Métodos

3.2.1 Preparo de células de E. coli competentes

Foi plaqueada em meio LB/Ágar a cepa de interesse para a obtenção de colônias isoladas. No dia seguinte uma colônia isolada foi inoculada em 5 mL de meio LB, o qual foi incubado overnight a 37°C sob agitação (250 rpm). Após o crescimento do pré inóculo 2 mL deste foram adicionados a um erlenmeyer de 2 L contento 400 mL de meio LB. A cultura cresceu até atingir DO600nm=0,3. A cultura foi então separada em 8 tubos cônicos de 50 mL

previamente refrigerados e incubada em banho de gelo por 15 minutos, sendo centrifugada em seguida a 4000 rpm por 10 minutos a 4°C. O pellet de células foi ressuspenso em 80 mL em solução estéril de cloreto de cálcio (60 mM CaCl2, 15% (v/v) glicerol, 10 mM MOPS pH 7,0).

As células foram novamente centrifugadas e ressuspensas em 80 mL de tampão sendo então incubadas por 1 hora em banho de gelo. Após a incubação as células foram centrifugadas à 5000 rpm por 5 minutos e ressuspensas em 16 mL (2% do volume da cultura inicial) de solução de cloreto de cálcio fria. Foram aliquotados 200 μL de suspensão de células em microtubos tipo Eppendorf de 1,5 mL sendo prontamente congeladas em N2(l) e estocadas em ultrafreezer a -

80°C

3.2.2 Transformação de bacterias E. coli

Seguindo protocolo de SAMBROOK e RUSSELL (2001), alíquotas de 50 μL da cepa de interesse foram homogeneizadas com 1 μL (100 a 200ng) de DNA e incubadas em gelo por 30 minutos. Em seguida sofreram choque térmico por 2 minutos a 42°C. Após o choque térmico, foi adicionado 1 mL de meio SOC e as células foram incubadas por 1h a 37°C. As células foram centrifugadas a 4000 xg por 2 minutos. Em seguida, 800 μL do meio foi retirado e as células foram ressuspensas no líquido residual, sendo em seguida plaqueadas em meio LB/ágar contendo o antibiótico necessário para a seleção dos transformantes.

3.2.3 Expressão e purificação dos proteassomos 20S αβ e αSalI

Bactérias competentes Rosetta 2 foram transformadas com os plasmídeos pET-Duet- αβ ou pET-Duet-αSalI e plaqueadas em meio LB/Ágar contendo ampicilina (100 μg/mL) e cloranfenicol (34 μg/mL). A placa foi incubada por 16h a 37°C. Uma colônia isolada foi inoculada em um pré-inóculo contendo meio LB (Amp/Cam) o qual foi mantido sob agitação a 37°C por 16 a 18h. O pré-inóculo foi diluído 100 vezes em meio ZYP-5052 (STUDIER, 2005). A cultura foi crescida por 20 horas a 28ºC, sob agitação (200rpm), sendo então coletada a 4000 xg por 20 minutos. As células foram então ressuspensas em até 5 mL por grama de célula

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de tampão de lise (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10% Glicerol) gelado. As células ressuspensas foram armazenadas em ultrafreezer (-80°C) até o momento da lise.

Para a lise as células foram descongeladas e tiveram lisozima adicionada para uma concentração final de 1 mg/mL, sendo mantidas sob agitação por 1 hora a 4°C. Após a lise enzimática as células foram sonicadas por 10 ciclos de 9,9s de sonicação seguidos por 9,9s de repouso (Sonicador Sonic VCX-750, probe 630-0208).

Os fragmentos celulares foram centrifugados a 4.500 xg a 4°C por 45 minutos, sendo em seguida a solução filtrada em filtro 0,45μm. O lisado foi então incubado com resina de afinidade Ni-NTA previamente equilibrada em tampão de equilibro (100 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol). A resina foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio, seguida por duas lavagens adicionais contendo 20 e 30 mM de imidazol em tampão de equilíbrio). Após a lavagem a proteína foi eluída em gradiente de imidazol até 500 mM.

O resultado da purificação foi analisado através de SDS-PAGE. As frações mais puras foram concentradas e foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular em coluna HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 em tampão 20 mM MES pH6,5; 150 mM NaCl. Os picos cromatográficos foram analisados por SDS-PAGE e novamente as frações mais puras foram concentradas até 15 a 30 mg/mL para obtenção de cristais.

3.2.4 Purificação dos proteassomo de levedura

Inicialmente, foi previsto seguir a metodologia para purificação do proteassomo de levedura descrito em GROLL e HUBBER, 2005 e GALLASTEGUI e GROLL, 2012. No entanto, foram encontradas dificuldades para purificação do proteassomo seguindo esta metodologia (resultados não mostrados). Assim, novas metodologias foram analisadas e implementadas estando descritas ao longo dos Resultados.

Resumidamente o proteassomo de levedura foi extraído de S. cerevisiae, estas foram adquiridas comercialmente. As células foram lavadas em água Milli Q duas vezes e ressuspensas em tampão 50 mM Tris pH 7.5, em seguida foram congeladas em nitrogênio líquido em gotas e lisadas em moedor de café na presença de nitrogênio líquido para evitar seu descongelamento, sendo então armazenadas em freezer até o momento da purificação. Para a purificação o lisado era descongelado e tinha seu pH ajustado para 7.5 e era adicionado DTT (concentração final 1mM) e Cloreto de Magnésio (concentração final 10mM). O lisado era clarificado e então incubado com a resina DEAE Affi-gel blue gel sendo submetido a uma etapa de cromatografia de troca iônica, em seguida as frações ativas era reunidas e submetidas a uma

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nova etapa de cromatografia de troca iônica utilizando então a colona HitrapQ. Para o refinamento final da proteína, as frações ativas eram então concentradas até 1mL e aplicadas em uma cromatografia de exclusão molecular utilizando a coluna Sephacryl S400.

3.2.5 Thermal Shift Assay (TSA)

A fim de identificar as melhores condições para estabilizar os complexos proteassomo foram realizados ensaios de Thermal Shift Assay (TSA). O TSA consiste na utilização do fluoróforo Sypro Orange® (GE Life Sciences) para avaliar a estabilidade térmica de proteínas. Esta sonda apresenta afinidade às regiões hidrofóbicas de proteínas, ligando-se aos aminoácidos hidrofóbicos, os quais, normalmente encontram-se internalizados nas estruturas proteicas. Contudo, estes resíduos podem ser gradualmente expostos quando as proteínas são submetidas à processos de desnaturação como o aumento gradual de temperatura, ou seja, com o aumento da temperatura, os resíduos hidrofóbicos das proteínas tornam-se expostos, o que permite a consequente ligação de moléculas de Sypro Orange. Quando em ambiente hidrofóbico, esta sonda fluoresce (λexc=470 nm λemis=570 nm). Após o limite de desnaturação as proteínas passam

a se agregar, as moléculas de Sypro Orange se desligam da proteína e o sinal diminui (ERICSSON et al., 2006).

O TSA foi realizado utilizando concentrações de proteína entre 0,1 μM e 0,45 μM e concentrações de Sypro Orange de 1 a 10X (preparadas a partir do estoque comercial a 5.000X). Primeiramente, foi realizado um pré-teste para a determinação das concentrações ideais de Sypro Orange e de proteína para a realização das curvas de TSA, em diferentes condições tamponantes, de sais e outros aditivos.

Para análise da estabilidade térmica da proteína em diferentes condições a solução contendo a proteína foi preparada em placas de 96 poços para PCR (Applied Biosystems), onde cada poço continha uma condição diferente de tampão, sal ou aditivos (DMSO, glicerol, aminoácidos, etc.). A curva de desenovelamento da proteína foi iniciada a 19°C, seguido de exposição a temperaturas crescentes de 19° a 99°C em uma velocidade de aquecimento de 1°C por minuto. As leituras foram realizadas no sistema 7500 Real Time PCR (Applied Biosystems).

3.2.6 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)

Visando o controle de qualidade das amostras proteicas geradas neste trabal ho, foi realizada a caracterização destas por DLS. O DLS consiste na medida da luz espalhada pelas moléculas em uma amostra, em função do tempo. Parte da luz incidente na amostra é espalhada,

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caso a amostra estivesse estática esse espalhamento seria constante. Porém por trabalhar com amostras líquidas, devido ao efeito Browniano, as moléculas da solução estão em movimento e esse espalhamento se torna dinâmico. Ao medir as flutuações do espalhamento, o DLS é capaz de estimar o tamanho médio das partículas, distribuição de tamanho e polidispersividade das partículas em solução. O DLS é capaz de estimar esses valores devido ao fato de partículas maiores apresentarem um movimento mais lento tendo um espalhamento de luz mais constante, ocorrendo o inverso para partículas pequenas (ARZENŠEK et al., 2009).

As leituras foram realizadas no Laboratório de Espectroscopia e Calorimetria (LEC - LNBio), utilizando o equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern). Para análise do proteassomo recombinante, a proteína foi diluída para 2 mg/mL e centrifugada por 10 minutos a 10.000 xg para a remoção de possíveis impurezas (poeiras, agregados). Foram adicionados 20µL da amostra a uma cubeta de quartzo e foi realizada a medida. O equipamento utilizado é capaz de se calibrar automaticamente em função da qualidade e concentração da amostra, alterando assim o número e duração das medidas realizadas. Neste caso foram realizadas 16 leituras de 10 segundos cada, com um atenuador de feixe de valor 11 (potência do feixe de 89%), numa temperatura de 20°C.

3.2.7 Análises bioquímicas

Análises bioquímicas foram realizadas para monitorar a atividade dos complexos 20S purificados e buscar novos inibidores do proteassomo. Para tanto, foi utilizado o substrato suc- LLVY-AMC comercial (Viva Life Sciences, Enzo Life Sciences ou R&D Bioscences).

Este substrato consiste em um peptídeo de 4 aminoácidos (leucina, leucina, valina e tirosina) ligado ao fluóforo 7-amino-4-metilcumarina (AMC) (Figura 8). O proteassomo hidrolisa a ligação entre a tirosina e o AMC, liberando AMC. O AMC livre emite fluorescência quando excitado a 380 nm, com pico de emissão a 460 nm. Para o ensaio HTS foi realizada toda uma etapa de padronização, a qual está descrita ao longo dos resultados

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3.2.8 Cristalização e resolução estrutural

Os proteassomo de bactéria purificados foram submetidos a ensaios de cristalização iniciais no RoboLab LNBio. As concentrações de proteína testadas para estes estudos variara m entre 3 e 30 mg/ml, seguindo a proporção 1:1 proteína:condição de cristalização. As placas foram armazenadas a 18°C.

Para o proteassomo de levedura partiu-se de condições de cristalização descritas anteriormente na literatura (TRIVELLA et al., 2014, GALLASTEGUI e GROLL, 2012).

Os cristais obtidos foram inicialmente testados na linha de difração de proteínas MX-2 (LNLS, CNPEM). Os cristais apresentado boa qualidade de difração foram coletados (difração ocorrendo até cerca de 2.8-3 Å, sendo estes valores usualmente obtidos em synchrotrons de última geração). Os cristais foram montados na linha de difração sob fluxo de nitrogênio, mantendo a temperatura a 100 K. Imagens de difração foram coletadas pelo método de rotação, com oscilação de 0.1-1o_.

Os conjuntos de dados foram processados utilizando o pacote XDS (KABSCH, 2010). Quando apropriado, foi realizada correção por anisotropia, utilizando o servidor

http://services.mbi.ucla.edu/anisoscale/anisoscale_xds/. Em seguida foi realizado ajuste de corpo rígido, utilizando o pacote PHENIX (ADAMS et al., 2002) e a estrutura atômica do proteassomo determinada a 2.5 Å 4TLC (TRIVELLA et al., 2014) como modelo, excluindo os ligantes e moléculas de água. Para tanto, cada uma das 28 subunidades foram tratadas como corpos independentes.

Após inspeção visual e refinamento em espaço real no programa Coot (EMSLEY et al., 2010) a estrutura foi refinada no pacote PHENIX (phenix.refine), realizando-se refinamento com simetria não cristalográfica - utilizando cada par de subunidade como corpos simétricos. Também, para o refinamento utilizou-se TLS, partindo-se de grupos TLS gerados automaticamente no pacote PHENIX e Refmac (WINN et al., 2011). Mapas omit foram gerados no pacote PHENIX (phenix.omit).

Os ligantes foram construídos e minimizados no programa Avogadro. A ligação a Thr1 – quando ligantes covalentes – foi inserida utilizando o programa JLigand. Os arquivos de descrição de topologia (.cif) foram gerados com o programa JLigand. O ligante foi inserido à estrutura utilizando o programa Coot e refinado utilizando o pacote PHENIX e arquivo .cif gerado.

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