinha (ARAI, 2006), de idade miocênica a pleistocênica inferior (SUGUIO et al., 1999; VILAS BOAS et al., 2001). Pode ser encontrado repousando sobre depósitos marinhos cretácicos do Reconcavo Baiano (VILAS BOAS, 1996), como também em Sergipe, Alagoas, Pernambuco, Paraíba e Rio Grade do Norte. Também são encontrados sobre o embasamento cristalino pré-crambiano no Espírito Santo, na Bahia e no Ceará, e sobre ou interdigitado com calcários terciários em Pernambuco, Paraíba, Pará e Maranhão (SUGUIO et al., 1999; LIMA, 2002).

Os sedimentos da Formação Barreiras se constituem na última rocha sedimentar terciária Nordeste do Brasil formada na história da abertura do atlântico, representada pela sequência sedimentar ao longo de mais de 4.000 km do litoral (BEZERRA, 2001). É composto por uma sequência de sedimentos dentríticos, siliciclásticos, (ARAI, 2006), pouco ou não consolidados, mal selecionados, de cores variadas (VILAS BOAS, 1996; VILAS BOAS et al., 2001), variando de areias finas a grossas, predominando grãos angulosos, com matriz caulinítica e ocorrência escassa de estruturas sedimentares (MABESSONE et al., 1972; BIGARELA, 1975; LIMA, 2002).

O líquen C. verticillaris tem grande afinidade com solos arenosos, por isso é frequentemente encontrado nos tabuleiros costeiros do Nordeste do Brasil (AHTI et al. 1993), como no caso de Mamanguape. Na área de predomínio do líquen ocorrem Neossolos quartzarênicos, apresentando textura areia ou areia franca ao longo de pelo menos 2 m de profundidade (EMBRAPA, 2006). Esses solos são constituídos essencialmente de grãos de quartzo, sendo, praticamente destituídos de minerais primários pouco resistentes ao intemperismo. Tais minerais entram em contato com os verticilos de C. verticillaris, que sustentam o talo da ação do vento sobre estes solos.

O contato de ácidos liquênicos com a superfície de rochas e minerais de solos tem sido mencionado na literatura como um acontecimento importante na sucessão ecológica em ecossistemas. BJELLAND et al. (2002) afirmam que a interface do líquen com o

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substrato é um lugar de grande atividade química, onde os liquens participam com a produção de ácidos e metais complexantes de compostos direta, ou indiretamente como resultado de processos biogênicos. Os ácidos orgânicos destes organismos podem acelerar a dissolução de minerais e rochas a partir do ataque de um próton mineral (PIERVITTORI et al., 1996, 1998; ADAMO et al., 2000; CHEN et al. 2000).

Sendo assim, a presença de minerais do substrato de origem, sobre o talo de C.

verticillaris, pode ser explicada pela capacidade que têm estes organismos de reter

minerais na sua superfície, podendo até promover o processo de quelação (VASCONCELOS, 2007; BARBOSA, 2009).Como o solo de Mamanguape é rico em silício, proveniente do quartzo, mineral que compõe o Neossolo da região (EMBRAPA, 2006), foi possível encontrar cristais deste elemento químico aderidos aos verticilos do talo (figura 27). Foram constatados também outros minerais silicatados que formam parte dos Luvissolos que aparecem nas áreas com maior teor de argilas, como é o caso do feldspato e da wollastonita (figura 27) (EMBRAPA, 2006).

Além de terem sido detectados cristais de minerais de solo em talos de C.

verticillaris, puderam ser visualizados, através de microscopia eletrônica de varredura,

outros elementos, como a alga que forma a simbiose da espécie (figuras 25D, 26B e 26D) e um exemplar de diatomácea, provavelmente da espécie Actinoptychus vulgaris (figura 26C). Comprovou-se que C. verticillaris é composta por um fotobionte clorofícea unicelular (MARCELLI, 2006). As algas de C. verticillaris encontram-se entrelaçadas ao fungo por uma malha de hifas bem compactadas, e em um processo de isolamento do clorobionte do seu parceiro fungo, o talo foi submetido repetidas vezes a soluções de sacarose e tampão fosfato de potássio para obtenção de uma interfase de algas livres de hifas (descrito no item 3.7.2) (FONTANIELLA et al., 2000 com modificações).

Na figura 26C também se aprecia a presença de uma diatomácea sobre o talo de

C. verticillaris. As diatomáceas são organismos cosmopolitas que habitam ambientes

marinhos e continentais sejam de água doce ou salobra, onde podem formar densos lençóis flutuantes (COOPER, 1999) e, também ambientes terrestres (ROUND, 1983).Estes organismos podem ser planctônicos, não possuindo movimentos próprios

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suficientemente fortes para vencer as correntes na massa de água onde vivem (OMORI et al., 1984).

A presença de diatomáceas em solos de Tabuleiros Costeiros, provavelmente está relacionada à origem dos sedimentos. A costa brasileira é formada por depósitos sedimentares acumulados ao longo do Quaternário, período em que os litorais leste e nordeste do Brasil estiveram submersos até cerca de 5.100 A.P., seguido de emersão até os dias atuais (COUTINHO, 2000). Levantamentos e reconstruções de antigas posições do nível relativo do mar no tempo e no espaço possibilitaram o amplo conhecimento do nível marinho, a partir de mais de 800 datações por radiocarbono (MARTIN et al., 1979).

As transgressões marinhas durante o Quaternário são descritas em três fases por COUTINHO (2000). A primeira fase ocorreu em torno de 120.000 anos no Pleistoceno, quando um máximo de transgressão marinha retrabalhou os sedimentos da Formação Barreiras formando falésias ao longo de toda a costa nordestina. Posteriormente houve deposição de leques aluviais no sopé das falésias, ao mesmo tempo em que há a descida progressiva do nível do mar.

A segunda fase caracterizada pela penúltima transgressão (120.000 anos) teve o nível do mar variando 8±2 m em relação ao atual. Os leques são seccionados pelo avanço das águas que inundam os vales incisos na Formação Barreiras, gerando estuários e lagunas. Com a descida do nível do mar foram depositados Terraços Marinhos do Pleistoceno ao longo de toda a costa.

Na terceira fase o nível do mar permaneceu abaixo do atual entre 120.000 e 7.000 anos A.P., quando inicia a Última Transgressão em torno de 7.000 anos A.P. (BITTENCOURT et. al., 1979). Com a subida das águas ocorreu a erosão dos terraços, atingindo o ápice em torno de 5.100 A.P., quando o nível do mar ficou entre 4 e 5 metros acima do atual. Houve o aparecimento de sistemas de ilhas barreiras, gerando lagunas, mas com a descida do nível do mar estas foram se tornando terras úmidas, formando os Terraços Marinhos Holocênicos.

Portanto, pode-se afirmar que, estas variações do nível do mar, ao longo do Quaternário favoreceram o contato da fauna e flora marinha com um ambiente emerso

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litorâneo, local onde se depositaram após o abaixamento do nível do mar. O exemplar de diatomácea encontrado aderido às hifas de C. verticillaris, visto em um corte transversal do talo por Microscopia Eletrônica de Varredura, apresenta-se como uma comprovação das variações do nível do mar no NE, já que este organismo tem origem marinha.

Souza et al. (2007) estudaram a diatomoflórula identificada em sedimentos do Quaternário da Lagoa das Diatomáceas (Dois Irmãos, Recife) e, identificaram sete que são consideradas de ambiente marinho. Segundo Moreno et al. (1996) a presença de diatomáceas em registros fósseis deve-se à natureza resistente de sua parede celular que é composta de sílica, facilitando a formação de depósitos silicosos denominados diatomitos. Assim, a diatomácea observada na micrografia possivelmente, permaneceu bem preservada e misturada ao Neossolo da área de ocorrência do líquen até ser aderida ao talo.

Como observado, os Tabuleiros Costeiros de Mamanguape-PB, desde a sua formação, apresentam-se como um local de grande dinamicidade, comprovada pelas diferentes conformações pelos quais a Formação Barreiras (rocha sedimentar) passou e, pela retração e expansão da Mata Atlântica durante o Quaternário. As alterações continuaram ao longo do tempo, mas não mais com a intensidade observada, seja de ordem climática ou geológica. O homem se tornou o principal agente transformador dos ecossistemas, quando passou a explorar os recursos naturais, retirando a floresta em detrimento do crescimento das cidades.

Andrade et al. (2011) trazem algumas reflexões sobre a degradação ambiental dos ecossistemas. Os autores reconheceram dois períodos na evolução humana, o Holoceno, onde o ser humanotestemunhou grande parte da trajetória da sua civilização, onde em que o homem passou de caçador, coletor e nômade para estágios de intervenções cada vez mais agressivas ao meio ambiente; e o Antropogênico, quando a estabilidade característica do Holoceno deixou de ser o traço marcante em lugar da centralidade das intervenções antrópicas nos desequilíbrios dos sistemas naturais terrestres e da ameaça à resiliência do ecossistema global.

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Estudos têm demonstrado que as alterações sofridas pelos ecossistemas terrestres não são comparáveis a nenhum outro período da história humana e, mesmo que essas mudanças tenham contribuído enormemente para ganhos líquidos no desenvolvimento e crescimento econômico, os ganhos foram alcançados a expensas de custos crescentes na forma de degradação de serviços ecossistêmicos (MEA, 2005). A ONU (2010) alertou que a destruição de ecossistemas da Terra deve começar a afetar economias de vários países nos próximos anos e que os ecossistemas podem estar próximos de sofrer mudanças irreversíveis, tornando-se cada vez menos úteis à humanidade. Entre estas mudanças estariam o desaparecimento rápido de florestas, a proliferação de algas em rios e a morte generalizada de corais.

Mesmo diante deste cenário futuro de perdas, os esforços para recuperação de áreas degradadas e conservação da biodiversidade no Brasil são intensos. A principal estratégia para a conservação da biodiversidade é a criação de Unidades de Conservação (RYLANDS et al., 2005). Aliado ao compromisso firmado na Convenção da Diversidade Biológica-CDB de conservar a biodiversidade, a educação ambiental deve ser utilizada como ferramenta complementar.

No entanto, as áreas protegidas sofrem ações antrópicas negativas, como a caça e o fogo gerado pelas queimadas em áreas agrícolas vizinhas (GRIFFITH, 2000; MEDEIROS, 2004), além da pressão pelo aumento da densidade demográfica e o consequente crescimento das cidades e, a poluição dos solos e das águas pelos fertilizantes agrícolas. No caso deste, é exemplo a elevada produção de cana-de-açúcar do país que de acordo com a CONAB (2011) obteve na safra de 2010, 624,99 milhões de toneladas.

Esta eficiência é resultado de altas doses de fertilizantes nitrogenados usados na produção de cana-de-açúcar. Segundo Vitii et al. (2007) a ureia é a fonte nitrogenada mais utilizada na agricultura brasileira, em razão do seu menor custo em relação aos demais fertilizantes nitrogenados sólidos. Já Megda et al. (2012) estudaram a eficiência agronômica de fertilizantes nitrogenados na produção de cana-de-açúcar. Concluíram que a fonte alternativa, cloreto de amônio, resulta em produtividade de soqueira de cana-de- açúcar compatível com os adubos nitrogenados comerciais ureia, nitrato e sulfato de amônio.

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Tendo em vista que C. verticillaris é uma espécie de líquen que habita os solos arenosos de Tabuleiros Costeiros e, que neste ambiente predominam fragmentos de Floresta Atlântica intercalada por áreas com vegetação de Cerrado, devido à presença de uma morfologia sedimentar que impõe à vegetação um caráter edáfico, cercados por plantações de cana-de-açúcar que utilizam sobremaneira fertilizantes nitrogenados, observou-se a relação deste líquen com o seu substrato e o nitrogênio disponível no ambiente.

Foi demonstrada a capacidade de percolação de fenóis de C. verticillaris em até 5 cm de profundidade em solo arenoso seco ou com 100% da capacidade de campo atingida (Item 4.2.2). Provavelmente, quando o talo do líquen é lavado pela água da chuva os fenóis acumulados na superfície cortical são lixiviados para o substrato, podendo percorrer o perfil do solo e, até interagir com íons minerais do solo (LEGAZ et al., 2006). Num período mais seco, estes fenóis podem ser liberados para o ambiente, mas em menor quantidade, pois dependem de umidade para serem solubilizados e tornarem-se disponíveis.

A maior disponibilidade de PRO no solo pode estar relacionada com a quantidade de chuvas da região. Sabe-se que a precipitação média anual do município de Mamanguape é de 1.634,2 mm, com chuvas concentradas entre o abril e julho (CPRM, 2005). Além disso, a chuva distribui-se por todo ano, apresentando poucos meses secos. Portanto, a região caracteriza-se por ser muito úmida, o que está de acordo com a localização geográfica do município, que dista poucos quilômetros do litoral. O desaparecimento do FUM está relacionado diretamente com o aumento do PRO e com a disponibilidade de água no solo (figuras 30 e 31).

A literatura refere que o metabolismo do FUM requer uma molécula de H2O adicionada à cadeia lateral do PRO (PEREIRA et al., 1999). Portanto, quando disponível em um solo com muita água, o FUM sofre hidrólise espontânea da ligação éster, liberando a molécula de H2O e, disponibilizando mais PRO ao ambiente em detrimento do FUM. Isto pode ser comprovado quando se observam os dados da figura 30. À medida que a disponibilidade de água aumenta no solo, a quantidade de PRO se eleva, atingindo um pico máximo na fração 4, momento em o FUM passa a não ser mais detectado nas

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frações subsequentes. Na figura 31 pôde-se visualizar o mesmo fenômeno, mas com uma peculiaridade. Desde a primeira fração quantificou-se alta quantidade de PRO e nenhuma de FUM, o que sugere que o FUM inserido foi completamente retido no solo podendo, parte dele, ter sofrido hidrólise, aumentando a disponibilidade de PRO que foi detectado em menor quantidade ao passar do tempo.

Uma análise da transformação do FUM em PRO foi feita a partir de uma solução padrão contendo ATR e FUM e constatou-se que à medida que se realizavam diluições da solução em água, para análise por CLAE, os picos de ATR e FUM diminuíam e um novo pico aparecia, correspondendo ao PRO. Portanto, foi constatado que espontaneamente, em meio aquoso, o FUM se transforma em PRO (figura 32).

Em um ecossistema participam da ciclagem natural de nutrientes inúmeros elementos químicos, responsáveis pelo funcionamento dos organismos vivos e participantes das reações químicas inorgânicas (POGGIANI et al. 2000). O equilíbrio das comunidades habitantes de um ecossistema depende diretamente dos nutrientes reciclados nele e, são influenciados por fatores externos, como a poluição, a disponibilidade hídrica, a introdução de espécies exóticas etc. (PRITCHTETT, 1987).

Portanto, pode-se afirmar que C. verticillaris, líquen presente em ecossistemas de Tabuleiros Costeiros, participa da ciclagem de nutrientes, tanto pela liberação de suas substâncias, como por absorver substâncias do meio ambiente. De acordo com Honda et al. (1998) e Honda (2006) os liquens produzem metabólitos primários, produtos intracelulares ligados à parede celular e ao protoplasto tais como os carboidratos, caratenóides, aminoácidos livres e vitaminas, que ocorrem tanto em liquens quanto em fungos e algas de vida livre; e secundários, produtos extracelulares localizados na medula ou no córtex e, raramente em ambas as camadas.

É conhecido que as substâncias liquênicas possuem várias funções e atividades (MITROVIĆ et al., 2011) como antibiótica (DUARTE, 2002; MOURA, 2006), antitumoral (SANTOS, 2003; SIMONETTI, 2004), expectorante (LIMA, 2007), antiinflamatória (OLIVEIRA, 2003), alelopática (SILVA, 2007; TIGRE et al., 2012), agrícola (LEGAZ et al.

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2006), demonstrando que estas possuem lugar de importância dentro dos mecanismos de funcionamento nos ecossistemas.

Estudos demonstraram que liquens podem exercer uma influência negativa em plantas superiores através de efeitos indiretos mediados por mudanças na atividade metabólica de microrganismos e micorrizas do solo (FISHER, 1979). Legaz et al. (2006) relatam a existência de estudos que utilizam fenóis liquênicos como herbicidas. Tais fenóis podiam entrar no fluido xilemático, alcançando as folhas do hospedeiro e levando à desfoliação em maior ou menor extensão.

Por outro lado, Silva (2007) observou que Genipa americana (genipapo) teve seu

crescimento incrementado quando em contato com um solo onde ocorria Cladonia

salzmannii e fungos micorrízicos arbusculares, em relação a um solo apenas com

micorrizas ou ao controle. Plantas que tinham apenas liquens sobre o solo apresentaram maior desenvolvimento que o controle e, o solo teve suas características modificadas mostrando um aumento do pH e dos teores de Ca2+, Mg2+, e Na+. O Al3+ do solo decresceu