Retenção de PRO e FUM em função do grau de hidratação do solo

As frações obtidas nos experimentos também foram analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para quantificação dos ácidos PRO e FUM. A análise dos gráficos permitiu concluir que o FUM foi retido no solo e detectado em apenas 3 frações quando em solo hidratado (figura 30) e, em nenhuma quando em solo seco (figura 31). O PRO foi detectado em todas as frações, diminuindo seu teor a partir da terceira fração em solo seco e da quarta fração em solo hidratado.

Em solo hidratado (figura 30) o FUM foi detectado nas frações 1, 2 e 3, entrando em queda a partir da fração 4 e, não aparecendo mais em nenhuma outra. A quantidade total de FUM recuperado foi de 53 µg. O PRO apareceu em baixos teores nas frações 1 e 2, quando inicia uma ascensão detectada pela alta concentração das frações 3 e 4. A partir deste ponto houve uma diminuição das quantidades de PRO medidos com tendência a zero.

Figura 30 Quantificação de PRO e FUM totais obtidos a partir de solução do solo contendo extrato aquoso de C. verticillaris adicionado a um solo hidratado.

Quando o FUM apresenta uma queda na concentração das frações, ao mesmo tempo o PRO inicia uma rápida ascensão. Observou-se que apenas 10,75% do FUM adicionado ao solo hidratado foi recuperado nas frações iniciais, não aparecendo em nenhuma outra. Ou seja, os 89,25% da quantidade de FUM adicionado, possivelmente ficou retido no solo, ou foi transformado a partir de reações na solução do solo.

0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 6 7 u g t o tales nº da fração

EXPERIMENTO SOLO HIDRATADO (100%CC) (HPLC)

ac. protocetrárico ac. fumarprotocetrárico

Talitha Lucena de Vasconcelos

Detectou-se ainda, que a partir do ponto em que não se detecta mais traços de FUM (da fração 4 em diante) o PRO já acumulou, nas primeiras 4 frações, uma quantidade de 289,3 µg, valor acima do depositado ao solo no início do experimento (257 µg), ou seja, já apresentava um excedente de 32,3 µg. Esse fato sugere que o PRO detectado nas frações 4 a 7 tem origem diferente do inicial adicionado, podendo ser pela transformação do FUM depositado no solo que quando em contato com água sofreu hidrólise liberando moléculas de PRO.

Em experimento com solo seco (figura 31) o FUM não foi detectado em nenhuma das frações, indicando que ele pode ter ficado retido no solo, ou até participado da formação de PRO, como mencionado. O PRO foi recuperado em todas as frações, principalmente nas primeiras (1,2,3), apresentando uma queda a partir da fração 3, chegando à 10ª fração com teores muito baixos. A quantidade total de PRO recuperado foi de 531 µg, ao mesmo tempo foi detectada uma quantidade excedente de PRO de 46, µg em relação ao adicionado inicialmente (485 µg). Neste caso pode-se sugerir que, mesmo em solo inicialmente seco, o FUM foi nele aprisionado, demonstrando uma capacidade de transformação para o PRO pela hidrólise da ligação éster. O FUM não transformado provavelmente ficou inativo no solo.

Figura 31 - Quantificação de PRO e FUM totais obtidos a partir de solução do solo contendo extrato aquoso de C. verticillaris adicionado a um solo seco.

0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 u g to tal e s nº de fracción

EXPERIMENTO SOLO SECO (HPLC)

ac. protocetrárico

Talitha Lucena de Vasconcelos

A análise de relação de massa total (µmol) dos ácidos PRO e FUM é apresentada na tabela 2. Nos dois experimentos, com solo hidratado ou seco, foram recuperadas quantidades superiores de PRO em relação à inicialmente adicionada. Em solo hidratado houve maior transformação de FUM em PRO, 73%, sugerindo que em meio aquoso, com maior oferta de água, a hidrólise é intensificada. Uma porcentagem de 27% de FUM não foi transformada, podendo ter sido fixada ao solo ou participado de reações com outras substâncias ou íons do solo. Em solo seco apenas 10,7% do FUM foram transformados em PRO, contra 89,3% que permaneceram no solo.

Tabela 2 - Relação entre os ácidos PRO e FUM adicionados e recuperados do solo: massa e porcentagem de transformação.

Com o objetivo de confirmar a possibilidade de transformação de FUM em PRO, foi preparada uma solução aquosa padrão contendo 0,42 mg/mL (0,89 µmol/mL) de FUM e 0,41 mg/mL (1,09 µmol/mL) de atranorina (ATR), fenóis obtidos a partir de talos de C.

rangiferina. A mistura foi separada e analisada mediante CLAE, obtendo-se dois picos

majoritários, o primeiro deles com um tempo de retenção (tR) de 9,5 min, correspondendo ao FUM e o segundo, que eluía a 18,43 min, correspondendo a ATR (figura 32A). A partir da solução original de FUM e ATR, fizeram-se diluições (1:2) (figura 32B), 1:4 (figura 32C) e 1:8 (figura 32D).A área do pico correspondente a ATR diminuiu na mesma proporção que o grau de diluição, ajustando-se a uma reta cujo coeficiente (r2) foi de 0,96.

y = -321,65 + 8841,68x, onde,

y = contas de área de ATR e x = mg/mL de ATR.

Solo hidratado 100% CC Solo seco ác. PRO (A) ác. FUM (B) ác. PRO (A) ác. FUM (B) (1) µ mols adicionados 0,68 1,04 1,29 1,21 (2) µ mols recuperados 1,36 0,11 1,42 0 (3) Diferença* (1-2) -0,68 0,93 -0,13 1,21

% PRO que procede de FUM transformado (3A/3B)·100

73 10,7

Talitha Lucena de Vasconcelos

A área do pico correspondente a FUM diminuiu também de forma proporcional ao grau de diluição aplicado, ajustando-se a uma reta com coeficiente (r2) de 0,99.

y = -191,335 + 8793,15x, onde,

y = contas de área de FUM e x = mg/mL de FUM.

No entanto, à medida que aumentava o grau de diluição e, portanto, diminuía a concentração de FUM e ATR, aparecia um pico novo de tR = 7,73 min que correspondia ao PRO (figura 32 B, C e D). O incremento da área do pico correspondente ao PRO, que se ajustava a uma reta com coeficiente (r2) de 0,99.

y = 53,75 + 15937,50x, onde,

Talitha Lucena de Vasconcelos

Figura 32 - Cromatogramas obtidos a partir da análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-CLAE de extrato orgânico de talos de Cladonia rangiferina, mostrando aumento de PRO (seta v) em função da diminuição FUM (seta vermelha) e da ATR (seta azul), com diluição crescente do extrato.

Concentração 1mg/mL Concentração 0,5mg/mL

Concentração 0,25mg/mL Concentração 0,125mg/mL

Isso quer dizer que na presença de água pode estar ocorrendo uma hidrólise da ligação éster do FUM, o que implicaria na perda da cadeia lateral e sua conseqüente transformação em PRO. Na (tabela 3)apresenta-se esta transformação. Pode ver-se que à medida que aumenta o grau de diluição da solução original, é incrementada a concentração de PRO em paralelo à diminuição de FUM.

C _D

A

Talitha Lucena de Vasconcelos

Tabela 3 - Transformação do ácido FUM em ácido PRO em meio aquoso, a partir da diluição sucessiva de extrato de C. rangiferina (padrão).

Diluição PRO FUM ATR

µmol/mL % do inicial µmol/mL % do inicial µmol/mL % do inicial

1 0,0093 - 089 - 1,09 -

1:2 0,015 161 0,44 50 0,55 50

1:4 0,019 204 0,22 25 0,27 25

1:8 0,039 419 0,11 12,5 0,14 12,5

5.3 DISTRIBUIÇÃO DE PROTEÍNAS E FENÓIS EM TALOS DE C. verticillaris EM FUNÇÃO