Estudos bioquímicos e estruturais com o complexo proteassomo : busca de novos inibidores e mecanismos de resistência e inibição deste alvo contra o câncer

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

ARTHUR ZANETTI NUNES FERNANDES

Estudos bioquímicos e estruturais com o complexo proteassomo:

Busca de novos inibidores e mecanismos de resistência e inibição

deste alvo contra o câncer

Campinas

2017

ARTHUR ZANETTI NUNES FERNANDES

Estudos bioquímicos e estruturais com o complexo proteassomo:

Busca de novos inibidores e mecanismos de resistência e inibição

deste alvo contra o câncer

Orientadora: Dra. Daniela Barretto Barbosa Trivella

CAMPINAS 2017

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisites exigidos para a obtenção de Título de Mestre em Ciências, na Área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ARTHUR ZANETTI NUNES FERNANDES, E ORIENTADA PELA DR. DANIELA BARRETTO BARBOSA TRIVELLA

Campinas, 24 de fevereiro de 2017

Comissão examinadora:

Dra. Daniela Barretto Barbosa Trivella

Dr. Daniel Maragno Trindade

Dra. Juliana Ferreira de Oliveira

Os membros da comissão examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se

encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente aos meus pais e familiares pelo apoio e suporte ao longo de toda minha vida.

À minha orientadora Dr. Daniela B. B. Trivella por ter me selecionado como estagiário e em seguida pela orientação e apoio ao longo de todo este trabalho.

Agradeço aos demais membros do grupo pela ajuda e companheirismo, em especial à Bruna não só pela ajuda na bancada, mas especialmente pela amizade além dela.

Agradeço aos meus amigos pelo apoio, paciência e compreensão de minhas ausências: Bárbara, Ivy, Renata Kurokawa, Renata Afonso, Isabella, Heloísa, Cindy, Cláudio, Pedro, Danilo, Jesiel, Evandro e Fernando.

Ao apoio técnico dado pelos funcionários do CNPEM, em especial à Jackel ine Zanella e à Juliana Fattori.

Aos outros alunos do LNBio, em especial às meninas do LEC.

Aos pesquisadores que participaram das etapas avaliativas desse trabalho pelo esforço e ajuda em corrigir e melhorar este trabalho.

Às facilities do CNPEM utilizadas ao longo desse trabalho: Laboratório de espectroscopia e calorimetria, Laboratório de cristalização de macromoléculas, Laboratório de purificação de proteína, Laboratório de química e produtos naturais, Linha MX2.

À Phytobios, ao grupo do prof. Dr. Roberto Berlinck e aos membros do LQPN pelo preparo dos compostos testados nesse trabalho.

Agradeço as agências de fomento pelo suporte financeiro (CAPES/1419094 e FAPESP/14/10753-9)

RESUMO

O proteassomo é um complexo enzimático responsável pela degradação proteica programada, sendo crítico para a regulação da homeostase celular estando associado a diversas patologias incluindo câncer. Em 2003, bortezomib (Velcade® - Takeda Inc.) foi o primeiro inibidor de proteassomo aprovado pelo FDA, atualmente sendo o fármaco de primeira escolha para tratamento de mieloma múltiplo. Porém, o uso clínico mostrou que inibi dores de proteassomo enfrentam diversos problemas como toxicidade, baixa distribuição e desenvolvimento de resistência. Assim, a busca de novos inibidores do proteassomo, especialmente do proteassomo resistente, torna-se importante. Recentemente foi descrito na actinobactéria Salinispora tropica a presença de duas isoformas de proteassomo, sendo uma delas resistente a inibidores conhecidos do proteassomo humano e de levedura. Esta isoforma resistente carrega as mesmas mutações encontradas em células humanas resistentes a bortezomib. Estudos in vitro com o proteassomo humano são bastante limitados. Sendo assim, neste projeto de mestrado, propomos a realização de estudos bioquímicos e estruturais com os proteassomos humano (comercial), de levedura e de actinobactéria (selvagem e resistente), visando a busca de novas classes de inibidores do proteassomo. Durante este trabalho, estabelecemos os protocolos de expressão, purificação e cristalização do proteassmo de levedura e de bactéria (selvagem), e reportamos a primeira estrutura atômica deste último. Além disto, protocolos foram também implementados para a expressão e purificação do proteassomo de bactéria resistente. Em paralelo, estabelecemos um ensaio high-throughput screening (HTS) para análise de bibliotecas de produtos naturais com o proteassomo humano e de levedura. Utilizando este ensaio fomos capazes de triar cerca de 1200 amostras de produtos naturais (frações, extratos brutos e substâncias isoladas) identificando novos hits. Três hits foram priorizados em nossos estudos, sendo que um representa uma nova estrutura para inibição do proteassomo e outro foi cristalizado com o proteassomo utilizando uma nova abordagem. Assim, almejamos que os resultados obtidos contribuam para a descoberta de novos inibidores do proteassomo visando o desenvolvimento de uma nova geração de inibidores para esse alvo contra o câncer.

Palavras-chave: Proteassomo, câncer, produtos naturais, cristalografia de proteínas, descoberta de fármacos, triagem em larga escala

ABSTRACT

The proteasome is an enzymatic complex responsible for the programmed degradation of proteins, being critical for the cellular homeostasis regulation and associated to several diseases including cancer. In 2003 Bortezomib (Velcade® - Takeda Inc.) was the first proteasome inhibitor to be approved by the FDA and has become the first choice for multiple myeloma treatment. However, the clinical usage of proteasome inhibitors showed that they face several problems such as toxicity, low distribution and development of resistance. Thereby the search for new proteasome inhibitors, especially for the resistant form, becomes an important matter. Recently, it was described the presence of two isoforms of the proteasome in the actinobacteria Salinispora tropica, being one of these resistant to human and yeast proteasome inhibitors. This isoform has the same mutations found in human cells resistant to bortezomib. In vitro studies with the human proteasome are limited. Therefore, we proposed the performance of biochemical and structural studies using the commercial human proteasome, yeast and actinobacteria (wild and resistant types) proteasomes, aiming the discovery of new classes of proteasome inhibitors. During this work we established the protocols for expression, purification and crystallization of the yeast and bacterial proteasomes (wild type), and will report the first crystal structure of the later. Furthermore, protocols were further implemented for the expression and purification of resistant bacterial proteasome. In parallel, we also established a high-throughput screening (HTS) assay to evaluate natural products libraries using the human and the yeast proteasomes. With those assays, we were able to screen about 1,200 samples of natural products (whole extracts, fractions and isolated substances) identifying new hits. Three out the hits were prioritized in our studies, being one a new proteasome inhibitor structure and other was crystallized using a new approach. Overall, we seek that the results herein obtained will contribute to the discovery of new proteasome inhibitors aiming the development of next generation inhibitors for this target against cancer.

Key words: Proteasome, cancer, natural products, protein crystallography, drug discovery, high throughput screening.

ABREVIATURAS E SIGLAS

°C Graus Celsius

19S Complexo regulador do proteassomo 20S Complexo catalítico do proteassomo

26S Subunidade catalítica acoplada a duas subunidades regulatórias do proteassomo

AAA+ ATPases Associated with diverse cellular Activities – ATPases associadas à

diversas atividades celulares Amp Ampicilina

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATP Adenosina trifosfato

ATPase Adenosinatrifosfatases Cam Cloranfenicol

CD138 Cluster of differentiation 138 ou Syndecan-1

CD38 Cluster of differentiation 38 – Cluster de diferenciação 38 ChTL Atividade tipo quimotripsina do proteassomo

CID10 Classificação Estatística Internacional de Doenças e Problemas Relacionados com a Saúde

CL Atividade tipo caspase do proteassomo

DATASUS Departamento de informática do Sistema Único de Saúde do Brasil. DEAE Dietilaminoetil

DLS Espalhamento de Luz Dinâmico, do inglês Dynamic light scattering DMSO Dimetil sulfóxido

DNA Ácido Desoxirribonucléico, do inglês Deoxiribonucleic Acid DO Densidade ótica

Dop Deaminase of Pup – Desaminase de Pup DTT Ditiotreitol

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid - Ácido etilenodiaminotetracético FDA Food and Drug Administration USA Administração de Alimentos e

Medicamentos dos Estados Unidos da América GET Tampão Glicose-EDTA-Tris

HAART Highly active antirretroviral therapy – terapia antirretroviral de alta atividade HDAC Histone deacetylase – Deacetilase de histona

HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid - (N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico)

HIV-1 Human Immunodeficiency Virus - Vírus da imunodeficiência humana tipo 1 HSPs Heat shock protein – proteína de choque térmico

HTS High Throughput Screening – triagem em larga escala IEX Ion Exchange cromatography - Cromatografia de troca iônica INCA Instituto Nacional de Câncer

IPTG Isopropil-ß-D-1-Tiogalactopiranosídeo

IRF4 Interferon regulatory factor 4 – fator regulador de interferon 4 JNK c-Jun N-terminal kinases – Quinase N-terminal de c-Jun LB Caldo Luria-Bertani

l-κB Inibidor de κB Kinase

M Molar

MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid – Ácido-2-(N-morfolino) etanosulfônico

MCS Multiple cloning site – Cassete de clonagem múltipla

MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid – Ácido 3(N-morfolino) propanossulfônico

MPD 2-metil-pentano-2,4-diol mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

NF-kB Fator nuclear de cadeia leve – κ intensificador de células B ativadas PafA Proteasome-associated factor A – Fator A associado à proteassomo PB Plantas brasileiras

PEG Polietilenoglicol

pH Potencial hidrogeniônico

PI3K/Akt Fosfatidil inositol-3-quinase/ Proteina quinase B - Phosphatidylinositol 3' – kinase/ Protein kinase B

Pup Prokaryotic ubiquitin-like protein – Proteína tipo ubiqutina procariótica RCF Força centrífuga relativa – relative centrifugal foree

RNAi Ribonucleic acid interference – Ácido ribonucleico de interferência RPM Rotações por minuto

RPNs Regulatory particle of non-ATPase subunits – Partícula regulatória de subunidades não-ATPse

RPTs Regulatory particle of triple-ATPase subunits – Partícula regulatória de subunidades triplo-ATPse

S Coeficiente de sedimentação (Svedberg)

SalI Subunidade catalítica resistente do proteassomo 20S de S. tropica SAMPs Ubiquitin-like small archaeal modifier proteins – Pequenas proteínas

modificadoras tipo ubiquitina de archeae

SBDD Struture-based drug design – Desenho de fármacos baseado em estrutura SDS-PAGE Dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida

SOC Super Optimal broth with Catabolic repressor – Caldo super ótimo com repressor catabólico

STB Sample Treatmeant Buffer – Tampão de tratamento de amostra

TE Tampão Tris-EDTA

TEMED N, N, N’, N’ - Tetrametiletilenodiamina TL Atividade tipo tripsina do proteassomo TSA Thermal Shift Assay

UPS Sistema Ubiquitina-Proteassomo – Ubiquitin proteasome system Y20Swt Proteassomo 20S wild type de S. cerevisiae

α Subunidade estrutural do proteassomo 20S β Subunidade catalítica do proteasosmo 20S ε Coeficiente de extinção molar

μg Micrograma

μL Microlitro

SUMÁRIO

1.1 Uma perspectiva histórica na busca de inibidores de proteassomo ... 13

1.2 Proteassomo eucariótico... 15

1.3 Proteassomo bacteriano ... 17

1.4 Mecanismo catalítico ... 18

1.5 O proteassomo como alvo... 20

1.6 Inibidores de proteassomo ... 23

1.7 Resistência adquirida à inibidores de proteassomo ... 24

1.8 Fonte de novos inibidores de proteassomo ... 28

2 Objetivos... 29

3 Materiais e métodos ... 30

3.1 Materiais... 30

3.2 Métodos ... 31

3.2.1 Preparo de células de E. coli competentes ... 31

3.2.2 Transformação de bacterias E. coli ... 31

3.2.3 Expressão e purificação dos proteassomos 20S αβ e αSalI ... 31

3.2.4 Purificação dos proteassomo de levedura ... 32

3.2.5 Thermal Shift Assay (TSA) ... 33

3.2.6 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) ... 33

3.2.7 Análises bioquímicas ... 34

3.2.8 Cristalização e resolução estrutural ... 35

4 Resultados e discussão ... 36

4.1 Complexos proteassomo bacterianos: expressão, purificação, cristalização e estrutura cristalográfica ... 36

4.2 Purificação e cristalografia do proteassomo 20S de Saccharomyces cerevisiae ... 45

4.2.1 Purificação do proteassomo 20S ... 45

4.2.2 Cristalografia ... 52

4.3 Triagem de biblioteca de produtos naturais e caracterização de hits... 55

4.3.1 Padronização do ensaio ... 55

4.3.2 Execução do ensaio ... 57

4.3.4 Hit PB005... 61

4.3.5 Hit batzeladina D (MaMe1Me1A) ... 63

4.3.6 Hit TMC-95A (MA9) ... 66

5 Conclusões ... 70

6 Trabalhos científicos ... 72

7 Referências Bibliográficas ... 73

ANEXO I – Declaração de biossegurança ... 86

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Uma perspectiva histórica na busca de inibidores de proteassomo

A busca por inibidores de proteassomo iniciada na década de 90 não visava a busca de um agente antineoplásico e sim a ajuda à pacientes com caquexia muscular (GOLDBERG, 2012), já que havia sido demonstrado que o aumento do catabolismo muscular se devia ao sistema ubiquitina proteassomo e não à proteólise por lisossomos (ETLINGER E GOLDBERG, 1977)

Atualmente, sabe-se que a atrofia muscular apresenta uma série de adaptações comuns às diversas doenças que a causam como inanição, desnervação, câncer, septicemias ou diabetes. Essas adaptações incluem o aumento da expressão de ubiquitina, proteassomo e enzimas de ubiquitinação (GOLDBERG, 2012).

Em 1993 a empresa MyoGenics foi fundada pelo professor de Harvard Dr. Alfred L. Goldberg. Ele não buscou apenas desenvolver produtos terapêuticos mas incentivo u grandemente a pesquisa básica dentro e fora da empresa, inclusive distribuindo gratuitamente um dos primeiros inibidores de proteassomo desenvolvidos: o MG132 (GOLDBERG, 2011).

O uso desse inibidor na pesquisa ajudou uma melhor compreensão da importânci a do proteassomo no câncer, apoptose, inflamação e apresentação de antígeno e até hoje o MG132 permanece como o inibidor mais utilizado, devido ao seu baixo custo, potência e reversibilidade (GOLDBERG, 2012).

Os primeiros inibidores não foram descobertos em screenings de grandes coleções de compostos químicos, mas foram sintetizados racionalmente baseado em substratos naturais. Embora na época ainda não houvessem estruturas do proteassomo já se sabia que a subunidade β5 (do tipo quimotripsina) (VOGES et al., 1999) era a mais importante e que pequenos resíduos hidrofóbicos eram permeáveis às membranas celulares (GOLDBERG, 2011).

Dessa forma a porção C-terminal dos resíduos de aminoácidos foram derivatizadas para formar aldeídos, pois já era sabido que aldeídos eram capazes de inibidor serino proteases e císteino proteases. O farmacóforo aldeído foi substituto por outros farmacóforos inibitórios como vinil sulfona e boronato, capazes de aumentar a sua potência em 50 a 100 vezes (GOLDBERG, 2011).

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Algumas modificações adicionais no esqueleto peptídico de inibidores boronato gerou o primeiro inibidor de proteassomo disponível para uso clínico: o bortezomib (MG341/PS341/LDP341/MLN341) (GOLDBERG, 2011).

Com os avanços nas pesquisas básicas sobre o proteassomo e a descoberta da s ua atuação na inativação do NF-kB, o qual apresenta papel importante em vias de inflamação e câncer, o interesse sobre o proteassomo como um alvo terapêutico crescer. A partir de então a ação antineoplásica e antinflamatória do bortezomib tornou se o foco de estudo principal da Myogenics a qual foi reformulada e passou a se chamar ProScript (de “Proteasomes and Transcription”) deixando de lado o foco do tratamento da caquexia. Com uma parceria com a empresa Hoechst Pharmaceuticals o bortezomib foi investigado inicialmente para uso como agente anti-inflamatório, porém a diretoria da Hoeschst Pharmaceuticals optou por cancelar a investigação do bortezomib e investir e outro candidato desenvolvido pelos próprios pesquisadores. Embora com dados preliminares interessantes no uso antineoplásico a Hoeschst também cessou a investigação nessa área (GOLDBERG, 2011).

A Proscript porém foi vendida à empresa Leukocyte, essa decisão foi tomada pelos investidores após a falta de apoio da Hoechst Pharmaceuticas, o fato da vi a ubiquitina-proteassomo ainda ser pouco entendida pela indústria farmacêutica e que diversos assessores científicos dizerem que inibidores de proteassomo seriam altamente tóxicos impedindo seu uso (GOLDBERG, 2011).

A Leukocyte foi vendida alguns meses depois à Millennium Inc. e 7 candidatos a medicamentos comprados da Leukocyte foram testados em estudos clínicos, porém nenhum apresentou resultados positivos. Posteriormente após testes bem-sucedidos em tumores xenográficos a Millennium Inc decidiu iniciar os ensaios clínicos com o bortezomib. Uma das pacientes da fase I possuía mieloma múltiplo que mostrou uma completa remissão, fato antes nunca documentado. Dessa forma os ensaios clínicos de fase II foram focados nesse tipo de câncer (GOLDBERG, 2011).

Em 2003 o bortezomib foi aprovado pelo FDA para uso, sendo inicialmente proposto como terceira opção de terapia e atualmente considerado como primeira opção. O sucesso do bortezomib despertou o interesse da indústria farmacêutica em buscar novos inibidores de proteassomo. A ProScript foi vendida por apenas 3 milhões de dólares, enquanto em 2012 apenas a venda do bortezomib atingiu quase 3 bilhões de dólares! (GOLDBERG, 2012)

No momento estão aprovados para uso três inibidores de proteassomo: pelo FDA o Bortezomib, Carfilzomib e Ixazomib, respectivamente em 2003, 2012 e 2015. E no Brasil pela ANVISA apenas o bortezomib em 2012.

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Atualmente quase 60 ensaios clínicos estão sendo realizados com inibidores de proteassomo reforçando o interesse da indústria farmacêutica na pesquisa de novos inibidores de proteassomo (CLINICAL TRIALS, 2016).

1.2 Proteassomo eucariótico

O proteassomo eucariótico é uma protease formada por dois complexos principais: o complexo catalítico 20S e um ou dois complexos regulatórios 19S, os quais formam respectivamente o proteassomo 26S (1,6MDa) e 30S (2,5MDa). Embora outros reguladores tenham sido identificados, como Pa28αβ ou Pa28γ (conhecidos também como 11S e PA200) (PICKERING e DAVIES, 2012) seus papéis ainda não são muito claros (TOMKO JR e HOCHSTRASSER, 2013) - Figura 1A.

Figura 1. Representação esquemática do complexo proteassomo eucariótico. A. Complexo proteassomo 30S

eucariótico, constituído pelo complexo catalítico 20S ao centro e por dois reguladores 19S nas extremidades. O proteassomo 20S (amarelo) é composto por dois anéis hetero-heptaédricos externos de subunidades alfa, e dois anéis hetero-heptaédricos internos de subunidades beta. Estão destacadas, em vermelho, as subunidades catalíticas (β1 – tipo caspase, β2 – tipo tripsina e β5 – tipo quimotripsina). O complexo regulatório 19S apresenta diferentes subunidades, divididas em RPTs e RPNs (Retirado de ICHIHARA, 2010). B. Organização estrutural da partícula catalítica 20S do proteassomo de eucariotos, estão destacados as posiçõe s e características das subunidades catalíticas. Nesta figura, pode-se visualizar também o canal do substrato, o qual é formado no centro do complexo 20S (Modificado de DICK e FLEMING, 2010).

A estrutura do complexo 20S consiste em quatro anéis heptaméricos de subunidades α e β sobrepostos. Nas extremidades estão 7 subunidades α desempenhando papel estrutural, no centro estão dois anéis heptaméricos de subunidades β, nas quais encontram-se as subunidades catalíticas β1 (tipo caspase - CL), β2 (tipo tripsina - TL) e β5 (tipo quimotripsina - ChTL) - Figura 1B. Em mamíferos, além das subunidades β1, β2 e β5 também temos as subunidades

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β1i, β2i e β5i, os quais constituem o imunoproteassomo e a subunidade β5t presente exclusivamente no timo (KLOETZEL, 2001, MURATA et al., 2009).

O complexo regulatório 19S é composto por 19 subunidades entre 10 e 110kDa. Este pode ser dividido em 2 subcomplexos: base e lid (Figura 1A). O subcomplexo base está diretamente ligado ao proteassomo 20S e é formado por 9 subunidades, sendo 6 subunidades RPTs (regulatory particle of triple-ATPase subunits) e 3 subunidades RPNs (regulatory particle of non-ATPase subunits). Por sua vez o subcomplexo lid é composto por 10 subunidades. As subunidades com atividade ATPase são necessárias para o desenovelamento do substrato proteico e abertura do canal do proteassomo 20S. As subunidades RPNs por sua vez são responsáveis pela captura do substrato e pela retirada das unidades de ubiquitinas (MURATA et al., 2009; SAEKI e TANAKA, 2012). In vitro, pode-se obter um complexo 20S funcional por meio da utilização de detergentes, como SDS (dodecil sulfato de sódio). Neste caso, o detergente desempenha o papel da subunidade 19S, “abrindo” o canal do substrato, e possibilitando o monitoramento da ação das subunidades catalíticas C-L, ChT-L e T-L (GROLL e HUBER, 2005). A subunidade alfa apresenta um papel majoritariamente estrutural, formando as aberturas do canal do proteassomo, além de interagir diretamente com o complexo regulador (GROLL et al., 1997).

O regulador Pa28αβ é induzido por interferon γ. In vitro ele é capaz de estimular a quebra de pequenos peptídeos, mas não de proteínas conjugadas com ubiquitina. Em células existem proteassomo mistos formados tanto com regulador 19S, quanto com Pa28αβ permitindo a degradação das proteínas. A função exata deste regulador ainda é desconhecida embora acredita-se que ele esteja envolvido na apresentação de antígenos de MHC de classe I (CASCIO, 2014).

Atualmente já foram identificadas 5 isoformas do regulador PA28γ, embora ferramentas de bioinformática digam que seriam possíveis até 49 formas de splicings alternativos. O regulador PA28γ atua ativando o proteassomo para uma degradação de proteínas usualmente não marcadas por ubiquitina, além de não requererem ATP. Acredita-se que atue na regulação de ciclo celular e apoptose (XU et al., 2015).

Recentemente foi verificado que os ativadores Pa28αβ e PA28γ quando nocauteados simultaneamente em camundongos tornou-os inférteis. Embora apresentassem espermatozoides morfologicamente normais estes apresentaram problemas de mobilidade além de uma expressão aumentada de proteínas envolvidas em estresse oxidativo, sugerindo assim um papel indispensável desses ativadores na fertilidade masculina, além de um novo papel na resposta antioxidante do proteassomo (HUANG et al, 2016).

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1.3 Proteassomo bacteriano

Ainda não se tem certeza como actinobactérias adquiriram o proteassomo em seus genomas. A principal teoria é da transferência gênica horizontal de algum eucarioto ou Archeae. A teoria alternativa à transferência gênica horizontal é de que os genes do proteassomo estavam presentes em um ancestral comum a todas as bactérias, porém ele foi perdido em todos os filos exceto nas actinobactérias. Para que isso ocorresse, seria necessário um grande número de eventos genéticos independentes, tornando essa teoria menos provável (VOLKER e LUPAS, 2002).

O proteassomo bacteriano 20S apresenta grandes semelhanças ao proteassomo eucariótico, sendo composto por 4 anéis heptaméricos arranjados de maneira α7β7β7α7. Porém,

apresenta apenas um (ex: Methanocaldococcus jannaschii) ou dois (ex: Rhodococcus sp., Salinispora sp.) tipos de subunidades, ao contrário dos eucariotos em que cada anel é formado por sete subunidades distintas. Devido ao fato dos anéis β7 serem formados por apenas uma ou

duas subunidades, o proteassomo bacteriano apresenta 14 subunidades catalíticas por complexo. Foi verificada que a atividade predominante é a ChTL, embora as outras atividades catalíticas também tenham sido verificadas (HUMBARD e MAUPIN-FURLOW, 2013; KALE et al., 2011).

A principal diferença entre os proteassomos encontra-se na subunidade regulatória, sendo a procariótica consideravelmente mais simples, composta apenas por um anel homohexamérico de ATPases responsáveis pelo desenovelamento do substrato proteico (MAUPIN-FURLOW, 2011) - Figura 2.

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Figura 2. Comparação de proteassomos eucariótico, Archaea e de actinobacterias. Todos os proteassomos

apresentam a partícula catalítica 20S (CP) formada por anéis heptméricos de subunidades alfa e beta. O proteassomo 20S pode se associar com complexos regulatórios com atividade AAA+ ATPase (19S em eucariótos, Pan em Archea, Arc ou Mpa em actinobactérias). Os complexos Pan, Arc e Mpa são anéis homohexaméricos enquanto o complexo regulatório 19S eucariótico apresenta na subunidade base 6 proteínas distintas formando o anel hexámerico e mais três proteínas acopladas a este anel (Modificado de MAUPIN-FURLOW, 2011).

1.4 Mecanismo catalítico

O proteassomo é uma protease N-terminal, cujos sítios catalíticos são formados por modificações pós-traducionais apresentando um resíduo de treonina em posição 1 (Thr1) ativado. Em eucariotos, 3 das subunidades β apresentam atividades proteolíticas especificas: tipo caspase (β1); tipo tripsina (β2); tipo quimotripsina (β5), dessa forma apresentando 6 centros catalíticos (NUSSBAUM et al., 1998). A atividade peptidase do proteassomo se deve ao resíduo catalítico Thr1 (nucleófilo) presente em todas as subunidades catalíticas. No entanto, sua preferência por sequências peptídicas distintas nos substratos deve-se aos outros aminoácidos presentes nos bolsões catalíticos de cada tipo de subunidade (especialmente no bolsão 1 – S1, cuja preferência corresponde aos aminoácidos P1) (Figura 3). Por outro lado, em procariotos são encontradas 14 subunidades β idênticas (KALE et al., 2011; KALE e MOORE, 2012) com atividade predominantemente tipo quimotripsina (HUMBARD e MAUPIN-FURLOW, 2013). O microambiente dos sítios catalíticos do proteassomo proporciona a desprotonação de Thr1OH, estando esta na forma ativada (Thr1O-). Este alcóxido é responsável pelo ataque nucleofílico ao substrato proteico (carbono do grupo amida da ligação peptídica), iniciando o

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processo de catálise (KISSELEV et al., 2012). Dessa forma o mecanismo consiste em duas etapas, na primeira ocorre o ataque nucleofílico ao substrato formando um intermediário covalente entre a enzima e o grupo acil do peptídeo, em seguida esta ligação é hidrolisada e a enzima tem sem sítio ativo regenerando. - Figura 4.

Atualmente já estão descritas diversas estruturas do proteassomo 20S, a primeira estrutura descrita foi a do proteassmo da arqueobacteria termofila Thermoplasma acidophilum (1PMA em 1996), enquanto o primeiro proteassomo eucariótico descrito foi o de S. cerevisiae em 1998 (1RYP) por Groll e colaboradores do proteassomo de levedura, deste de então estruturas de outros proteassomos eucarióticos já foram descritas (Mus musculus: 3UNB; Plasmodium falciparum: 5FMG; Bos taurus: 1IRU e recentemente humano: 4R3O). Proteassomos bacterianos também já foram descritos (Mycobacterium tuberculosis: 2FHG e Rhodococcus erythropolis: 1Q5Q). As estruturas de fundamental importância para compreensão do ataque nucleofílico pela treonina, já que o proteassomo é a única protease a apresentar como resíduo ativo de ataque a treonina.

P5 P4 P3 P2 P1 P’1 P’2 P’3 P’4 P’5 Wild-Type Pro Leu Arg -gly Β hairpin β5/Pre2 ChTL Polar Volta β Leu Tyr Phe Trp -Gly Básico β hairpin β2/Pup1 TL Lys Arg

Lys Gly Pro β1/Pre3 CL Polar Hidro- fóbico Asp Glu Hidro-fóbico

Figura 3. Preferência de sequência peptídica nos substratos do proteassomo eucariótico. Sumário dos

motivos de clivagem preferenciais do proteassomo 20S. Estes dados foram obtidos a partir de análise estatística de preferência de resíduos ao longo de 5 resíduos antes ou após o ponto de hidrólise, tendo como substrato a proteína enolase. Aminoácidos com “-” são desfavorecidos. Wild-type corresponde ao proteassomo selvagem de levedura com todas as subunidades ativas, β1, β2 e β5 correspondem as preferências de cada subunidade especificamente (Modificado de: HEINEMEYER, 2000).

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Figura 4. Sítio catalítico do proteassomo e seu mecanismo de hidrólise. A. Representação esquemática do sítio

catalítico do proteassomo. A cadeia peptídica representa um substrato orientado do N ao C terminal. A ligação peptídica a sofrer hidrolise está destacada. Seguindo a nomenclatura de SCHECHTER e BERGER (1967) temos em “P” as posições de interação entre substrato e proteassomo, e em S, os bolsões catalíticos, responsáveis pela estabilização do ligante. P’ e S’ correspondem as posições posteriores à ligação peptídica a ser hidrolisada. (Modificado de NAZIF e BOGYO, 2001). B. Mecanismo catalítico do proteassomo. Em azul os resíduos proteassomo, o substrato está em preto exceto pela ligação a ser clivada, a qual está destacada em vermelho (Modificado de KISSELEV et al., 2012).

1.5 O proteassomo como alvo

Devido ao papel central do proteassomo no catabolismo proteico foi verificado que o uso de inibidores de proteassomo é capaz de ajudar em diversas enfermidades, em especial o câncer.

De acordo com o Instituto Nacional de Câncer (INCA):

Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado (maligno) de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo.

No ano de 2014, neoplasias (CID II) foram a segunda maior causa de morte no Brasil ficando atrás apenas de doenças do aparelho circulatório (CID X) (DATASUS), e estima-se que no biênio 2016-2017 surjam 600 mil novos casos no Brasil (Ministério da Saúde).

O impacto econômico do câncer gera perdas de cerca de 1,5% no PIB global. Além disso um tratamento anual para mieloma múltiplo – principal tipo de câncer tratado com

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inibidores de proteassomo - pode variar entre 90 (Bortezomib associado à Dexametasona) e 256 mil dólares (Carfilzomib associado à Lenalidomida). Há de se destacar que o mieloma múltiplo não apresenta cura, sendo uma forma progressiva de câncer em que pacientes podem experimentar períodos de recaída e remissão da doença (ROY et al., 2015).

Incialmente, na década de 90, foi verificado que inibidores de proteassomo eram capazes de induzir a apoptose em diferentes tipos de linhagens celulares (IMAJOH-OHMI et al, 1995 e ORLOWSKI et al, 1998). Com os avanços dos estudos sobre o sistema ubiquitina proteassomo mostrando sua atuação não só no catabolismo de proteínas, mas também no controle de processos celulares como mitose, crescimento celular, quimiotaxia, apresentação de antígenos, angiogênese, apoptose e regulação da expressão gênica (Figura 5) (GOLDBERG, 2012; FRANKLAND-SEARBY e BHAUMIK, 2012) o interesse pelo desenvolvimento de inibidores de proteassomo aumentou. Também foi verificado que o nível de expressão de proteassomo em células tumorais encontra-se aumentado. Isso se justifica pelo fato que células tumorais se encontram em um permanente processo de multiplicação com elevado metabolismo, tornando-se mais dependentes da atividade do proteassomo, principalmente para a degradação de proteínas que suprimiriam a parada do crescimento e divisão, além de possíveis proteínas defeituosas (SHEN et al., 2013).

Figura 5. Diagrama esquemático dos efeitos da inibição do proteassomo. A inibição do proteassomo gera

efeitos em diversas vias celulares resultando em morte seletiva de células tumorais (em relação a células não transformadas). Modificado de (FRANKLAND-SEARBY e BHAUMIK, 2012).

Em 2003, com a liberação do medicamento bortezomib, e em 2012 do Carfilzomib (Kyprolis® Onyx Inc.) pelo FDA a corrida pela descoberta de novos inibidores de proteassomo

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se acentuou. Não só novos compostos têm sido procurados, mas também se tem tentado melhorar a farmacocinética dos fármacos atualmente disponíveis.

Dentre os diversos mecanismos de ação de inibidores de proteassomo no tratamento de neoplasia os que se destacam são (GOLDBERG, 2011):

Inibição de NF-kB

O fator nuclear kB está relacionado com a regulação da proliferação, transformação e desenvolvimento tumoral. Uma das hipóteses dessa relação se dá pelo estímulo da ciclina D1, responsável pelo controle de checagem da fase G1/S do ciclo celular (JOYCE et al., 2001; HINZ et al., 1999).

O proteassomo é responsável pela degradação de IkB, que por sua vez inibe o NF-kB . Quando o proteassomo é inibido não ocorre degradação do IkB mantendo assim o NF-kB inibido e impedindo sua atividade oncogênica (LI e KARIN, 1998).

Aumento do estresse no reticulo endoplasmático

Foi verificado que a inibição de proteassomo leva ao acúmulo de proteínas desenoveladas no retículo endoplasmático caracterizando o estresse no retículo endoplasmático. O estresse reticular ativa diversos fatores pró apoptóticos e contribui para o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ZEESHAN et al., 2016).

Estabilização de proteínas regulatórias de ciclo celular p27 e p53

A proteólise mediada por ubiquitina está envolvida no turnover de diversas proteínas reguladoras do ciclo celular entre elas o supressor tumoral p53 e a proteína inibidora de CDKs/p27 (KUDO et al., 2000).

É sabido que em cerca de 50% dos canceres a proteína p53 encontra-se mutada (VOUSDEN e PRIVES, 2009). A inibição do proteassomo leva à estabilização da p53 que por sua vez, é capaz de levar à indução da apoptose (LOPES et al., 1997).

Assim como a p53 o acúmulo de p27 é capaz de levar ao arraste do ciclo celular e consequente apoptose (NAUJOKAT e HOFFMAN, 2002).

Indução de apoptose, por estabilização de JNK (c-Jun N-terminal Kinases) e pelo bloqueio da destruição de caspases por proteínas inibitórias de apoptose

A JNK quando ativada promove a regulação positiva de genes pró apoptóticos e também pela modulação de proteínas pró e anti apoptóticas da mitocôndria (DHANASEKARAN e REDDY, 2008). O proteassomo inibido leva a um aumento do estresse reticular e estresse

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oxidativo que por sua vez levam a uma rápida ativação da via JNK (GOLDBERG 2011, BRNJIC et al., 2014).

Foi verificado também que a inibição do proteassomo promove apoptose pela via das caspases. As caspases-8, 9 e 12 são capazes de promover a apoptose, o uso de inibidores de proteassomo impedem sua proteólise ocasionando um acúmulo das capases que por sua vez promovem a apoptose (GOLDBERG, 2011).

Acúmulo de proteínas mal enoveladas

O uso de inibidores de proteassomo promove a iniciação da UPR (unfolded protein response), uma via de sinalização ativada pelo acúmulo de proteínas enoveladas erroneamente no retículo endoplasmático. Inclui-se na via pró-apoptótica da UPR a ativação da kinase eIF-2α (kinase específica de estresse reticular), o fator de transcrição ATF4 e de seu alvo pró-apoptótico CHOP/GADD153. Curiosamente as células de mieloma múltiplo se mostram mais sensíveis ao estresse reticular, já que esse tipo celular já expressa constitutivamente fatores de sobrevivência ao estresse reticular para poder manter suas funções de célula secretória (OBENG et al., 2006).

Este complexo proteolítico vem também sendo apontado como alvo para outras neoplasias, incluindo tumores sólidos (RAJAN & KUMAR, 2016; RAEDLER, 2015; KISSELEV, 2012). Além de neoplasias, o proteassomo também vem sendo validado como alvo terapêutico para outras enfermidades humanas (GOLDEBERG, 2012), onde destacam-se: Doenças neurodegenerativas e do envelhecimento (ativação) – (COOKSON, 2006), inflamação (KISSELEV, 2012; PAHL, 1999; PALOMBELLA et al., 1994); reperfusão após AVC (WILLIAMS et al., 2006; SHAH et al., 2002; DOEPPNER et al., 2012); crescimento óseeo (PALOMBELLA et al., 1994; GARRET et al., 2003); crescimento capilar (LESLIE et al., 2006 e MUNDY, 2007); doenças infecciosas (CRUNKHORN, 2016; KAHRE et al., 2016; CZESNY et al., 2009); nefropatias (TANG e LAI, 2009; HUANG et al., 2014); doenças autoimunes (CLINICAL TRIALS, 2016) e tratamento de rejeição alográfica (KISSELEV, 2012; BIANCHI et al., 2009; CENCI et al., 2006).

1.6 Inibidores de proteassomo

Embora tenhamos poucos inibidores de proteassomo aprovados para uso clínico, diversas classes químicas de inibidores já foram identificadas, sendo estas usadas na academia

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ou em testes clínicos. As principais classes de inibidores de proteassomo estão descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Classificação de inibidores de proteassomo. Em negrito estão destacados compostos de origem

natural.

Tipo Classe Exemplos

Inibidores covalentes

Aldeidos Tiroptinina A; MG-132

Boronatos Bortezomib

Epoxicetonas Epoxomicina, carmaficina, carfilzomib

Beta-lactonas Salinosporamida A, Omuralide, PS-519

Vinil sulfonas MV151

Sirbactinas SylA, GlbA

Polifenóis EGCG

Inibidores não covalentes

Peptídeos cíclicos TMC-95, Scytonemide A

Capped Dipeptides Ritonavir, benzylstatine Não peptídicos PI-083, hidroxiureas, alcaloides

marinhos

Inibidores Alostéricos

Macrolídeos Rapamicina

Polípeptídeo PR-39

Quinolinas 5AHQ

(Modificado de KISSELEV, 2008; KISSELEV, 2012; YANG et al, 2011, Beck et al., 2015)

Todos os inibidores não covalentes são inibidores reversíveis (ocorre a separação do complexo inibidor-enzima restaurando a atividade enzimática). Porém nem todos os inibidores covalentes são irreversíveis (ocorre uma interação permanente do inibidor com a enzima) . Inibidores como aldeídos e alguns boronatos são inibidores covalentes reversíveis (inibidores deste tipo se ligam covalentemente ao proteassomo permitindo um efeito de maior duração, porém essa ligação não é permanente e pode ser desfeita restaurante a atividade enzimática do proteassomo). Embora inibidores irreversíveis usualmente apresentarem IC50 menores, junto com essa potência maior também são maiores os efeitos adversos, dessa forma seria interessante a descoberta de fármacos reversíveis mais que também apresentem valores de IC50 baixos.

1.7 Resistência adquirida à inibidores de proteassomo

Foi verificado que o uso clínico e in vitro de bortezomib, e mais recentemente, Carfilzomib, pode resultar em resistência adquirida a estes fármacos. Os mecanismos pelos quais células tumorais adquirem resistência a inibidores do proteassomo ainda é um tema em investigação. No entanto, foi verificado que a modulação de algumas vias bioquímicas, superexpressão do alvo (proteassomo) e a seleção de células expressando formas mutantes do

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proteassomo ocorrem e são isoladamente, ou em conjunto, as causas da resistência adquirida (KALE et al., 2012, HUBER et al., 2015)

Em particular, a maioria das mutações envolvidas em resistência a inibidores do proteassomo – principalmente bortezomib – estão localizadas no bolsão S1 (região correspondente aos aminoácidos Thr20, Thr31, Thr35, Arg45, Ala49, Gln53) (KALE e MOORE, 2012) - Tabela 2. O bolsão S1, como mencionado anteriormente, é a principal região do sítio catalítico responsável pelo reconhecimento dos substratos do proteassomo. A Figura 6 traz as estruturas de proteassomo de levedura mutante recentemente reportados na literatura (HUBER et al., 2015). Pode-se observar que as mutações em Ala49 e Met45A (as mais frequentes) restringem o bolsão S1, impedindo o posicionamento da região P1 dos inibidores. O resíduo em P1 de substratos e inibidores da subunidade ChT-L do proteassomo (geralmente uma leucina) mostrou-se fundamental para acomodação apropriada do inibidor no sítio de ligação e direcionamento da ligação peptídica a ser clivada por Thr1 (KALE et al., 2012). Assim, busca-se inibidores da forma resistente do proteassomo, os quais devem ser independentes de acomodação em S1.

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Tabela 2 – Mutações encontradas no proteassomo em células resistentes a bortezomiba ₍a _{abreviaturas: het:} heterozigoto, hom: homozigoto, NR: não reportado, ND: não determinado; b _{Fator de resistência em relação à} linhagem parenteral; c _{seleção com 100 nM, depois 0 nm por 6 meses;} d _{uma mutação silenciosa adicional foi} observada; e _{seleção com 200 nM de bortezomib por 7 meses, depois seleção clonal com 100 nM;} f _{a mutação} R24C no pré-peptídeo também foi observada; g _{após 3 dias sem bortezomib (modificado de KALE et al., 2012).}

Tipo de célula Linhagem

Concentração de bortezomib para seleção Mutação na subunidade β5 Resistência ao Bortezomib Monócito/Macrófago THP1/BTZ30 30 A49T NR THP1/BTZ100 100 A49T (79) THP1/BTZ(-100) 100C _{A49T NR} Leucemia/ linfoma linfoblástico

JurkatB1 >200 A49T (het) ND

JurkatB2 500 A49T (het)d _(2,6-4)

JurkatB3 >200 A49T (het) ND

JurkatB5 500 A49T (het) ND

JurkatB2/1000 >200 A49T (hom) (26,8-54,6)

JurkatB-G322A 500 A49T (22) JurkatB-G322T 1000 A49V (39,4) JurkatB-G322A/C326T 1000 A49T/A50V (66,7) Mieloma múltiplo KMS-11/BTZ 1000 A49T (24,7) OPM-2/BTZ 1000 A49T (16,6) 8226/BTZ7 NR T21A (4,5) 8226/BTZ100 NR A49T (36,5) Leucemia aguda linfoblástica CEM/BTZ7 7 C52F (10,4) CEM/BTZ200 200 A49V/52F (170,4) Macrófago/monócito THP1/BTZ100N 100 M45V NR THP1/BTZ500 500 M45I/A49T NR HT-29 adenocarcinoma BR100 100 e _C63Ff ₍₃₂₎g BR200 200 C63Ff ₍₃₂₎g Câncer de pulmão células não pequenas

H460BTZ80 80 A49T (14) H460BTZ200 200 A49T (22) A549BTZR40 40 M45V (8) A549BTZR100 100 M45V/ A49T (19) SW1573BTZR30 30 C52F (18) SW1573BTZR150 150 C52F (70)

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Figura 6 – Efeitos das mutações Ala49 e Met45 no bolsão S1 do sitio ChTL do proteassomo . Mostrando os

efeitos das mutações no bolsão catalítico dificultando ligação dos inibidores. Na figura à esquerda a superposição da forma selvagem (cinza) e mutante (amarelo) da subunidade β5 na forma apo, à direita temos a superposição das estrutura apo (cinza) e com ligante (amarelo); os carbonos resíduo Thr1 estão em preto e do ligante bortezomib em ciano. I. Mutações do resíduo Ala49 restringem o acesso ao sítio ativo Thr1 da subunidade β5. As superfícies das formas selvagem (yCP) e mutantes (yCPβ5A49/50) estão apresentadas. As mutações estão destacadas em ciano, o sítio ativo Thr1 em preto. Os resíduos Ala49 e Ala50 estão destacados em círculos pontilhados. Figuras extraídas de HUBER et al., 2015.(Retirado de HUBER et al., 2015).

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1.8 Fonte de novos inibidores de proteassomo

Para este projeto, buscamos novos inibidores do proteassomo e proteassomo resistente por meio da triagem de produtos naturais (diversidade química, principalmente em fontes bacterianas e plantas) e caracterização da inibição por cristalografia de proteínas.

Como demonstrado na Tabela 1, muitos inibidores do proteassomo são produtos naturais. Além disto, muitos dos inibidores sintéticos são baseados ou inspirados em produtos naturais. A exemplo, o fármaco carfilzomib foi inspirado em epoxomicina, que é um produto natural isolado de Streptomyces sp. Bactérias, principalmente as não dependentes do proteassomo, vem se mostrando fontes excelentes de novos inibidores do proteassomo (PEREIRA et al., 2012, KELLER et al., 2015 GERWICK e MOORE, 2012; GULDER e MOORE, 2010, KALE et al., 2011).

Vale comentar que a descoberta de compostos naturais impacta não só na descoberta de fármacos, mas também em áreas como química orgânica e biologia celular (WALSH e FISHBACH, 2010). Além disto, os compostos naturais e derivados correspondem a 74% dos antibióticos e 59% dos antineoplásicos (NEWMAN e CRAGG, 2012), permanecendo como uma grande fonte de descoberta de novos fármacos (LI e VEDERAS, 2009), assim como fonte inspiração para fármacos sintéticos (WENDER e MILLER, 2009). O uso de compostos naturais contribui também na elucidação de processos celulares devido à sua alta especificidade e potência (WALSH e FISHBACH, 2010), pois evoluíram para desempenhar ação biológica, geralmente agindo sob macromoléculas, em particular proteínas.

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2 OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi a descoberta de novos inibidores e mecanismos de inibição do complexo proteassomo, em especial aos com possível aplicação ao proteassomo resistente.

Para atingir este grande objetivo, os seguintes objetivos específicos foram delineados: I. Estabelecimento de protocolos de expressão, purificação e cristalização dos

proteassomos 20S de Salinispora tropica selvagem (α/β) e naturalmente resistente à inibidores de proteassomo (α/salI);

II. Estabelecimento de protocolo de purificação e cristalização do proteassomo 20S eucarionte de Saccharomyces cerevisiae para estudos bioquímicos e estruturais; III. Padronização de ensaio em High Throughput Screening para inibidores de

proteassomo frente ao proteassomo 20S humano;

IV. Caracterização bioquímica dos inibidores identificados com os proteassomos humano, de levedura e bacteriano.

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

Os meios de cultura e soluções foram preparados, seguindo protocolos de SAMBROOK e RUSSELL (2001). As cepas de microrganismos e plasmídeos utilizados neste trabalho estão descritos nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. Os plasmídeos com os genes do proteassomo de S. tropica, utilizados neste trabalho foram gentilmente cedidos pelo prof. Bradley S. Moore – UCSD - USA, a cepa de levedura pelo Prof. Dr. Raymond Deshaies da Caltech (Pasadena).

Tabela 3. Cepas de microrganismos utilizadas neste estudo

Cepa Genótipo Fonte

Escherichia coli

DH5α SupE44 ΔlacU169(φ 80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 end A1

gyrA96 thi 1 relA1 HANAHAN, 1983 RosettaT M₂

F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR) Novagen Saccharomyces cerevisiae

Wild type - S. cerevisiae

(Fleischmann®) RJD1144 MAT a his3Δ200 leu2-3,112 lys2-801 trp1Δ63 ura3-52

PRE1FH∷Ylplac211 (URA3)

VERMA et al., 2000

Tabela 4. Plasmídeos utilizados neste estudo

Plasmídeo Características Fonte

pET-Duet-αβ AmpR_{,MCS1: His::α(Strop_2245), MCS2: β(Strop_2244) KALE et al., 2011} pET-Duet-αSalI AmpR_{,MCS1: His::α(Strop_2245), MCS2: SalI(Strop_1015) KALE et al., 2011}

pRARE2

CamR_{, argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT,} tyrU, thrU e argX (AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA e

CGG)

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3.2 Métodos

3.2.1 Preparo de células de E. coli competentes

Foi plaqueada em meio LB/Ágar a cepa de interesse para a obtenção de colônias isoladas. No dia seguinte uma colônia isolada foi inoculada em 5 mL de meio LB, o qual foi incubado overnight a 37°C sob agitação (250 rpm). Após o crescimento do pré inóculo 2 mL deste foram adicionados a um erlenmeyer de 2 L contento 400 mL de meio LB. A cultura cresceu até atingir DO600nm=0,3. A cultura foi então separada em 8 tubos cônicos de 50 mL

previamente refrigerados e incubada em banho de gelo por 15 minutos, sendo centrifugada em seguida a 4000 rpm por 10 minutos a 4°C. O pellet de células foi ressuspenso em 80 mL em solução estéril de cloreto de cálcio (60 mM CaCl2, 15% (v/v) glicerol, 10 mM MOPS pH 7,0).

As células foram novamente centrifugadas e ressuspensas em 80 mL de tampão sendo então incubadas por 1 hora em banho de gelo. Após a incubação as células foram centrifugadas à 5000 rpm por 5 minutos e ressuspensas em 16 mL (2% do volume da cultura inicial) de solução de cloreto de cálcio fria. Foram aliquotados 200 μL de suspensão de células em microtubos tipo Eppendorf de 1,5 mL sendo prontamente congeladas em N2(l) e estocadas em ultrafreezer a

-80°C

3.2.2 Transformação de bacterias E. coli

Seguindo protocolo de SAMBROOK e RUSSELL (2001), alíquotas de 50 μL da cepa de interesse foram homogeneizadas com 1 μL (100 a 200ng) de DNA e incubadas em gelo por 30 minutos. Em seguida sofreram choque térmico por 2 minutos a 42°C. Após o choque térmico, foi adicionado 1 mL de meio SOC e as células foram incubadas por 1h a 37°C. As células foram centrifugadas a 4000 xg por 2 minutos. Em seguida, 800 μL do meio foi retirado e as células foram ressuspensas no líquido residual, sendo em seguida plaqueadas em meio LB/ágar contendo o antibiótico necessário para a seleção dos transformantes.

3.2.3 Expressão e purificação dos proteassomos 20S αβ e αSalI

Bactérias competentes Rosetta 2 foram transformadas com os plasmídeos pET-Duet- αβ ou pET-Duet-αSalI e plaqueadas em meio LB/Ágar contendo ampicilina (100 μg/mL) e cloranfenicol (34 μg/mL). A placa foi incubada por 16h a 37°C. Uma colônia isolada foi inoculada em um pré-inóculo contendo meio LB (Amp/Cam) o qual foi mantido sob agitação a 37°C por 16 a 18h. O pré-inóculo foi diluído 100 vezes em meio ZYP-5052 (STUDIER, 2005). A cultura foi crescida por 20 horas a 28ºC, sob agitação (200rpm), sendo então coletada a 4000 xg por 20 minutos. As células foram então ressuspensas em até 5 mL por grama de célula

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de tampão de lise (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10% Glicerol) gelado. As células ressuspensas foram armazenadas em ultrafreezer (-80°C) até o momento da lise.

Para a lise as células foram descongeladas e tiveram lisozima adicionada para uma concentração final de 1 mg/mL, sendo mantidas sob agitação por 1 hora a 4°C. Após a lise enzimática as células foram sonicadas por 10 ciclos de 9,9s de sonicação seguidos por 9,9s de repouso (Sonicador Sonic VCX-750, probe 630-0208).

Os fragmentos celulares foram centrifugados a 4.500 xg a 4°C por 45 minutos, sendo em seguida a solução filtrada em filtro 0,45μm. O lisado foi então incubado com resina de afinidade Ni-NTA previamente equilibrada em tampão de equilibro (100 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol). A resina foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio, seguida por duas lavagens adicionais contendo 20 e 30 mM de imidazol em tampão de equilíbrio). Após a lavagem a proteína foi eluída em gradiente de imidazol até 500 mM.

O resultado da purificação foi analisado através de SDS-PAGE. As frações mais puras foram concentradas e foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular em coluna HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 em tampão 20 mM MES pH6,5; 150 mM NaCl. Os picos cromatográficos foram analisados por SDS-PAGE e novamente as frações mais puras foram concentradas até 15 a 30 mg/mL para obtenção de cristais.

3.2.4 Purificação dos proteassomo de levedura

Inicialmente, foi previsto seguir a metodologia para purificação do proteassomo de levedura descrito em GROLL e HUBBER, 2005 e GALLASTEGUI e GROLL, 2012. No entanto, foram encontradas dificuldades para purificação do proteassomo seguindo esta metodologia (resultados não mostrados). Assim, novas metodologias foram analisadas e implementadas estando descritas ao longo dos Resultados.

Resumidamente o proteassomo de levedura foi extraído de S. cerevisiae, estas foram adquiridas comercialmente. As células foram lavadas em água Milli Q duas vezes e ressuspensas em tampão 50 mM Tris pH 7.5, em seguida foram congeladas em nitrogênio líquido em gotas e lisadas em moedor de café na presença de nitrogênio líquido para evitar seu descongelamento, sendo então armazenadas em freezer até o momento da purificação. Para a purificação o lisado era descongelado e tinha seu pH ajustado para 7.5 e era adicionado DTT (concentração final 1mM) e Cloreto de Magnésio (concentração final 10mM). O lisado era clarificado e então incubado com a resina DEAE Affi-gel blue gel sendo submetido a uma etapa de cromatografia de troca iônica, em seguida as frações ativas era reunidas e submetidas a uma

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nova etapa de cromatografia de troca iônica utilizando então a colona HitrapQ. Para o refinamento final da proteína, as frações ativas eram então concentradas até 1mL e aplicadas em uma cromatografia de exclusão molecular utilizando a coluna Sephacryl S400.

3.2.5 Thermal Shift Assay (TSA)

A fim de identificar as melhores condições para estabilizar os complexos proteassomo foram realizados ensaios de Thermal Shift Assay (TSA). O TSA consiste na utilização do fluoróforo Sypro Orange® (GE Life Sciences) para avaliar a estabilidade térmica de proteínas. Esta sonda apresenta afinidade às regiões hidrofóbicas de proteínas, ligando-se aos aminoácidos hidrofóbicos, os quais, normalmente encontram-se internalizados nas estruturas proteicas. Contudo, estes resíduos podem ser gradualmente expostos quando as proteínas são submetidas à processos de desnaturação como o aumento gradual de temperatura, ou seja, com o aumento da temperatura, os resíduos hidrofóbicos das proteínas tornam-se expostos, o que permite a consequente ligação de moléculas de Sypro Orange. Quando em ambiente hidrofóbico, esta sonda fluoresce (λexc=470 nm λemis=570 nm). Após o limite de desnaturação as proteínas passam

a se agregar, as moléculas de Sypro Orange se desligam da proteína e o sinal diminui (ERICSSON et al., 2006).

O TSA foi realizado utilizando concentrações de proteína entre 0,1 μM e 0,45 μM e concentrações de Sypro Orange de 1 a 10X (preparadas a partir do estoque comercial a 5.000X). Primeiramente, foi realizado um pré-teste para a determinação das concentrações ideais de Sypro Orange e de proteína para a realização das curvas de TSA, em diferentes condições tamponantes, de sais e outros aditivos.

Para análise da estabilidade térmica da proteína em diferentes condições a solução contendo a proteína foi preparada em placas de 96 poços para PCR (Applied Biosystems), onde cada poço continha uma condição diferente de tampão, sal ou aditivos (DMSO, glicerol, aminoácidos, etc.). A curva de desenovelamento da proteína foi iniciada a 19°C, seguido de exposição a temperaturas crescentes de 19° a 99°C em uma velocidade de aquecimento de 1°C por minuto. As leituras foram realizadas no sistema 7500 Real Time PCR (Applied Biosystems).

3.2.6 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)

Visando o controle de qualidade das amostras proteicas geradas neste trabal ho, foi realizada a caracterização destas por DLS. O DLS consiste na medida da luz espalhada pelas moléculas em uma amostra, em função do tempo. Parte da luz incidente na amostra é espalhada,

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caso a amostra estivesse estática esse espalhamento seria constante. Porém por trabalhar com amostras líquidas, devido ao efeito Browniano, as moléculas da solução estão em movimento e esse espalhamento se torna dinâmico. Ao medir as flutuações do espalhamento, o DLS é capaz de estimar o tamanho médio das partículas, distribuição de tamanho e polidispersividade das partículas em solução. O DLS é capaz de estimar esses valores devido ao fato de partículas maiores apresentarem um movimento mais lento tendo um espalhamento de luz mais constante, ocorrendo o inverso para partículas pequenas (ARZENŠEK et al., 2009).

As leituras foram realizadas no Laboratório de Espectroscopia e Calorimetria (LEC -LNBio), utilizando o equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern). Para análise do proteassomo recombinante, a proteína foi diluída para 2 mg/mL e centrifugada por 10 minutos a 10.000 xg para a remoção de possíveis impurezas (poeiras, agregados). Foram adicionados 20µL da amostra a uma cubeta de quartzo e foi realizada a medida. O equipamento utilizado é capaz de se calibrar automaticamente em função da qualidade e concentração da amostra, alterando assim o número e duração das medidas realizadas. Neste caso foram realizadas 16 leituras de 10 segundos cada, com um atenuador de feixe de valor 11 (potência do feixe de 89%), numa temperatura de 20°C.

3.2.7 Análises bioquímicas

Análises bioquímicas foram realizadas para monitorar a atividade dos complexos 20S purificados e buscar novos inibidores do proteassomo. Para tanto, foi utilizado o substrato suc-LLVY-AMC comercial (Viva Life Sciences, Enzo Life Sciences ou R&D Bioscences).

Este substrato consiste em um peptídeo de 4 aminoácidos (leucina, leucina, valina e tirosina) ligado ao fluóforo 7-amino-4-metilcumarina (AMC) (Figura 8). O proteassomo hidrolisa a ligação entre a tirosina e o AMC, liberando AMC. O AMC livre emite fluorescência quando excitado a 380 nm, com pico de emissão a 460 nm. Para o ensaio HTS foi realizada toda uma etapa de padronização, a qual está descrita ao longo dos resultados

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3.2.8 Cristalização e resolução estrutural

Os proteassomo de bactéria purificados foram submetidos a ensaios de cristalização iniciais no RoboLab LNBio. As concentrações de proteína testadas para estes estudos variara m entre 3 e 30 mg/ml, seguindo a proporção 1:1 proteína:condição de cristalização. As placas foram armazenadas a 18°C.

Para o proteassomo de levedura partiu-se de condições de cristalização descritas anteriormente na literatura (TRIVELLA et al., 2014, GALLASTEGUI e GROLL, 2012).

Os cristais obtidos foram inicialmente testados na linha de difração de proteínas MX-2 (LNLS, CNPEM). Os cristais apresentado boa qualidade de difração foram coletados (difração ocorrendo até cerca de 2.8-3 Å, sendo estes valores usualmente obtidos em synchrotrons de última geração). Os cristais foram montados na linha de difração sob fluxo de nitrogênio, mantendo a temperatura a 100 K. Imagens de difração foram coletadas pelo método de rotação, com oscilação de 0.1-1o_.

Os conjuntos de dados foram processados utilizando o pacote XDS (KABSCH, 2010). Quando apropriado, foi realizada correção por anisotropia, utilizando o servidor

http://services.mbi.ucla.edu/anisoscale/anisoscale_xds/. Em seguida foi realizado ajuste de corpo rígido, utilizando o pacote PHENIX (ADAMS et al., 2002) e a estrutura atômica do proteassomo determinada a 2.5 Å 4TLC (TRIVELLA et al., 2014) como modelo, excluindo os ligantes e moléculas de água. Para tanto, cada uma das 28 subunidades foram tratadas como corpos independentes.

Após inspeção visual e refinamento em espaço real no programa Coot (EMSLEY et al., 2010) a estrutura foi refinada no pacote PHENIX (phenix.refine), realizando-se refinamento com simetria não cristalográfica - utilizando cada par de subunidade como corpos simétricos. Também, para o refinamento utilizou-se TLS, partindo-se de grupos TLS gerados automaticamente no pacote PHENIX e Refmac (WINN et al., 2011). Mapas omit foram gerados no pacote PHENIX (phenix.omit).

Os ligantes foram construídos e minimizados no programa Avogadro. A ligação a Thr1 – quando ligantes covalentes – foi inserida utilizando o programa JLigand. Os arquivos de descrição de topologia (.cif) foram gerados com o programa JLigand. O ligante foi inserido à estrutura utilizando o programa Coot e refinado utilizando o pacote PHENIX e arquivo .cif gerado.

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Complexos proteassomo bacterianos: expressão, purificação, cristalização e estrutura cristalográfica

Visando a obtenção das estruturas dos proteassomos de S. tropica buscamos estabelecer os protocolos de expressão e purificação para então tentar obter cristais difratáveis.

Para a expressão dos complexos 20S partimos do protocolo de expressão descrito na literatura (KALE et al., 2011). Mantivemos o meio de expressão, porém devido ao seu baixo rendimento, substituímos a cepa BL21(DE3) pela cepa Rosetta 2, a qual apresenta expressão aumentada de tRNAs de códons raros (AUA, AGG, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA e CGG). Na Tabela 5 podemos ver que o genoma de S. tropica é rico em códons raros, particularmente os genes codificantes do proteassomo apresentam uma taxa ainda maior destes códons.

Tabela 5. Uso de códos raros em E. coli, S. tropica e em seus genes codificadores do proteassomo 20S. Em

vermelho estão destacados os códons raros que são mais frequentes em relação à frequência normal em E. coli.

Amino ácido

Códon E. coli (‰)* S. Tropica

(‰)** α – número total e (‰) β – número total e (‰) SalI – número total e (‰) Arg AGG 2,1 2,2 0 0 1 (3,55) Arg AGA 3,6 0,8 0 0 0 Ile AUA 6,8 0,7 0 0 2 (7,09) Leu CUA 4,2 3,6 0 0 1(4,16) Pro CCC 5,4 18,1 4 (14,44) 3 (10,60) 7 (24,82) Gly GGA 9,5 7,6 2 (7,07) 2 (7,07) 1 (7,22) Arg CGG 5,9 39,09 12 (43,32) 10 (35,46) 6 (21,35)

Fonte: *(http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/codon_freq_table), **( http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=369723)

Após o estabelecimento do protocolo de expressão aprimoramos também o protocolo de purificação. Inicialmente as células eram purificadas em tampão 0,1M Tris pH 8,0 e 0,5M NaCl. Porém, após uma purificação inicial em tampão Tris realizamos um ensaio de Thermal Shift buscando o agente tamponante ideal para o complexo αβ assim como o melhor pH.

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Foi verificado que o proteassomo apresenta maior estabilidade em pHs próximos da neutralidade, já que pHs abaixo de 5,5 e acima de 7,5 apresentam um efeito desestabilizante ao proteassomo. Dentre os aditivos testados os que apresentaram melhores efeitos foram: glicerol (6%), isopropanol (10%), cloreto de cálcio (0,2M), DMSO (10 e 13%) e MPD (2%). Em contrapartida Zinco (6mM), PEG de baixo peso molecular (16%), arginina (50 e 100mM) e concentrações altas de MPD (superiores a 16%), ureia (1M) e DMSO (20%) mostram-se agentes desestabilizantes de proteassomo αβ de S. tropica.

Dessa forma, nas purificações seguintes substituímos o agente tamponante Tris utilizado na cromatografia de afinidade, pelo HEPES pH 7,5 (Figura 9). Embora pH mais ácidos apresentaram uma melhora na estabilidade da proteína, para a purificação utilizando coluna do tipo Ni-NTA o pH da solução tamponante não pode ser muito ácido, pois isso levaria a protonação das histidinas impedindo a ligação da proteína à resina. Porém, a diminuição do pH também é capaz de reduzir a ligação de proteínas inespecíficas, já que a ligação máxima ocorre em pH 8,0 (BORNHORST e FALKE, 2000). Dessa forma optamos pelo tamponante HEPES pH 7,5 para a etapa de afinidade, já que o tampão MES tem sua faixa de tamponamento até 7,1 e o HEPES apresentou melhor estabilidade que o Tris no TSA.

Figura 9. Cromatografia de afinidade dos complexos αβ e αSalI. A. Purificação do complexo αβ em tampão

Tris. B. Purificaçãodo complexo αβ em tampão HEPES. C. Purificação do complexo αSalI em tampão HEPES.

Pode-se verificar que nas frações de eluição a 250 mM há eluição das subunidades alfa (~27 kDa) e beta/salI (<27 kDa), com um grande excesso de alfas, provavelmente livres.

Desta forma, a cromatografia de exclusão molecular seria essencial para a purificação do complexo 20S puro e adequado para cristalização. A cromatografia de exclusão molecular foi também aprimorada, substituindo a coluna HiLoad 16/60 Superdex 200 pela coluna HiPrep 16/60 Sephacryl S-400. A última apresenta uma capacidade de separação de proteínas de 20 KDa a 8 MDa, enquanto a primeira tem um limite de 10 a 600 KDa, sendo que o complexo 20S apresenta um peso molecular superior a 700 KDa.

α

β α

β

α Sa l I

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Na cromatografia de exclusão molecular pudemos trocar pelo tampão ideal (MES pH 6,5) já que nesta etapa a protonação das histidinas não afetaria a cromatografia, pois a cromatografia de exclusão molecular não é dependente da cauda de histidina (Figuras 10 e 11). Após a cromatografia de exclusão molecular as frações mais puras – contendo o complexo de interesse – foram concentradas até concentrações entre 15 a 30 mg/mL.

Para verificação da homogeneidade das proteínas, realizamos ensaios de Dynamic Light Scattering (DLS), nos quais pudemos verificar que os complexos proteicos estavam monodispersos e com o tamanho esperado (Figura 12).

Figura 10. Cromatografia de exclusão molecular do complexo αβ. A. Em azul, a absorção a 280 nm, em

vermelho, as frações de eluição, em destaque na caixa vermelha a região de eluição do complexo 20S, o segundo pico corresponde às subunidades alfa livres.. B. SDS-PAGE das frações cromatográficas.

Figura 11. Cromatografia de exclusão molecular do complexo αSalI. A. Em azul, a absorbância a 280 nm; em

vermelho, as frações de eluição; em marrom, a condutividade (mS); em destaque na caixa vermelha a região de eluição do complexo 20S, o segundo pico corresponde às subunidades alfa livres. B. SDS-PAGE das frações da cromatografia.